体外培养人退变髓核细胞的生物学性状

背景：椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础。 目的：观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性。 方法：分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达。ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平。 结果与结论：体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变。对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势。     

骨形态发生蛋白2基因转染软骨细胞注入腰椎间盘损伤模型：10周测量蛋白多糖和胶原含量

背景：研究表明骨形态发生蛋白2基因转染软骨细胞可促进体外培养的髓核细胞合成细胞外基质,但其对体内退变椎间盘组织代谢的影响却罕见报道。 目的：探讨骨形态发生蛋白2基因转染细胞移植治疗椎间盘退变的可行性。 方法：用新西兰大白兔建立腰椎间盘损伤动物模型,建模后随机分为细胞移植组和对照组。细胞移植组注入骨形态发生蛋白2基因转染的软骨细胞,对照组注入等剂量生理盐水,两组动物在注射后2,4,6,8和10周分别取出退变的椎间盘髓核组织,并测量其蛋白多糖及胶原含量。 结果与结论：与对照组比较,细胞移植组髓核蛋白多糖及胶原含量均有明显增高(P < 0.05)。结果提示椎间盘退变的标志之一可能为髓核内细胞外基质含量的减少,而骨形态发生蛋白2基因转染细胞移植的方法可促进细胞外基质合成,改善退变髓核的生物活性,延缓椎间盘的退变。     

多次胶原酶消化法培养小鼠椎间盘髓核细胞

背景：椎间盘为无血运组织,椎间盘髓核细胞为分化终末细胞,细胞增殖能力较差,体外培养难度较大。 目的：探索小鼠椎间盘髓核细胞体外分离培养的方法。 方法：取小鼠椎间盘髓核组织,使用多次胶原酶消化的方法,分离培养髓核组织细胞,接种,传代,取第2代细胞,分别采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测椎间盘髓核细胞特征性分泌物Ⅱ型胶原和聚合蛋白的分泌量及mRNA的表达,并与软骨细胞,成骨细胞及成纤维细胞进行比较。 结果与结论：椎间盘髓核细胞贴壁后呈现软骨细胞的形态;Ⅱ型胶原和聚合蛋白染色均为阳性;Ⅱ型胶原和聚合蛋白mRNA表达与软骨细胞相同,与成纤维细胞和成骨细胞存在明显差别。说明多次胶原酶消化的方法可以获得大量纯净的椎间盘髓核细胞,性状稳定。     

体外培养人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞的生物学性状比较：可以为干预退变髓核细胞提供最佳时机吗？

背景：人体椎间盘是一个承受载荷却又缺乏血管的结构,因而容易发生退行性变,但椎间盘退变的机制尚不明确。 目的：通过体外培养人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞生物学性状比较,认识退变髓核细胞的细胞学退变时机。 方法：分离、培养人正常及退变椎间盘髓核细胞,对两种细胞采用光镜、电镜等形态学方法进行大体形态和超微结构观察,采用生长曲线和XTT实验研究两种细胞的生长动力学差异,测定髓核细胞的活力和细胞Ⅱ型胶原及糖胺多糖的mRNA表达。 结果与结论：退变椎间盘细胞至少要比正常椎间盘细胞提前2代出现形态学老化表现。退变髓核细胞表现为G1期阻滞,使细胞不能进入S期,细胞有丝分裂受到抑制。退变髓核细胞总体来说,生长要比正常髓核细胞快,但老化也较快。退变髓核细胞自第1代开始,Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达比同期正常髓核细胞低得多。说明在体外培养条件下,退变髓核细胞持续增殖能力低,更容易衰老、凋亡。提示退变髓核细胞体外培养衰老较快,进行干预试验逆转椎间盘退变的最佳时机为传2代之前的细胞。     

