人卵巢癌细胞SKOV3对硼替佐米和紫杉醇联合应用的药物敏感性及可能机制

背景与目的:蛋白酶体抑制剂硼替佐米是新型抗癌药物,体外对多种恶性肿瘤细胞均具有良好的疗效.本实验研究硼替佐米与紫杉醇单独及联合应用对人卵巢癌细胞株SKOV3的存活率和凋亡率的影响,并对糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和髓样白血病-1基因(Mcl-1)在其诱导细胞凋亡中的作用机制进行探讨,为临床治疗卵巢癌提供理论依据.方法:用50 nmol/L硼替佐米、90 nmol/L紫衫醇,或50 nmol/L硼替佐米联合90 nmol/L紫衫醇分别作用于SKOV3细胞12、24、36、48及72 h后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活性,并计算细胞存活率,Annexin-V/PI法流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白质免疫印迹法(Westernblot)检测相关蛋白表达水平.结果:50 nmol/L硼替佐米和90 nmol/L紫衫醇联合作用于SKOV3细胞,12、24、36、48及72 h时间点细胞存活率分别为(65.2±5.8)%,(58.3±14.4)%, (35.3±5.0)%,(19.2±1.5)%和(11.4±2.5)%,与紫杉醇单用组比较,细胞生长抑制增强,差异有显著性(P<0.05).药物单独或联合作用细胞24 h后,紫杉醇单用组、硼替佐米单用组和两者联用组细胞凋亡率分别为(14.7±0.5)%、(15.1±0.8)%和(20.5±0.7)%,硼替佐米与紫杉醇联用组凋亡率显著增高(P<0.05).药物处理细胞后,经免疫印迹法检测p-GSK-3β和Mcl-1蛋白表达水平,硼替佐米与紫杉醇联用组p-GSK-3β和Mcl-1表达水平降低最为明显,分别为正常细胞组表达水平的(19.3±0.4)%和(31.6±3.1)%,差异均有显著性(P<0.05).硼替佐米和紫杉醇单用组中p-GSK-3β表达水平有所降低,分别为正常细胞组的(78.7±1.2)%和(85.1±1.6)%,Mcl-1表达水平分别为对照组的(68.2±4.5)%和(57.0±4.1)%,差异均具显著性(P<0.05).结论:硼替佐米与紫杉醇联用能增强人卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性,并促进GSK-3β磷酸化Mcl-1,使其降解,诱导细胞,GSK-3β/Mcl-1信号通路可能在硼替佐米与紫杉醇联用诱导凋亡中发挥了重要作用.     

紫杉醇对p53缺失型肺癌细胞株H1299的生长抑制作用

背景与目的:评价紫杉醇对p53缺失型肺癌细胞株H1299的生长抑制作用.材料与方法:分别以体外药物敏感试验(Mir法)、流式细胞术观察紫杉醇不同作用浓度、不同作用时间处理H1299细胞后,其生长抑制情况以及细胞周期、细胞凋亡等指标的变化,并以荧光显微镜观察细胞核形态的改变.结果:紫杉醇对H1299细胞毒性呈时间依赖性(P＜0.05);在紫杉醇1 nmol/L以上各浓度组,随着紫杉醇浓度的增加,H1299细胞的存活率降低,与对照组间差异具有统计学意义(P＜0.05);各实验组H1299细胞的生长被阻滞于Gz/M期,在0.1～1 000 nmol/L浓度范围内呈浓度依赖性(P＜0.05),其细胞凋亡比例在0.1～10 nmol/L浓度范围内随浓度的增加而增高(P＜0.05);在时间依赖性试验中,10 nmol/L作用时,G2/M期的阻滞于12 h达高峰;1 000 nmol/L作用时于24 h达高峰,延长1 000 nmol/L作用时间,H1299出现异常多倍体现象;凋亡发生呈时间依赖性,但高浓度诱导的凋亡较低浓度出现的时间晚.紫杉醇诱导的凋亡和G2/M期阻滞无相关性(P＞0.05).荧光显微镜下可见细胞凋亡与细胞死亡共存现象.结论:紫杉醇可以同时诱导H1299细胞凋亡和死亡,对其生长抑制作用呈时间和浓度依赖性.     

