多重PCR扩增乳腺癌克隆性T细胞TCRβ链全长序列

目的 建立乳腺癌克隆性T细胞TCRβ链全长编码序列(CDS)的多重PCR扩增方法。方法 根据Gen Bank现有TCR序列设计扩增TCRβ链24个亚家族上游引物24条,下游引物2条。对Mg2+、d NTPs和引物浓度比例以及退火温度进行优化,确定最佳反应体系进行TCRβ链多重PCR扩增,构建重组质粒并酶切鉴定。结果 扩增出乳腺癌转移淋巴结中的TCRβ链全长编码序列并成功构建重组质粒,5例患者共获得24个阳性克隆。结论 建立的TCRβ链多重PCR扩增方法具有特异、快速、简便的特点,为研究乳腺癌克隆性T细胞的特点提供了帮助。     

系统性红斑狼疮T细胞受体BV亚家族基因克隆谱型分析

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血中T细胞受体β链可变区(TCRBV)亚家族互补决定区3(CDR3)基因表达谱型及对增殖的T细胞克隆进行序列分析,了解克隆扩增的T细胞与自身免疫病的相关性.方法 应用RT-PCR的方法扩增8例SLE患者外周血的TCRBV 24个家族的基因序列,分析TCRBV CDR3基因表达情况.对增生的T细胞克隆的TCRBV进行序列分析,通过生物信息学分析,了解TCRBV基因与自身免疫病的相关性.结果 8例SLE患者TCRBV CDR3谱型图均出现异常,表现为CDR3多态性降低,BV家族寡克隆增生.在TCR BV13.1基因家族有4例患者均出现寡克隆增生;在BV8、BV9、BV18家族中有3例出现寡克隆增生.未发现SLE的TCRBV的CDR3区有共同的氨基酸基序,但与基因库中的其他自身免疫病的T细胞克隆有较高的一致性.结论 SLE患者T细胞出现寡克隆增生,CDR3多态性降低,可能与自身免疫病发病有关.     

高通量测序分析自身免疫性疾病T细胞受体β链CDR3组库的特征

自身免疫性疾病是机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。导致其发病的基本因素可能是自身免疫耐受的破坏。T细胞在自身免疫病的适应性免疫应答过程中起着至关重要的作用。每一个成熟的T细胞表面表达一种特定的T细胞受体(TCR),互补决定区3(CDR3)最能直接反应TCR多样性。T细胞对众多抗原的识别依赖于CDR3区的多样性,故对TCR CDR3区序列的     

丙型肝炎病毒IRES基因T载体克隆及序列分析

目的构建含丙型肝炎病毒（HCV）核糖体插入位点（IRES）序列的基因克隆,为以后的亚克隆和抑制肝炎病毒作用的研究提供实验材料。方法以含HCV全长基因的质粒为模板,用PCR技术扩增出HCV的IRES序列,将扩增产物IRES基因插入到PMD18T载体后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析。结果经PCR获得355bp含限制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实,克隆片段与GeneBank中该基因的序列同源性为99%。结论该实验成功构建了含HCV IRES基因序列的T载体克隆,提示该克隆是用作亚克隆和抑制肝炎病毒研究的理想克隆。     

IgH/TCR基因重排与EB病毒原位杂交联合分析在淋巴瘤诊断中的应用

目的：探讨免疫球蛋白重链/T细胞受体（IgH/TCR）基因重排检测联合EB病毒（EBV）原位杂交在淋巴瘤诊断中的应用,分析EBV＋-B细胞淋巴瘤的细胞学及基因组学特征、鉴别诊断要点,以缩短诊断时间,减少误诊。方法采用IgH/TCR基因重排与EB原位杂交联合分析诊断EBV＋-B细胞淋巴瘤1例,分析其免疫组化特征、EBV原位杂交、基因重排结果。结果 EBV＋-B细胞淋巴瘤临床上主要表现为淋巴结增大,常伴骨髓和外周血浸润。淋巴结活检显示其结构破坏,淋巴滤泡减少,淋巴结高度增生性病变,可见轻至中度异型淋巴细胞,淋巴窦扩张,组织细胞增生。免疫组化证实EBV感染的细胞毒性B细胞构成病变主体;EBV原位杂交显示部分淋巴细胞核阳性;基因重排提示IgH、免疫球蛋白轻链（Igκ）基因发生克隆性重排,TCRγ无克隆性重排。结论 EBV＋-B细胞淋巴瘤从形态学上难以与伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病等淋巴瘤区分,早期诊断困难。联合应用IgH/TCR基因重排与EBV原位杂交技术对EBV＋-B细胞淋巴瘤的诊断有较高准确性。     