人骨形态发生蛋白7基因转染对兔髓核细胞增殖和细胞外基质合成的影响

背景: 以往的研究表明人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)能够有效促进细胞外基质合成,修复受损的椎间盘基质,恢复椎间盘高度。因此有希望用于控制和逆转椎间盘退变。然而重组蛋白半衰期短,生物学活性低,退变椎间盘中很难保持骨形态发生蛋白7浓度。基因治疗能够有效预防这些缺陷。 目的：观察人骨形态发生蛋白7基因转染对原代培养的兔髓核细胞生物学活性的影响,为人骨形态发生蛋白7基因治疗椎间盘退变的体内实验研究奠定基础。 设计、时间及地点：随机对照,细胞学体外实验。于2005-12/2006-09在解放军第二军医大学长海医院全军胸心外科研究所实验室完成。 材料： 4周龄新西兰大耳白兔6只,体质量约500 g。Ad-hBMP7由长海医院胸心外科研究所构建。 方法：麻醉后处死白兔,提取髓核,依次经过链霉蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和Ⅱ型DNA酶在37 ℃条件下消化4 h,细胞接种于培养皿内,孵箱内培养,7 d后每周更换培养液2次。将细胞随机分为3组,用整合有人骨形态发生蛋白7基因的腺病毒感染髓核细胞,整合有Lac-Z基因的腺病毒感染的髓核细胞以及未转染的髓核细胞作为对照组。 主要观察指标：以反转录-聚合酶链反应和Western-blot的方法在不同水平检测其表达情况,以四甲基偶氮唑盐的方法观察其对细胞增殖能力的影响,以改进的二甲基亚甲蓝色比色法和ELISA法观测人骨形态发生蛋白7基因转染对细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原能力的影响。 结果：鉴定确定人骨形态发生蛋白7基因为正向插入腺病毒载体,无突变。原代培养的兔髓核细胞形态与文献报道一致。腺病毒载体介导的人骨形态发生蛋白7基因能够高效转染髓核细胞,并表达人骨形态发生蛋白7,同时促进了髓核细胞增殖以及合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原,较对照组有显著性差异(P < 0.05)。 结论：腺病毒介导的人骨形态发生蛋白7基因具有逆转兔椎间盘退变的能力。     

程序性死亡分子5在退变腰椎间盘中的表达**★

背景：细胞凋亡在腰椎间盘退变中起重要作用。程序性死亡分子5是一个促细胞凋亡的蛋白，在骨关节炎的软骨细胞中表达增高，但是至今未见在退变椎间盘中表达的报道。 目的：观察程序性死亡分子5在正常、突出和脱出腰椎间盘髓核细胞中的表达规律，分析其在腰椎间盘退变中的作用。 方法：用SP免疫组织化学方法、免疫荧光方法检测程序性死亡分子5在2例正常、23例突出和17例脱出腰椎间盘髓核细胞中的表达，用脱氧核苷酸转移酶末端标记法和透射电镜检测髓核细胞凋亡情况；用天狼星红染色观察髓核组织细胞外基质Ⅰ，Ⅱ型胶原纤维的变化。 结果与结论：脱出组髓核细胞表达程序性死亡分子5的阳性率高于突出组(P < 0.05)，脱出组髓核细胞脱氧核苷酸转移酶末端标记阳性率高于突出组(P < 0.05)。荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察结果显示程序性死亡分子5表达定位于退变椎间盘的髓核细胞的细胞核；用透射电镜检测到凋亡的髓核细胞；天狼星红染色结果显示，随着年龄增长，髓核中Ⅱ型胶原纤维减少，Ⅰ型胶原纤维增多。结果提示退变椎间盘髓核细胞表达程序性死亡分子5上调，细胞凋亡增加，程序性死亡分子5介导的细胞凋亡在椎间盘退变中起到重要作用。     

细胞移植及髓核组织工程重建修复椎间盘退变

背景：通过细胞组织工程将细胞或细胞支架复合体植入退变缺损的椎间盘内,使退变的椎间盘再生可能是治疗椎间盘退变性疾病最为理想的方法。 目的：评价组织工程髓核体内移植抑制腰椎间盘退变的临床疗效及应用前景。 方法：由第一作者检索1990/2010 PubMed数据、中国知网及万方数据库有关组织工程髓核、组织工程材料及骨髓间充质干细胞治疗腰椎间盘退变方面的文献。 结果与结论：目前常用的细胞支架主要包括胶原支架、琼脂糖支架、藻酸盐支架、聚乙醇酸支架与壳聚糖支架以及复合材料等。通过自体椎间盘细胞或间充质干细胞结合基因技术筛选种子细胞,进行细胞和/或细胞支架复合体移植恢复或再生相关细胞外基质的合成,通过逆转和修复椎间盘细胞病理性改变,为退变的椎间盘组织和功能恢复提供了全新的治疗策略。     

