PLAGL2与SP-C基因启动子相互作用的研究

目的研究PLAGL2(pleiomorphic adenoma gene like-2,PLAGL2)对SP-C基因(surfactant pro-tein-C,SP-C)启动子的结合与影响作用。方法定点诱变技术(site-directed mutagenesis)及凝胶电泳迁移实验(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)研究PLAGL2与SP-C基因启动子之间的相互结合作用;体外培养MLE12细胞共转染和荧光素酶报告基因活性值检测技术,研究PLAGL2对SP-C基因启动子表达活性的影响;结果EMSA及竞争性EMSA实验表明:PLAGL2能通过其核心和簇结合位点序列与同位素标记的SP-C基因启动子片段相结合形成蛋白-DNA复合物;细胞共转染及荧光素酶报告基因活性值检测结果显示:PLAGL2能明显促进SP-C基因启动子的表达。结论在肺Ⅱ型细胞中,PLAGL2能与SP-C基因启动子相互作用并促进其表达。     

PLAGL2对SP—C基因表达调控的作用靶点研究

目的 研究PLAGL2对SP—c基因表达调控的作用靶点。方法 定点诱变技术分别突变掉SP—C基因启动子上PLAGL2的结合位点以及PLAGL2的第6、7位锌指结构域序列并获得相应的突变体；凝胶电泳迁移实验研究PLAGL2及其突变体分别与SP—C基因启动子及其突变体之间的相互结合作用。结果 PLAGL2能与同位素标记的SP—C基因启动子片段相结合形成蛋白-DNA复合物，而两者的突变体却不能与相应的蛋白或DNA片段发生相互作用。结论 PLAGL2通过其第6、7位锌指结构与SP—C基因启动子上PLAGL2的核心和簇结合位点序列相互结合从而实现对SP—C基因的表达调控。     

Wilson病ATP7B基因启动子区突变对基因表达的影响

目的 探讨Wilson病ATP7B基因启动子区突变与Wilson发病的关系。方法 在48例患者中发现2例存在-183（C→T）突变，对发现存在突变的样本的DNA片段进行分离，克隆入pGL2荧光素酶报告基因，转染细胞，测定荧光素酶的活性，以野生型的ATP7B基因启动子作为对照，分析ATP7B基因启动子点突变对转录活性的影响。结果 含正常与含突变ATP7B启动子区序列的pGL2载体的荧光素酶转录活性相比较差异无统计学意义（n=3，P〉0．05）。结论 启动子区-183（C→T）突变不影响基因转录活性。提示该突变的意义有待进一步的探讨。     

MicroRNA143调节结肠癌细胞KRAS蛋白的表达

目的：探讨结肠癌细胞中microRNA143（miR-143）对KRAS蛋白表达的影响及其作用机制。方法: 从基因组DNA中克隆pri-miR-143基因，构建miR-143的表达载体。miR-143转染结肠癌细胞系SW480，用Northern blotting方法测定miR-143水平的变化，通过RT-PCR和Western blotting方法检测转染细胞中KRAS基因的表达。构建含miR-143结合位点的荧光素酶报告载体，与miR-143表达载体共转染，检测细胞中的荧光素酶活性。结果: 基因转染的SW480细胞中miR-143的表达显著升高， KRAS蛋白的表达水平下降约40%，KRAS mRNA则未受影响。miR-143表达载体与含miR-143结合位点的报告载体共转染可以抑制细胞中的荧光素酶活性。结论: 结肠癌细胞中microRNA143在转录后水平抑制KRAS蛋白的表达。     

Cyclin H基因启动子区-1 SNP对转录活性的影响

目的　探讨CCNH基因启动子区- 1SNP位点碱基变异对CCNH基因转录活性的影响。方法 通过PCR和定点突变技术,构建了含CCNH基因基础启动子及- 1G突变启动子,用双荧光素酶报告系统观察此SNP对CCNH基因启动子转录活性的影响。结果　在AD293细胞中, -1G突变启动子活性比CCNH基础启动子活性低26%（P<0.05）。结论 -1T→G碱基变异可显著降低CCNH基因启动子转录活性。     