荧光定量PCR检测TRECs的标准品质粒和标准曲线的构建

目的 构建荧光定量PCR检测T细胞受体重排切除环(TRECs)的标准品质粒和标准曲线.方法 对TCRδ基因进行序列分析,设计一对引物和探针.提取正常人外周血单个核细胞中的DNA,经普通PCR扩增,产物纯化后与pUCM-T载体连接并转化入大肠杆菌DH5α,筛选得到重组成功的质粒.结果 重组质粒测序后显示目的片段序列正确,表明TRECs基因片段成功克隆.以103～107 copies/ml不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增后,统计学分析显示标准品浓度的对数与Ct值之间存在良好的线性关系(r=-0.998,P＜0.01).结论 所构建的TRECs标准品特异性和线性关系较好.     

CYP1A1基因cDNA全长的T载体克隆及序列分析

目的构建含KpnI、XhoI双酶切位点的人细胞色素(CYP1A1)基因cDNA全长的pGEM-T载体,为以后的亚克隆和毒理学研究提供实验材料。方法从培养的人乳腺癌细胞(MCF-7)中抽提总RNA,RT-PCR扩增CYP1A1基因cDNA全长,与pGEM-T载体连接后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行测序分析。结果重组质粒pGEM-T-1A1 PCR后获得了1 568 bp产物,酶切鉴定证实目的片段成功插入至pGEM-T,测序分析也进一步证明了目的片段与GeneBank中CYP1A1mRNA的序列同源性为99.9%。结论成功地构建了含CYP1A1基因cDNA全长区域的T载体。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因克隆载体的构建

目的构建丙肝病毒(HCV)核心基因克隆载体PMD18T-HCV/core,为进一步研究将HCV核心蛋白的基因调节功能应用于构建可调控性表达载体治疗病毒性肝炎做好前期基础。方法将含HCV全长基因的pHCV质粒于大肠杆菌DH5α内扩增,提取pHCV质粒,从pHCV质粒中PCR扩增出HCV核心基因片段并将其插入PMD18T克隆载体得到PMD18T-HCV/core克隆载体,将PMD18T-HCV/core克隆载体转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析。结果经PCR获得582bp含限制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆后,PCR、酶切鉴定及序列分析证实,克隆片段与GeneBank中该基因的序列同源性为97%。结论该实验成功构建了含HCV核心蛋白基因序列的T载体克隆,提示该克隆是用作亚克隆和抑制肝炎病毒研究的理想克隆。     

免疫球蛋白重链和T细胞受体(γ)基因重排与慢性粒细胞白血病预后相关性探讨

目的探讨IgH和TCRγ基因重排与慢性粒细胞白血病(CML)预后的相关性。方法采用PCR法对53例不同时期CML患者免疫球蛋白重链(IgH)和T细胞受体(TCR)γ基因重排进行研究。结果检出IgH基因重排阳性27例,TCRγ基因重排阳性3例,其中IgH Fr3A克隆性重排在CML慢性期(42.3％)远较加速期为少(76.6％),二者差异有显著意义(P<0.05)。结论CML各期出现免疫球蛋白重链(IgH)和T细胞受体(TCR)γ基因重排与预后有一定相关性。     

HepG2细胞诱导下TCR Vα基因的选择性表达研究

目的研究HepG2细胞诱导下T细胞受体(TCR)Vα亚家族基因的选择性表达情况。方法将HepG2细胞与健康人外周血单个核细胞(PBMC)混合培养,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等检测混合培养前后TCR Vα各亚家族基因表达变化。结果混合培养不同时间TCR Vα各亚家族基因表达有一定的变化但并未筛选出针对HepG2细胞特异性表达的TCR Vα亚家族,HepG2和PBMC可能在混合培养96h时相互作用最大。结论在HepG2细胞诱导下,TCR Vα各亚家族基因有一定的选择性但没有明显的特异性表达。     