构建兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型

背景：目前尚缺乏诱导骨髓间充质干细胞向髓核细胞转化的体外模型。 目的：建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞分化为类髓核细胞的体外模型,为髓核细胞体内移植培养种子细胞提供实验依据。 设计、时间及地点：对比观察,于2008-08/2009-03在青岛大学医学院附属医院骨科研究所和中心实验室完成。 材料：8周龄新西兰大白兔2只用于兔髓核细胞的分离培养;人椎间盘髓核组织为术中取自16岁先天性脊柱侧弯患者T12L1、L1,2椎间盘髓核组织,患者家属知情同意。人骨髓间充质干细胞株为广州赛业生物科技有限公司产品。 方法：将人骨髓间充质干细胞和兔髓核细胞新式分层共培养(应用去掉挂臂、膜孔为0.4 μm的小室,膜底与贴壁细胞相接触,膜上下两种细胞比例为50%∶50%)7 d,同时设立传统的分层培养(带有挂臂的小室)组、单独人骨髓间充质干细胞培养组和髓核细胞培养组为对照。 主要观察指标：反转录-聚合酶链反应和Western blot检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达。 结果：传统分层培养组及单独人骨髓间充质干细胞培养组不表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。新式分层培养组、单独髓核细胞培养组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达均高于传统分层培养组、单独人骨髓间充质干细胞培养组(P < 0.01)。新式分层培养组与单独髓核细胞培养组比较及传统分层培养组与单独人骨髓间充质干细胞培养组比较,差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：新式分层培养人骨髓间充质干细胞能较高的表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,接近椎间盘未退变人的髓核细胞表达水平,表明成功建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型,为椎间盘退变的细胞治疗奠定了基础。     

Ⅱ型胶原C端肽与椎间盘退变及骨性关节炎的相关性

背景：软骨退变标志物是近年来的研究热点,Ⅱ型胶原C端肽是可以通过无创方法检测软骨退变的较好指标。 目的：观察Ⅱ型胶原C端肽与椎间盘退变及骨性关节炎的相关性。 设计、时间及地点：回顾性分析,于2008-03/06在郑州大学第一附属医院骨科完成。 对象：选择椎间盘退变和骨性关节炎患者各15例分别作为椎间盘退变组和骨性关节炎组,其中椎间盘退变组男7例,女8例,平均年龄(62±7)岁;骨性关节炎组男6例,女9例,平均年龄(61±8)岁;另选未患骨性关节炎及椎间盘退变的非骨科疾病患者15例作为对照组,男8例,女7例,平均年龄(57±6)岁。 方法：3组患者分别取第2次晨尿10 mL,尿样置-20 ℃冰箱保存。尿样收齐后,用人骨退化特异标志物酶联免疫分析试剂盒检测每例标本的Ⅱ型胶原C端肽值,同时检测每例标本的尿肌酐浓度,并对Ⅱ型胶原C端肽值进行校正。 主要观察指标：尿Ⅱ型胶原C端肽在椎间盘退变及骨性关节炎患者中的水平及相关性。 结果：45例患者均进入结果分析。与对照组相比,椎间盘退变组和骨性关节炎组患者尿中Ⅱ型胶原C端肽明显升高,差异有显著性意义(P < 0.05)。椎间盘退变组和骨性关节炎组Ⅱ型胶原C端肽水平相比,差异无显著性意义(P > 0.05)。椎间盘退变组椎间盘退变分级与Ⅱ型胶原C端肽水平呈正相关(r=0.592,P=0.020)。骨性关节炎组膝关节退变分级与Ⅱ型胶原C端肽水平也呈正相关(r=0.719,P=0.003)。 结论：椎间盘退变患者及骨性关节炎患者尿中Ⅱ型胶原C端肽水平均有升高,且Ⅱ型胶原C端肽与椎间盘退变及骨性关节炎具有正相关性。     

