miR-424和miR-503对人直肠癌细胞系增殖的影响

目的探讨miR-424和miR-503对人直肠癌细胞株SW620和SW480细胞增殖的影响,并筛选其靶基因。方法直肠癌细胞株SW620和SW480分为SW480组、SW480-miR-424组、SW480-miR-503组、SW620组、SW620-miR-424组、SW620-miR-503组;SW480组和SW620组细胞正常培养,SW480-miR-424组、SW480-miR-503组、SW620-miR-424组和SW620-miR-503组细胞分别采用慢病毒载体pSLIK-Zeo构建miR-424和miR-503直肠癌细胞系;SW620细胞系各组于不同培养时间进行细胞计数并绘制细胞生长曲线;采用荧光定量PCR法检测SW480组、SW620组细胞中miR-424和miR-503表达水平;采用RNA-seq法筛选miR-424和miR-503的靶基因,并采用Western blot对靶基因进行验证。结果miR-424和miR-503在SW480细胞中呈高表达,在SW620细胞中呈低表达;SW480组miR-424-3p(9.572±2.171)、miR-424-5p(13.891±1.124)和miR-503(6.792±1.412)表达水平高于SW620组(1.026±2.874、1.103±0.411、0.984±0.847),差异有统计学意义(P0.01);各时间点SW620-miR-424组和SW620-miR-503组细胞数量均少于SW620组(P0.01),SW620-miR-503组少于SW620-miR-424组(P0.01);RNA-seq测序分析结果显示,SW620和SW480细胞共有1 413个差异表达基因,其中有50个肿瘤标志物,WEE1蛋白为极高表达者,miR-424和miR-503均可与WEE1的3UTR序列结合,且miR-424的结合能力高于miR-503;SW620组细胞WEE1蛋白表达水平(8.69±3.24)高于SW480组(5.94±2.37)(P0.01),SW480-miR-424组和SW480-miR-503组细胞WEE1蛋白表达水平(2.19±1.72、3.45±2.16)明显低于SW480组(P0.01),SW620-miR-424组和SW620-miR-503组细胞WEE1蛋白表达水平(4.31±2.63、5.37±3.25)明显低于SW620组(P0.01)。结论miR-424和miR-503抑制细胞周期检查点激酶WEE1的表达,进而调节细胞的增殖能力,参与肿瘤发生、发展过程。     

miR-181d在结肠癌中表达失调并抑制癌细胞增殖及凋亡

目的检测结肠癌细胞系中miR-181d的表达水平,研究miR-181d对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响。方法 RTqPCR检测结肠癌细胞HCT116,HT29,LoVo,SW480及SW620和永生化肠黏膜上皮细胞HIEC中miR-181d的表达。在LoVo细胞中转染miR-181d模拟物及对照,SW620细胞中转染miR-181d抑制物及对照,RT-qPCR检测转染效率,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡比例。结果 miR-181d表达水平在各结肠癌细胞系中均较正常肠黏膜上皮细胞HIEC显著降低(F=29.34,P0.01)。在LoVo细胞中过表达miR 181d能够显著减慢细胞体外增殖(F=5.403,P0.01),细胞周期检测示S期细胞比例降低(t=4.71,P0.05),凋亡细胞显著增多(t=3.47,P0.05)。在SW620细胞中抑制miR-181d的表达能够显著加快细胞体外增殖(F=20.82,P0.01),细胞周期检测示细胞周期加速,S期细胞比例增高(t=2.92,P0.05),细胞凋亡率显著减少(t=4.14,P0.05)。结论 miR-181d在结肠癌细胞系中表达普遍下调,有望成为结肠癌新的诊断标志物。miR-181d能够通过抑制结肠癌细胞增殖和促进凋亡,发挥抑癌基因的作用。     

荧光定量PCR法检测多种肿瘤组织和细胞株中nucleostemin基因的表达

目的 建立实时荧光定量PCR技术检测nucleostemin(NS)基因在多种肿瘤组织及细胞株中的表达。 方法 构建NS基因和内参基因β-actin标准品,用RT-PCR和实时荧光定量PCR检测NS基因在胃癌、结肠癌和直肠癌组织以及胃癌细胞株（BGC-823）、肺腺癌细胞株（A549）、肺巨细胞癌细胞株（PLA801-D95）、结肠癌细胞株（SW620）、人白血病细胞株（K562）、前列腺癌细胞株（PC3）的表达。 结果 NS基因在胃癌、结肠癌以及直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P<0.05）,且在BGC-823的表达显著高于其他细胞株（P<0.05）。 结论 NS基因过表达可能在多种肿瘤,尤其在胃肠道肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。     