2例1型糖尿病患者外周血TCR Vβ7分子结构模拟与分析

目的模拟和分析2例1型糖尿病(T1D)患者外周血TCR Vβ7的结构。方法以荧光定量PCR熔解曲线分析技术检测T1D患者外周血TCR Vβ7的谱系漂移,利用IMGT数据库和生物信息学软件(CPH Models 2.0 Server和Ras Mol 2 Software)模拟分析其分子结构。结果 2例T1D患者外周血的TCR Vβ7拥有极为相似的氨基酸序列"CASRTAGQYEQYFGPGTR"和"CASRTAGQYEQFFGPGTR",唯一不同的是第十二个氨基酸残基,前者为酪氨酸(Y),后者为苯丙氨酸(F)。分子模拟显示,两者TCR Vβ7基因结构明显不同。结论不同T1D患者来源的TCR Vβ7即使具有相似或相同的氨基酸序列,分子结构未必相同;其可能来自于不同的T细胞克隆。     

T细胞抗原受体跨膜肽可调节T细胞功能和T细胞介导的疾病

T细胞抗原受体是由6个不同基因编码的至少含有7个跨膜肽单元组成的,虽经物种进化和遗传变异,T细胞受体的α链(TCRα)的跨膜肽序列在鼠、羊、牛及人各物种保持惊人的相似,提示它在介导T细胞功能上可能扮演重要角色。作者证明TCRα与CD3δ之间的固定反应集中于前者跨膜肽单元的8个氨基酸序列中,其中的精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)在此反应中处于关键地位。根据小鼠TCRα跨膜肽设计而成的九肽[NH2GlyLeuArgIleLeuLeuLeuLysValOH],称为核心肽(corepeptide,CP),其中两个亲水性的氨基酸,即精氨酸和赖氨酸,被4个疏水性的氨基酸分开。体内…     

T细胞受体多态性与自身免疫病相关研究进展

T细胞受体（T cell receptor,TCR）是T细胞识别抗原和诱导免疫应答的基础。在自身免疫病状态下,T细胞根据疾病特异性抗原可产生相应的特异性TCR库的克隆扩增。通过高通量分子测序技术检测TCR序列,找出疾病状态下和健康人中TCR库的差异,可进一步探索疾病的发病机制,并为进一步通过诱导免疫耐受干预疾病的发生发展提供了可能。此文概述了近5年来TCR测序和自身免疫病之间的原始研究,并对相关研究进展进行了总结。     

hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆及序列分析

目的：构建含限制性内切酶位点PstⅠ、KpnⅠ的hMSH2基因cDNA保守区域的pGEM-T-S载体,比较分析序列的变化,为以后的毒理学研究提供实验材料,方法：从人胚肺成纤维细胞HLF中抽提总RNA进行RT－PCR扩增,直接与T载体连接转化大肠杆蓖DH5α,用蓝／白斑试验筛选阳性克隆,抽提质粒进行酶切鉴定,再行序列分析。结果：经RT－PCR获得631bp含量制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆、酶切鉴定及序列分析后证实,克隆片段与genbank中该基因的序列同源性为99．5％。结论本文成功地构建了含hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆,该克隆可为DNA错配修复缺陷与致癌关系研究提供工具。     

非霍奇金淋巴瘤基因重排的检测及其临床意义

目的 探讨免疫球蛋白重链（IgH）及T细胞受体γ（TCRγ）基因重排在非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin＇s lymphoma,NHL）临床诊断中的应用.方法 用聚合酶链反应（PCR）技术对58例B细胞淋巴瘤（B-NHL）、15例T细胞淋巴瘤（T-NHL）、不能确诊为NHL的标本5例及10例良性淋巴组织增生标本进行IgH及TCRγ基因重排的检测.结果 58例B细胞淋巴瘤标本中有IgH基因重排为47例,有3例TCRγ基因重排.15例T细胞淋巴瘤中TCRγ基因重排为11例,未见有IgH基因重排.5例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排.10例良性淋巴组织反应性增生病例中,IgH及TCRγ基因重排均为阴性.IgH及TCRγ基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间,差异有显著意义（P＜0.05）.结论 用PCR方法检测IgH及TCRγ基因重排对NHL及其疑难病例有重要的诊断价值.     