人ADAM17启动子荧光素酶报告质粒的构建与鉴定

目的构建人去整合素-金属蛋白酶17(ADAM17)启动子的荧光素酶报告质粒,对不同位点进行定点突变,分析其转录活性。方法通过生物信息学分析ADAM17启动子区域的叉头转录因子M1(FoxM1)结合位点,以人胃癌细胞系MGC-803基因组为模板,PCR扩增ADAM17基因启动子-1 365～+51片段,连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中;对FoxM1结合的3个位点进行定点突变;转染至293T细胞后用双荧光素酶报告系统分析其转录活性。结果测序结果显示,ADAM17启动子荧光素酶报告基因及其突变体均构建成功;与pGL3-basic组相比,pGL3-ADAM17(-1 365～+51)组介导的荧光素酶活性明显升高(P0.05);与对照组相比,过表达FoxM1组介导的荧光素酶活性明显升高(P0.05),且pGL3-ADAM17(-1 365～+51)组高于突变组(P0.05)。结论成功构建了人ADAM17启动子荧光素酶报告基因及其突变体,初步验证了ADAM17受转录因子FoxM1的转录调控。     

热休克因子1对FasL的调控作用

目的研究人热休克因子l（HSFl）对Fas配体（FasL）启动子转录活性的影响。方法用在线启动子分析软件分析FasL启动子区转录因子结合位点;凝胶阻滞实验（EMSA）研究内源性HSFl与FasL启动子区的热休克元件（HSE）结合能力;将组成型活化的HSFl突变体与FasL启动子表达载体FasL—luc共同转染HeLa细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统,检测荧光索酶活性。结果在FasL启动子区发现HSE核心序列（nGAAnnTYCn）,HSFl可以与该HSE体外结合;荧光素酶活性测定发现HSFl明显上调FasL—luc转录活性,突变该HSE,则转录激活作用消失。结论HSFl对FasL具有转录调控作用。     

c-Jun对硫氧还蛋白还原酶1启动子转录的调控作用

目的: 探讨转录因子激活剂蛋白-1(activator protein-1,AP-1)家族成员c-Jun对硫氧还蛋白还原酶1(thioredoxin reductase 1, TrxR1 )启动子转录的调控作用。方法: 利用生物信息学技术分析调控 TrxR1 启动子区域的转录因子,构建 TrxR1 启动子区域一系列截短的萤光素酶报告基因载体,将含c-Jun的真核表达载体pcDNA3.1(+)-c-Jun和含有 TrxR1 启动子的萤光素酶报告基因载体共转染人胚肾HEK293细胞和鼠心肌H9c2细胞,检测转染细胞中萤光素酶活性。应用定点突变技术针对 TrxR1 启动子区域AP-1的可能结合位点进行突变,与c-Jun的真核表达载体共转染上述2种细胞,检测各组萤光素酶活性。利用染色质免疫共沉淀(ChIP),分析c-Jun与 TrxR1 启动子区域的AP-1结合位点结合情况。结果: 酶切及测序结果表明,获得的3个不同长度的 TrxR1 启动子克隆与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,且插入方向正确;此3种质粒都有明显的启动子活性,在人胚肾HEK293和鼠心肌H9c2细胞中转染pcDNA 3. 1(+)-c-Jun可以上调 TrxR1 启动子活性。突变AP-1结合位点,导致 TrxR1 启动子活性明显降低;ChIP结果显示c-Jun结合在 TrxR1 启动子区域的AP-1结合位点上。结论: 转录因子AP-1家族成员c-Jun可能通过与 TrxR1 基因启动子区域AP-1结合位点相结合,上调 TrxR1 基因的转录。     