椎间注射转化生长因子β1对兔退变腰椎间盘蛋白多糖表达的影响

背景：体外研究证实转化生长因子β1可以促进蛋白多糖合成,延缓椎间盘退变,但体内实验鲜见报道。 目的：观察局部应用转化生长因子β1对兔退变腰椎间盘髓核蛋白多糖表达的影响。 方法：取30只新西兰大白兔建立兔腰椎间盘退变模型,造模12周,经X射线证实退变后,随机选择6只模型兔及6只未造模正常兔,处死取材。分别向剩余24只模型兔L4~5椎间隙注射转化生子因子β1和生理盐水。末次给药2,4周取材,间苯三酚法测定兔椎间盘髓核内蛋白多糖的水平。 结果与结论：造模12周,兔退变椎间盘髓核中蛋白多糖水平明显降低(P < 0.01)。经局部注射转化生子因子β1后,兔退变椎间盘髓核中蛋白多糖表达明显增多(P < 0.01)。说明在兔椎间注射转化生子因子β1 可以促进髓核蛋白多糖的合成,延缓椎间盘退变。     

可注射型纤维蛋白凝胶转化生长因子β1复合骨髓间充质干细胞移植治疗椎间盘退变☆

摘要 背景：纤维蛋白凝胶主体胶与催化剂未混合前为液态,具有可注射的优点,注射混合后凝固成凝胶状,与髓核相似,并且凝固时间可控性强,作为间充质干细胞的载体植入到椎间盘内有诸多优点。 目的：观察可注射型纤维蛋白凝胶转化生长因子β1复合骨髓间充质干细胞移植抑制椎间盘退变的可行性。 方法：将新西兰大白兔随机分为退变模型组、纤维蛋白凝胶组,骨髓干细胞+纤维蛋白凝胶组。3组采用针刺法诱导建立退变模型后,纤维蛋白凝胶组及干细胞+纤维蛋白凝胶组分别移植入纤维蛋白凝胶转化生长因子β1复合物及骨髓间充质干细胞纤维蛋白凝胶转化生长因子β1复合物,于植入后2,6,10周行CR、MRI及病理检查。 结果与结论：退变模型组与纤维蛋白凝胶组椎间隙高度下降明显,并与时间呈正相关,干细胞+纤维蛋白凝胶组下降较缓慢(P < 0.01)。免疫组织化学及组织学检查显示,退变模型组髓核细胞的数量及Ⅱ型胶原含量进行性减少,细胞凋亡率明显增加,纤维蛋白凝胶组与退变模型组相似,干细胞+纤维蛋白凝胶组髓核细胞数量及Ⅱ型胶原含量较退变模型组及纤维蛋白凝胶组明显增多,细胞凋亡率下降。说明骨髓间充质干细胞联合纤维蛋白凝胶转化生长因子β1能很好抑制椎间盘退变,而单纯纤维蛋白凝胶转化生长因子β1移植不能抑制椎间盘退变。 关键词：纤维蛋白凝胶;骨髓间充质干细胞;转化生长因子β1;椎间盘退变;兔 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.024     

新式分层共培养环境下人骨髓间充质干细胞诱导髓核细胞的分化

背景：诱导分化的骨髓间充质干细胞或髓核细胞移植都存在一定的局限性,抑制自体髓核细胞的退行性变有望成为未来治疗椎间盘退变的有效方法。 目的：通过建立骨髓间充质干细胞和髓核细胞分层共培养模型,观察骨髓间充质干细胞对髓核细胞分化的影响。 方法：取传至第4代的骨髓间充质干细胞,分为2组：新式分层培养组将髓核细胞接种于去掉挂臂的Transwell小室,膜孔0.4 μm,其与骨髓间充质干细胞比例为1∶1;传统分层培养组同法将髓核细胞接种于带有挂臂的Transwell小室。同时设立单独髓核细胞培养组,各组均培养7 d。免疫组织化学法检测Ⅱ型胶原的表达,35S放射标记渗入放免定量检测蛋白多糖的合成。 结果与结论：与单独髓核细胞培养组比较,传统分层培养组、新式分层培养组Ⅱ型胶原阳性细胞数、蛋白多糖合成量均明显增加(P < 0.05,P < 0.01),且新式分层培养组增高幅度大于传统分层培养组(P < 0.05)。提示骨髓间充质干细胞与髓核细胞接触共培养后,能显著增加髓核细胞分化增殖和特征性物质的表达,且新式分层培养环境优于传统分层培养。     