Bmi-1基因的过表达对人结肠癌细胞株SW480/CD133~+细胞增殖的影响

目的探讨Bmi-1基因过表达对人结肠癌细胞株SW480/CD133~+细胞增殖的影响。方法用携带Bmi-1基因的质粒(pMSCV-Bmi-1)感染人结肠癌SW480/CD133~+细胞,作为观察组(pMSCV-Bmi-1/CD133~+组);以空质粒(pMSCV)感染SW480/CD133+细胞,作为空质粒对照组(pMSCV/CD133~+组);空白对照组不作任何处理,常规培养。用实时荧光PCR和免疫印迹法分别检测细胞中Bmi-1 mRNA水平和蛋白表达的水平;平板克隆实验检测细胞增殖能力的变化。结果观察组Bmi-1 mRNA和蛋白表达的水平均较空质粒对照组和空白对照组显著增高(均P0.01)。观察组、空质粒对照组和空白对照组的细胞克隆形成率分别为(88.45±5.79)%,(52.33±3.62)%和(54.66±4.03)%,观察组分别高于空质粒对照组和空白对照组(均P0.01)。结论成功地将Bmi-1基因导入SW480/CD133~+细胞,并能使其在mRNA水平和蛋白水平稳定、持续地表达。Bmi-1过表达可以显著增强人结直肠癌SW480/CD133~+细胞的克隆形成能力,促进SW480/CD133~+细胞增殖。     

酒石酸锑钾对结肠癌的抑制作用

【目的】观察酒石酸锑钾(PAT)对人结肠癌细胞、结肠癌裸鼠移植模型抑瘤及凋亡诱导作用。【方法】将不同浓度PAT作用于体外培养人结肠癌SW480细胞。采用MTT法检测PAT对结肠癌SW480细胞的生长抑制作用,并计算生长抑制率;60只裸鼠皮下注射结肠癌细胞株SW480建立移植瘤模型,随机分为4组,每组15只。分别在荷瘤鼠腹腔内注射氟尿嘧啶、生理盐水及不同剂量的PAT,给药15d,末次给药24h后计算抑瘤率并观察肿瘤细胞的凋亡。利用TUNEL法进行凋亡检测。免疫组化分析凋亡调控基因Bcl-2的表达。【结果】PAT对结肠癌移植瘤生长有显著性抑制作用,肿瘤细胞凋亡增加;TUNEL法观察到棕褐色着染的凋亡阳性细胞;免疫组化显示PAT作用下Bcl-2基因阳性细胞数降低。【结论】PAT可通过诱导结肠癌SW480细胞的凋亡抑制结肠癌裸鼠皮下移植瘤。     

结肠癌干细胞样细胞的无血清法培养及特性鉴定

目的运用无血清细胞培养法培养出源于结肠癌细胞株SW620的细胞球,并实现其在体外的繁殖及传代,为深入研究结肠癌提供坚实的基础。方法逐步驯化人结肠癌细胞株SW620适应无血清培养条件,1周后,收集悬浮生长的细胞球。采用免疫荧光法检测胚胎干细胞标记物SSEA-4、TRA-1-60在SW620细胞及细胞球的表达情况;采用PI染色法检测2种细胞的细胞周期;采用脂肪诱导分化液对2种细胞进行体外诱导培养;采用裸鼠成瘤实验比较2种细胞的成瘤能力。结果 SW620细胞在无血清培养液中培养1周后,可生出悬浮生长的细胞球。胚胎干细胞标记物SSEA-4、TRA-1-61在所有细胞球细胞中均呈阳性表达;在SW620细胞中的表达率分别为(25.74±7.62)%、(27.74±4.31)%,两者相比,差异具有统计学意义(P0.05)。细胞球细胞有(7.18±1.35)%处于分裂期(S期),(84.19±2.52)%处于分列前期(G0/G1期);SW620细胞有(20.89±3.84)%处于S期,(63.02±6.73)%处于G0/G1期,两者相比差异有统计学意义(P0.05)。脂肪诱导液中培养7d后,油红特异性染色的脂肪颗粒在每100个细胞球细胞中为(583.80±77.69)个;在每100个SW620细胞中为(169.20±26.43)个,两者相比差异有统计学意义(P0.05)。2×104个细胞球细胞即可在裸鼠皮下成瘤,移植瘤体积为(2 279.98±346.27)mm3;2×105个SW620细胞才能形成裸鼠皮下移植瘤,移植瘤体积为(889.75±78.79)mm3,两者相比差异有统计学意义(P0.05)。结论人结肠癌细胞SW620经过无血清驯化,可培养出细胞球,并可进行体外的大量繁殖和稳定传代;细胞球表现出肿瘤干细胞样细胞的特性。     