甲基莲心碱逆转肝癌HepG2/thermotolerance细胞对阿霉素耐受性的作用

背景与目的:如何成功地逆转耐热癌细胞的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)是当前肿瘤热疗的研究热点.本研究探讨耐热肝癌细胞能否对阿霉素(adriamycin,ADR)产生耐受性,以及甲基莲心碱(neferine,Nef)能否逆转耐热肝癌细胞的阿霉素耐药性.方法:MTT法检测肿瘤细胞存活率,PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡率,间接免疫荧光流式细胞术检测bcl-2表达.结果:在43℃环境中培养24 h后,耐热肝癌细胞HepG2/thermotolerance的细胞存活率和细胞凋亡率分别为(89.6±5.4)%和(13.6±5.4)%,而非耐热肝癌细胞HepG2的细胞存活率和细胞凋亡率分别为(23.9±3.6)%和(68.9±7.3)%.正常培养环境情况下(37℃),ADR对HepG2/thermotolerance细胞的IC50为(113.7±12.7)μmol/L,而对HepG2细胞的IC50为(10.5±2.3)μmol/L,耐药倍数达10.8倍.1、10、100 μmol/L ADR分别作用24 h后,HepG2/thermotolerance细胞的凋亡率分别为(9.3±2.6)%、(17.8±7.3)%和(32.9±8.6)%,而HepG2细胞的凋亡率分别为(14.3±3.9)%、(38.9±6.8)%和(62.7±5.9)%.在37℃培养环境下,10、40 μmol/L Nef对HepG2细胞和HepG2/thermotolerance细胞无增殖抑制作用和凋亡诱导作用,但可使ADR对HepG2/thermotolerance细胞的IC50分别下降至(63.7±5.6)μmol/L和(16.8±2.8)μmol/L,逆转倍数分别为1.78和6.79,并可使10 μmol/L ADR对HepG2/thermotolerance细胞凋亡的诱导作用升高至(26.8±5.9)%和(34.9±8.7)%;HepG2/thermotolerance细胞较HepG2细胞高表达Bcl-2蛋白,而Nef能下调HepG2/thermotolerance细胞的Bcl-2表达.结论:HepG2/thermotolerance细胞对ADR可产生耐受性,Nef可逆转HepG2/thermotolerance细胞对ADR的耐受性,其机制可能与其下调HepG2/thermotolerance细胞Bcl-2蛋白表达有关.     

丁酸钠对大肠癌HCT-116细胞增殖及自噬影响研究

目的 研究丁酸钠(sodium butyrate,NaB)对大肠癌HCT-16细胞增殖和自噬的影响.方法 不同浓度(0.1、0.5、1、2和5 mmol/L) NaB处理大肠癌HCT-116细胞,MTT法检测细胞的存活率;蛋白质印迹法检测自噬特异性蛋白LC3B表达量的变化;单丹磺酰尸胺(MDC)和吖啶橙(AO)染色检测酸性自噬泡的形成.结果 单因素方差分析结果显示,不同浓度(0.1、0.5、1、2和5mmol/L)NaB处理组与对照组细胞的存活率相比,差异有统计学意义,F=24.076,P＜0.001;0.5 mmol/L浓度的NaB作用24 h即能显著抑制大肠癌HCT-116细胞的增殖,细胞存活率为(94.00±4.09)％,P＜0.05;1、2、5 mmol/L浓度的NaB作用大肠癌HCT-116细胞24 h,细胞存活率分别为(89.43±1.83)％、(84.56±4.77)％和(81.00±7.38)％,与对照组比较,P值均＜0.01.2 mmol/L NaB处理24后,HCT-116细胞内酸性囊泡细胞器明显蓄积;不同浓度NaB处理HCT-116细胞24 h后,LC3B-Ⅱ蛋白的表达量随着NaB浓度增加而增加;2 mmol/LNaB处理HCT-116不同时间(10 min、30 min、1h、2h、4h、6h、12h和24 h)后,LC3B-Ⅱ蛋白的表达量随着NaB作用时间的延长而增加.结论 NaB可抑制大肠癌HCT-116细胞增殖并诱导其发生自噬.     