人颈椎间盘退变与细胞凋亡及基质金属蛋白酶11的表达**☆

背景：前期研究发现基质金属蛋白酶11基因在人退变颈、腰椎间盘组织中明显上调。 目的：观察人退变颈椎间盘髓核组织中基质金属蛋白酶11的表达与细胞凋亡的关系。 方法：纳入30个经MRI确认的退变颈椎间盘髓核组织和20个因颈椎创伤治疗获得的正常颈椎间盘髓核组织。 结果与结论：苏木精-伊红染色显示退变的颈椎间盘髓核组织中髓核细胞较正常髓核组织明显减少(P < 0.01),而凋亡细胞较正常髓核组织明显增多(P < 0.01)。免疫组化染色显示退变的颈椎间盘髓核组织中基质金属蛋白酶11的表达明显高于正常髓核组织(P < 0.01),且基质金属蛋白酶11表达与TUNEL染色检测到的细胞凋亡正相关(r=0.44,P < 0.05)。说明高表达的基质金属蛋白酶11不仅可直接破坏细胞外基质尚可诱导髓核细胞凋亡,在椎间盘退变的过程中发挥重要作用。     

应用流式细胞术测定CD24表达鉴定人髓核细胞

背景：CD24是成熟髓核细胞表面表达的特异性分子，测定CD24的表达是否可以作为鉴定髓核细胞的一种方法？ 目的：验证流式细胞仪测定髓核细胞CD24表达鉴定髓核细胞的方法。 方法：采用酶消化法分离培养人髓核细胞，取生长旺盛的第2代人髓核细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，RT-PCR测定Ⅱ型胶原及SOX9的表达，流式细胞仪检测其CD24阳性表达率，分析来自同一批细胞的免疫组织化学染色、RT-PCR结果与CD24阳性率的相关性。 结果与结论：体外分离培养的7例第2代髓核细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性，RT-PCR结果阳性，流式细胞仪测定CD24其阳性率均为50%以上，髓核细胞分泌胞外基质Ⅱ型胶原与SOX9的表达与CD24阳性率结果有相关性。提示采用流式细胞仪测定CD24表达可以快速、简便地鉴定髓核细胞。     

胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1对

背景：生长因子可调整椎间盘细胞的增殖、分化及基质代谢,用于椎间盘退变的生物学治疗,既往的研究偏重于成骨性生长因子对髓核细胞的作用,对纤维环细胞的研究相对较少。 目的：观察体外培养条件下胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1对人退变纤维环细胞生物学活性的影响。 设计、时间及地点：对照观察实验,于2007-11/2008-12在解放军南京军区福州总医院完成。 材料：腰椎间盘手术患者的纤维环组织。 方法：结合酶消化法和组织块培养法,体外单层培养人退变纤维环原代细胞。传代后通过免疫组织化学染色鉴定细胞。对传3代细胞分别采用不同生长因子干预,分为 100 μg/L胰岛素样生长因子1组、10 μg/L 血小板源性生长因子组、10 μg/L 转化生长因子β1组、100 μg/L 胰岛素样生长因子 1+ 10 μg/L 血小板源性生长因子组、100 μg/L 胰岛素样生长因子1+ 10 μg/L 转化生长因子β1组、10 μg/L 血小板源性生长因子+10 μg/L 转化生长因子β1组、100 μg/L 胰岛素样生长因子1+10 μg/L血小板源性生长因子+10 μg/L 转化生长因子β1组,以不加生长因子为对照组。 主要观察指标：免疫组织化学染色观察传3代细胞。干预3,6 d后,采用MTT法测定传3代细胞增殖,ELISA法测定细胞培养上清液中Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖质量浓度。 结果：传3代细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性。胰岛素样生长因子1促进人退变纤维环细胞增殖,轻度抑制细胞合成Ⅰ型胶原,促进合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,促Ⅱ型胶原合成作用轻度强于转化生长因子β1。血小板源性生长因子促进细胞增殖,作用强于胰岛素样生长因子1,其抑制细胞合成Ⅰ型胶原,轻度促进合成Ⅱ型胶原,无促合成聚集蛋白聚糖作用。转化生长因子β1抑制细胞增殖,促进合成Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖,促聚集蛋白聚糖合成作用强于胰岛素样生长因子1。多种因子联合作用较单种未见明显优势,未能呈现协同效应。 结论：胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1明显改变人退变纤维环细胞的生物学活性,可应用于对人类椎间盘退变的生物学治疗。     