抑制性消减杂交技术筛选干扰素α转染HepG2细胞中上调的表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术筛选干扰素α(IFN-α) 真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达上调的基因。方法:首先构建IFN-α真核表达载体pcDNA3．1(-) -IFN-α,并转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增鉴定,进行测序及同源性分析。结果:构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α真核表达质粒,并成功构建了该质粒转染HepG2细胞后差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到200个白色克隆,随机挑取70个进行菌落PCR分析,结果显示均含有插入片段,将含有200-1000 bp插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知基因序列和1个染色体序列。结论:应用SSH技术成功构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞中差异上调表达基因的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据。     

hPARP-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆

目的 克隆及构建含限制性内切酶位点BamHⅠ、SacⅠ的人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(hPARP-1)基因cDNA翻译起始区域的pGEM-T-S载体，为以后的亚克隆和毒理学研究提供实验材料。方法 采用RT-PCR方法，用正常人胚肺成纤维细胞(HLF)抽提的总RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增hPARP-1基因片段，并直接与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5α，用蓝(白)斑试验筛选出阳性克隆，抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定，再行序列分析。结果 经RT-PCR获得507bp含限制性内切酶位点的阳性产物，T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实，克隆片段与Genbank中该基因的序列同源性为99．9％。结论 该实验成功地构建了含hPAR-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆，为亚克隆及缺陷细胞株的建立提供工具。     

T细胞在β-内酰胺类抗生素过敏反应中的作用

β-内酰胺类抗生素可诱导体液或特异性T细胞免疫反应的发生.在体液免疫反应中,经常研究的是IgE介导的速发型免疫反应,而T细胞与此类抗体的产生密切相关.T细胞依赖于T细胞受体(TCR)实现对β-内酰胺类半抗原的特异性识别.在外来抗原驱动下,TCR受体谱会出现偏移或基因片段限制性取用现象.由于β-内酰胺类抗生素之间存在交叉过敏反应,而相似的化学结构可能是影响因素之一,TCR识别β-内酰胺类抗生素结构位点的研究还处于初级阶段.     

T细胞受体基因修饰在过继免疫治疗中的应用

T细胞过继性转移可以增强免疫系统介导的对肿瘤细胞的消除,是近年来获得较高关注的一种特异性、无毒性的癌症新疗法,此方法对于治疗血液性和实体恶性肿瘤具有一定效果。对T细胞进行基因修饰能够增强其免疫能力,保持T细胞的持久活性,同时也可以克服肿瘤自身的免疫逃避机制,潜在提高免疫治疗应用于多种肿瘤疾病的成功率。在T细胞过继转移中,T细胞受体(TCR)基因转移作为一种发展迅速的免疫治疗方法,可以在体外产生大量的具有已知抗原特异性和功能亲和性的T细胞,应用于病毒感染或病毒相关恶性肿瘤的过继细胞免疫治疗。TCR基因转移利用逆转录病毒或慢病毒作为载体,其中包含了从所需抗体特异性T细胞群中克隆得到的TCR-α和TCR-β链基因序列,然后应用TCR编码载体转导体外的原始T细胞。为产生带有所需功能特异性的转导T细胞,引入的TCR-α和TCR-β链必须形成异源二聚体,与CD3复合体结合从而在T细胞表面稳定表达。     

良性淋巴组织中Ig/TCR基因重排分析

目的 探讨良性淋巴组织Ig/TCR基因重排特点,为临床病理诊断提供更为可靠的依据.方法 选取淋巴结反应性增生、扁桃腺炎、阑尾炎淋巴组织标本各20例和正常人外周血淋巴细胞标本15例,提取DNA,利用BIOMED-2引物系统进行Ig/TCR PCR扩增和核酸分子异源双链凝胶电泳分析.结果 75例均扩增出与BIOMED-2克...