凋亡显像剂99m Tc-HYNIC-annexin V对肿模型化疗疗效早期评价的可行性

目的 评价凋亡显像剂99mTc-HYNIC-annexin V在肿瘤动物模型中对化疗疗效早期评估的可行性.方法 人膜联蛋白V(annexin V)通过双功能螯合剂联肼尼克酰胺(HYNIC)进行99mTc标记.在正常昆明小鼠右上肢接种Ehrlich腹水癌细胞,至肿瘤生长至1 cm后,随机分为生理盐水处理组和环磷酰胺处理组(150 mg/kg),并分别于处理后1 h和24 h时注射99mTc-HYNIC-annexin V.注射后30、60、180、360 min进行双探头单光子发射计算机断层仪(SPECT)显像.图像分析采用感兴趣区(ROI)技术,计算右上肢肿瘤部位与右下肢计数比值(肿瘤/下肢).采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测肿瘤组织凋亡细胞.结果 在不同处理时间,生理盐水处理组的肿瘤部位仅有少量显像剂分布.环磷酰胺处理组在处理1 h后,肿瘤部位显像剂分布少量增加;24 h后,肿瘤部位显像剂分布明显增加,显影清晰.环磷酰胺处理24 h组的肿瘤/下肢比值(6.27±0.24)明显高于生理盐水24 h处理组(2.36±0.18)和环磷酰胺1 h处理组(4.00±0.38).环磷酰胺处理24 h后,TUNEL染色可见大量癌细胞凋亡.结论 99mTc-HYNIC-annexin V是一种可以早期监测化疗药物治疗效果的核素凋亡显像剂,在化疗药物应用24 h后就可以进行有效探测,并在注射显像剂后60 win即可获得清晰的图像.     

FG020326通过增加泰素帝介导caspase-8和3激活的敏感性克服多药耐药细胞MCF-7/ADR的凋亡抗性

背景与目的:多药耐药(multidrug resistance,MDR)的主要特征是具有药泵功能的P-gp的高表达,近来研究发现P-gp还抑制caspase依赖方式凋亡,使MDR细胞免于多种形式的caspase依赖性凋亡.本研究拟探讨新型化合物FG020326对耐药细胞MCF-7/ADR的细胞毒作用,克服MCF-7/ADR对泰素帝的凋亡抵抗作用及机制.方法:MTT法测定FG020326体外逆转活性,Hoechst33258染色后荧光显微镜观察凋亡细胞形态,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡通路PARP、caspase-3、caspase-8的表达,并用比色法测定caspase-8和3的活性.结果:10μmol/LFG020326作用下MCF-7/ADR细胞对泰素帝耐药性逆转了24倍.10μmol/LFG020326作用下,0.1 μmol/L泰素帝可诱导MCF-7/ADR细胞染色质凝集,凋亡小体产生以及出现亚凋亡峰.10 μmol/L FG020326作用48 h,泰素帝介导的caspase激活敏感性增加,0.1μmol/L泰素帝诱导下出现caspase-8和caspase-3,PARP裂解.与0.1 μmol/L泰素帝单独作用相比,10μmol/L FG020326作用下,泰素帝介导的caspase-8和caspase-3活性显著提高,并呈时间依赖性,48 h活性最高.结论:新型化合物FG020326可显著逆转MCF-7/ADR对泰素帝的抗药性,通过增加泰素帝介导的caspase-8和caspase-3的激活敏感性克服MDR细胞MCF-7/ADR的凋亡抗性.     

阿霉素对结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤SNK-6细胞株肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体耐受及其受体表达的影响

目的 探讨阿霉素对结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤SNK-6细胞株肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)耐受及其受体表达的影响.方法 以不同浓度的阿霉素单独或与TRAIL联合作用于SNK-6细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的生长情况.采用流式细胞术检测SNK-6细胞的凋亡情况和TRAIL受体的表达情况.结果 100和1000 ng/ml阿霉素单独处理SNK-6细胞24h时,SNK-6细胞的存活率分别为(80.9±7.2)％和(53.7±2.8)％,与联合TRAIL组的差异有统计学意义[分别为(64.9±1.1)％和(34.0±3.9)％,P＜0.05].100和1000 ng/ml阿霉素单独处理SNK-6细胞48 h时,SNK-6细胞的存活率分别为(69.9±6.1)％和(31.1±1.9)％,与联合TRAIL组的差异亦有统计学意义[分别为(37.5±6.4)％和(15.0±1.8)％,P＜0.05].经100和1000 ng/ml阿霉素单独处理48 h后,SNK-6细胞的早期凋亡率分别为(14.8±0.6)％和(30.8±1.5)％,与联合TRAIL组的差异有统计学意义[分别为(28.7±0.6)％和(46.6±2.8)％,P＜0.05].经100 ng/ml阿霉素处理24h后,SHK-6细胞表面TRAIL死亡受体和欺骗受体的表达明显增加.结论 阿霉素在一定程度上可以克服SNK6细胞对TRAIL的耐受,但需要较大剂量的TRAIL才能起作用,这可能与阿霉素同时诱导了TRAIL死亡受体和欺骗受体表达上调有关.     