藻酸盐凝胶支架在生物学修复椎间盘退行性变中的应用

目的：藻酸盐凝胶不仅在体外培养细胞使用，还可应用于体内组织工程修复。实验以藻酸盐凝胶为支架复合骨髓间充质干细胞，观察修复兔腰椎间盘退行性变的能力。 方法：实验于2006-03/2007-03在解放军第二军医大学长海医院骨科实验室完成。①密度梯度分离法分离培养兔骨髓间充质干细胞，配制1.2% 藻酸钠水溶液，进行体外骨髓间充质干细胞/藻酸盐复合物的制备，观察细胞生长。②18只新西兰大白兔手术建立腰椎间盘退行性变模型，随机分为3组：对照组、空白组和治疗组。在手术建立椎间盘退行性变模型结束时，在治疗组椎间隙，注射干细胞复合藻酸盐凝胶支架, 对照组注射骨髓间充质干细胞，空白组不予任何干预。③应用核磁共振观察椎间盘手术前后高度和T2信号变化；术后12周取材大体观察组织结构；免疫组织化学检测Ⅱ型胶原含量，分光光度法测量蛋白多糖的含量，观察椎间盘退行性变修复效果。 结果：18只新西兰大白兔均进入结果分析。①镜下观察支架陷窝内为干细胞，生长良好；将支架行冰冻切片，观察细胞位于网络内，形态良好。②术后12周治疗组MRI测量椎间隙高度和T2信号与术前相比变化最小，与空白组和对照组比较差异有显著性意义（P < 0.05）。③术后12周取材大体观察，空白组和对照组的椎间盘，髓核与纤维环不清，中央区域的髓核为纤维组织所替代。而治疗组的椎间盘轻度退行性变，组织结构尚可分清，周围未发现炎症反应，藻酸盐完全降解。④术后12周治疗组蛋白多糖含量高于空白组和对照组（P < 0.05），Ⅱ型胶原含量低于空白组和对照组（P < 0.05）。 结论：动物实验证实藻酸盐支架复合骨髓间充质干细胞具有修复退行性变椎间盘能力，藻酸盐可以做为修复椎间盘退行性变研究的生物学材料。     

透明质酸钠溶液复合可注射型骨髓间充质干细胞修复退变椎间盘

摘要 背景：透明质酸作为椎间盘组织工程支架的基质材料,可提供蛋白多糖附着点,增加蛋白多糖的沉积,以足够大的孔率允许种子细胞长入。 目的：观察透明质酸钠混合溶液复合骨髓间充质干细胞修复兔退变椎间盘的效果。 方法：以后外侧穿刺抽吸L1/2和L3/4髓核构建日本大耳白兔椎间盘退变模型,造模后2周应用微量注射器向L3/4椎间盘内注射同种异体骨髓间充质干细胞与透明质酸钠混合溶液作为实验组,L1/2椎间盘注射透明质酸钠作为对照组。注射后2,4,8,12 周时行兔椎间盘影像学及病理学检查。 结果与结论：对照组椎间盘高度呈降低趋势,实验组注射后2周椎间盘高度缓慢下降,之后缓慢升高,两组在4个时间点椎间盘高度指数改变差异有显著性意义(P < 0.05)。病理结果显示实验组髓核纤维环形态得到保留,髓核纤维环边界清晰,植入的骨髓间充质干细胞产生增殖分裂,并向周围迁徙规律排列,其病理学评分明显高于对照组。12周内实验组Ⅱ型胶原含量高于对照组(P < 0.05)。说明移植于退变椎间盘内的骨髓间充质干细胞能够存活,且有增殖能力,其与透明质酸钠混合溶液联合移植可以延缓退变椎间盘进一步退变,并促进退变椎间盘修复。 关键词：透明质酸钠;骨髓间充质干细胞;椎间盘退变;细胞移植;髓核抽吸 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.16.004     