TAB3过表达促进结肠癌的上皮间质转化和侵袭迁移的研究

目的观察过表达TAB3对结肠癌细胞SW620的上皮间质转化(EMT)和侵袭迁移能力的影响,探究TAB3对NF-κB的影响以及NF-κB在TAB3调控结肠癌EMT和侵袭迁移中的作用,为阐明TAB3在结肠癌发生发展过程中的作用及其分子机制提供理论依据。方法通过qRT-PCR和Western blot检测结肠癌与癌旁组织中TAB3的表达情况。利用结肠癌细胞株SW620构建稳定过表达TAB3的细胞,应用Western blot检测EMT相关分子标记物Vimentin、E-cadherin的表达变化;利用划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力的改变。结果与癌旁组织相比,TAB3在结肠癌组织中呈高表达;过表达TAB3后,结肠癌细胞SW620中Vimentin表达升高,E-cadherin表达下降;划痕实验和Transwell侵袭实验显示过表达TAB3能够上调SW620细胞的侵袭和迁移能力;此外,过表达TAB3使p65表达增加,核内分布增多;NF-κB抑制剂能够减弱过表达TAB3对结肠癌EMT和侵袭迁移的促进作用。结论 TAB3在结肠癌中高表达,其通过NF-κB信号通路调控结肠癌的EMT和侵袭迁移。     

△Np73基因沉默对结肠癌细胞5-氟尿嘧啶化疗敏感性的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)调节导致的△Np73抑制对结肠癌细胞SW620 5-氟尿嘧啶(5-FU)药物敏感性的影响,为结肠癌治疗提供新途径.方法 将△Np73 siRNA转染人SW620结肠癌细胞,观察其对结肠癌细胞△Np73表达的影响.并与5-FU联合使用,四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测细胞活力,流式细胞技术检测细胞凋亡.分别将转染△Np73 siRNA和阴性对照siRNA的SW620细胞注射裸鼠成瘤,瘤中注射5-FU观察体内肿瘤的生长情况.结果 △Np73 siRNA可显著抑制SW620结肠癌细胞△Np73的表达,但本身均不能抑制SW620结肠癌细胞的生长.同时应用△Np73 siRNA和5-FU共同处理的SW620细胞的凋亡率达到42.9%,显著高于单纯5-FU处理组(18.9%)和单纯△Np73处理组(8.8%).在转染△Np73 siRNA的成瘤小鼠的瘤中注射5-FU,能明显抑制癌细胞体外生长(t=15.32,P<0.05).结论 △Np73 siRNA可通过抑制△Np73的表达,从而增强对化疗药物的敏感性.     

microRNA-138通过靶向作用于CCND1抑制结肠癌细胞增殖

目的探讨人结肠癌细胞SW620中细胞周期蛋白1(CCND1)的表达情况及其异常表达对细胞增殖的影响,阐述microRNA-138(miR-138)在SW620增殖中的可能机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)以及Western blot确定结肠癌组织和癌旁组织中CCND1的表达情况;随后采用qT-PCR检测结肠癌组织内miR-138的表达,并通过统计学分析miR-138与CCND1表达的相关性,培养SW620细胞并转染miR-138模拟物(mimics)后验证miR-138与CCND1的相关性,在SW620细胞内进一步转染miR-138模拟物后,Transwell和MTT检测不同处理组中细胞增殖和迁移能力的改变情况;继续转染CCND1 siRNA后,探索miR-138影响细胞生物学过程的可能机制。结果结肠癌组织中,与相应癌旁组织相比,CCND1表达显著升高,miR-138表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);转染miR-138mimics后,与空白对照组(未转染组)相比,细胞迁徙能力下降,同时增殖降低,差异有统计学意义(P<0.05);转染CCND1 siRNA后,与未转染组相比,miR-138表达变化无显著差异(P>0.05),而细胞侵袭能力和增殖能力较未转染组相比显著改变,差异有统计学意义(P<0.05)。结论结肠癌组织中CCND1异常升高可能与miR-138的表达降低有关,且miR-138影响SW620细胞的迁移和增殖能力可能是通过影响CCND1的表达实现的。     

结肠癌淋巴结转移基因谱表达差异分析

目的探讨人结肠癌细胞系SW480、SW620基因谱的表达差异。方法针对NCBI的GEO数据库中编号为GDS756的基因芯片表达数据,用GSEA软件进行基因集富集分析及领头亚群分析,利用FunRich分析软件针对SW480、SW620细胞领头亚群基因进行验证性功能注释,STRING在线分析系统对显著性富集基因集领头亚群基因进行生物网络分析,获得SW480、SW620细胞中心节点基因,并将中心节点基因与高重叠领头亚群基因进行联合分析,以获得参与多功能的中心节点基因。结果GSEA软件分析筛选出SW480细胞显著性富集基因集12个,领头亚群基因491个,高重叠基因7个;SW620细胞显著性富集基因集80个,领头亚群基因870个,高重叠基因6个。对显著性富集基因集领头亚群基因进行生物网络分析筛选出SW480、SW620细胞相关中心基因数目分别为5个及8个;结合GSEA及生物网络分析结果,获得SW620细胞2个参与多功能调控的核心基因TOP2A、CDK1。结论遗传背景相同的结肠癌SW620细胞与SW480细胞具有不同的基因功能分布特点,SW620细胞多功能中心节点基因TOP2A、CDK1与结肠癌发展相关信号通路高度相关。