Fu/LV方案术前化疗对大肠癌细胞凋亡、增殖的影响

目的 探讨大肠癌进行Fu/LV方案术前化疗后,其癌细胞增殖、凋亡方面发生的改变,为大肠癌的术前化疗提供理论依据.方法 本文将34例大肠癌患者随机分为术前Fu/LV方案化疗组和未化疗对照组,而后应用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡;免疫组化法测定肿瘤增殖及Fas/FasL表达的改变情况.结果 术前化疗组原位凋亡指数、增殖指数和Fas表达率平均值分别为11.83±4.76%,37.67±8.44%,3.25±1.87%,与对照组相比,统计学差别有显著意义(P《0.05).结论 Fu/LV方案术前化疗可抑制大肠癌细抱增殖及诱导癌细胞调亡,其抗肿瘤作用与Fas介导的细胞凋亡信号转导通路有关.     

表皮生长因子受体单克隆抗体C225对肺鳞癌细胞系放射增敏作用研究

目的 观察表皮生长因子受体单克隆抗体C225与60Co γ线对人肺鳞癌细胞系(H-520)的杀伤作用,探讨C225联合照射治疗非小细胞肺癌的可行性.方法 细胞成克隆实验中单纯照射(对照组)和照射+100 nmol/L C225组(实验组)给予0、1…2 4 6、8、10 Gy照射,培养10 d后计数≥50个细胞克隆.采用多靶单击模型进行数据处理,拟合细胞存活曲线,计算增敏比(D.值比).细胞凋亡实验均照射0、2、4、8 Gy后继续培养72 h,收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡.细胞周期检测设对照组(不处理)、C225组(100 nmol/L)、照射组(8 Gy照射)和C225联合照射组(100 nmol/LC225+8 Gy),照后48 h收集细胞,流式细胞仪检测周期分布.结果 细胞克隆存活实验结果表明,扣除C225毒性影响后实验组存活分数比对照组低(F=6.36,P＜0.05),增敏比为1. 35.细胞凋亡实验结果显示,C225组4个剂量点凋亡百分率分别为13.75%±0.83%、25.12%±1.60%、46.12%.4-2.60%、50.51%±4.06%,对照组的分别为5.56%±0.62%、13.86%±0.80%、25.36%±1.02%、29.89%±2.09%(F=4.72,P＜0.05).细胞周期分布显示100 nmo//L C225可使细胞阻滞于G0+G1期,单纯照射阻滞于G2+M期,两者联合后同时出现G0+G1、G2+M期阻滞,三者均使S期细胞比例下降.结论 C225对H-520细胞具有放射增敏作用,其机制可能与细胞G0+G1期阻滞和诱发凋亡有关;结果 为临床上二者联合治疗非小细胞肺癌提供了理论基础.     

三七皂苷R1通过线粒体相关通路促进白血病细胞株HL-60凋亡

目的:观察三七皂苷(notoginsenoside) R1对白血病细胞株HL-60凋亡的影响,探讨其可能的作用机制.方法:采用MTT法和流式细胞术(Annexin V-FITC双染法)分别检测三七皂苷R1(10、20、40及80 μmol/L)处理HL-60细胞12、24、36及48 h后HL-60细胞的凋亡情况,Western blotting检测HL-60细胞内Bcl-2、Bax及细胞色素C(cytochrome-C,Cyt C)蛋白的表达水平,JC-1染色法观察HL-60线粒体膜电位的变化.结果:MTT和流式细胞术检测显示三七皂苷R1浓度依赖性诱导HL-60细胞的凋亡,且细胞存活率随处理时间的增加而降低;与空白对照组相比,加入三七皂苷R1后细胞中Bcl-2蛋白表达显著减少[(0.45 ±0.03) vs (1.00 ±0.00),P＜0.05]、Bax蛋白表达显著增加[(1.72 ±0.08) vs (1.00±0.00),P＜0.05];Bcl-2/Bax比值减小[(0.21±0.01) vs (1.00±0.00),P＜0.05];线粒体膜电位降低[(0.56±0.09) vs (1.00±0.00),P＜0.05];胞质(cyto)中Cyt-C蛋白表达水平显著下降[(0.42±0.03) vs (1.00±0.00),P＜0.05].结论:三七皂苷R1可显著诱导HL-60细胞凋亡,其作用机制可能是通过线粒体通路促进细胞的凋亡;本实验可为三七皂苷R1用于临床治疗白血病提供实验依据.