大鼠椎间盘纤维环细胞的培养和鉴定

背景：许多学者认为椎间盘退变必有其细胞学改变,而探讨椎间盘退变机制必须有可靠的细胞模型。 目的：尝试建立大鼠椎间盘纤维环细胞体外培养体系,并对其表型进行鉴定。 设计、时间及地点：以细胞为观察对象的随机分组实验,于2005-09/2006-05 在解放军第三军医大学新桥医院实验中心完成。 材料：清洁级1月龄SD大鼠30只,体质量100 g左右,雌雄不拘。 方法：采用酶消化法分离大鼠椎间盘纤维环细胞,进行单层培养。 主要观察指标：观察其形态结构和生物学特性,通过甲苯胺蓝、免疫细胞化学和碱性磷酸酶染色等方法对其细胞表型进行鉴定。 结果：成功进行细胞单层培养,细胞形态为圆形或多角形,胞质含有大量的粗面内质网;原代细胞生长较慢,第2代细胞生长加快;细胞具有甲苯胺蓝异染性;有Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的阳性表达;细胞碱性磷酸酶染色阳性。 结论：采用酶消化法可成功培养大鼠椎间盘纤维环细胞,表型鉴定符合纤维环细胞特征。     

烟酰胺对压力诱发兔腰椎间盘退变的保护作用

背景：最近研究已经证实，烟酰胺能够促进椎间盘细胞的增殖并对椎间盘退变有改善作用。 目的：验证烟酰胺对压力诱发的兔腰椎间盘退变的保护作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2008-11/2009-04 在华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室及骨科实验室完成。 材料：4月龄日本大白兔24只，体质量2.0 kg；烟酰胺为天津市大茂化学试剂厂产品。 方法：取24只日本大白兔随机分入1~6组，采用可控轴向压力，以98 N压力诱发椎间盘 退变建立兔腰椎间盘退变模型，并按分组要求给予兔口服烟酰胺：第1组2只，安装加压装置不予加压或给药；第2组2只，给予50 mg/kg烟酰胺口服1周；第3组5只，以98N压力加压1周；第4组5只，以98 N压力加压1周，去除压力自行恢复1周；第5组5只，加压1周同时给予50 mg/kg烟酰胺口服1周；第6组5只，自加压开始时持续给予 50 mg/kg烟酰胺，加压1周，然后去除压力后恢复1周。 主要观察指标：以Thompson分级法及腰椎间盘磁共振评价退变程度；苏木精-伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及藏红O-快绿染色考察其组织学改变； P16INK4A免疫组织化学染色检测细胞增殖和衰老状态的变化。 结果：①第2组椎间盘未见明显退变；第3组5只动物Thompson分级均为Ⅱ级，第4组4只为Ⅱ级，1只为Ⅲ级，第5组2只为Ⅰ级，3只为Ⅱ级，第6组3只为Ⅰ级，2只为Ⅱ级。MRI也显示，服用烟酰胺的动物椎间盘退变程度有所减轻。②第6组纤维环Ⅱ型胶原含量较第4组高约53.2%(P < 0.01)。③第2组藏红O染色强度较第1组有所上升；第5，6组髓核和纤维环染色强度均高于第4组的相对应部位，其中以第6组髓核上升最为明显(P < 0.01，P < 0.01)，第6组较第5组有轻微上升。④P16INK4A阳性率随烟酰胺给药时间延长而降低。 结论：烟酰胺有助于减轻压力对椎间盘的损伤，能够促进压力损伤后的椎间盘恢复。     

骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养

背景：细胞移植治疗椎间盘退行性变目前尚处在实验室研究阶段。 目的：通过SD大鼠骨髓间充质干细胞与退行性改变的髓核细胞体外共培养,探索骨髓间充质干细胞能否通过直接接触促进髓核细胞外基质的表达以及髓核细胞能否诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化。 方法：取已自然退变的第6代髓核细胞与生长良好的第4代骨髓间充质干细胞按不同比例(75∶25,50∶50和25∶75)体外共培养7 d,单独髓核细胞(100∶0)与单独骨髓间充质干细胞(0∶100)分别作为阳性对照和阴性对照。 结果与结论：RT-PCR检测显示共培养组(75∶25和50∶50)蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白条带均明显亮于单独髓核细胞培养组(100∶0),吸光度值比较差异有显著性意义;免疫组织化学检测显示Ⅱ型胶原蛋白在共培养组(75∶25和50∶50)胞浆内的表达明显高于单独髓核细胞培养组(100∶0)。共培养组中可见骨髓间充质干细胞由长梭形向多角形、类圆形转变,胞浆内异染颗粒增多。提示通过体外直接接触共培养,骨髓间充质干细胞能逆转髓核细胞退变,而且髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转换。