P53对涎腺腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用

目的为了探讨P53基因对腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用及机制。方法构建携带人野生型P53基因的腺病毒表达载体，以脂质体法瞬时转染腺样囊性癌SACC-83细胞，RT-PCR检测转染细胞P53基因mRNA的表达，TRAP-PCR-ELISA法检测转染细胞端粒酶活性的改变。并将P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2—630共转染SACC-83细胞，测定转染细胞荧光素酶报告基因活性。结果1．瞬时转染含人野生型P53基因的重组腺病毒表达载体p△E1-P53于腺样囊性癌SACC-83细胞后，其P53基因mRNA的表达明显增强；2．基因转染后，SACC-83细胞内源性端粒酶活性显著降低。3．P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2-630共转染SACC-83细胞后，其荧光素酶活性显著下降。结论外源性表达P53基因可以降低腺样囊性癌细胞SACC-83细胞端粒酶活性，并可能通过抑制端粒酶hTERT基因启动子的转录活性实现。     

人乳头瘤病毒2（HPV2）E2蛋白不同功能区突变对转录抑制作用影响的研究

目的 研究HPV2变异株上E2蛋白不同功能区域的点突变对其转录作用的影响.方法 根据HPV2突变株E2上的突变点设计引物,采用延伸法构建不同的E2突变体,并插入到真核表达质粒pcDNA3.1中.表达不同突变体E2的pcDNA3.1-E2与带有HPV原毒株LCR的CAT报道基因载体进行共转染Hela细胞.通过检测CAT的表达量对不同E2突变体的转录抑制作用进行评估.结果 与全长的原毒株E2相比较,去除N端及C端功能区的E2蛋白均降低了E2蛋白对启动子活性的抑制作用.位于E2蛋白转录激活区（nt 3037）,铰链区（nt 3387）及DNA结合区（nt 3697）的点突变明显影响了其转录抑制功能.结论 HPV2 E2蛋白的转录调节功能与其转录激活区以及DNA结合区密切相关.HPV2突变株上的不同的E2的单个突变点能够明显降低E2蛋白对启动子活性的抑制作用.     

PPAR—γ和COX-2用于预测重度子痫前期合并胎儿生长受限的研究

目的研究过氧化物酶体增殖物激活型受体-1（peroxisomeproliferatoractivatedreceptor-γ,PPAR-1）和环氧化酶-2（Cyclooxγgenase-2,COX-2）在重度子痫前期及重度子痫前期合并胎儿生长受限（FGR）发病中的作用,以探讨重度子痫前期合并FGR的发病机制,为其早期诊断、早期治疗及病情预测提供新的理论和实验依据。方法收集重度子痫前期合并FGR患者30例（SPF组）,单纯重度子痫前期患者30例（sP组）,随机选取同期住院的正常晚期妊娠孕妇30例（NP组）,采用酶联免疫吸附法（ELISA）方法检测这三组孕妇母血血浆和脐血血浆中COX-2的表达。采用免疫组化技术检测胎盘组织中PPAR—γ蛋白的表达。结果SPF组、sP组、NP组脐血血清COX-2水平分别为（55．30±8．10）,（39．25±7．90）,（10．60±5．50）mg／mL,三组差异显著（P〈0．05）;SPF组、SP组、NP组孕妇血清COX-2水平分别为（35．25±6．58）,（26．13±6．10）,（7．20±5．36）mg／mL,三组亦有显著差异（P〈0．05）;SPF组孕妇血清与脐血血清中COX-2水平呈正相关（r=0．526,P〈0．01）;SPF组、sP组、NP组胎盘组织中PPAR-1的阳性表达率分别为87．5％、53．1％、29．6％,三组差异显著（P〈0．05）。结论1．COX-2的升高在重度子痫前期和重度子痫前期合并FGR的预测中起着重要作用,COX-2明显升高可预测在重度子痫前期的发病基础上出现FGR;2．出现重度子痫前期合并FGR的胎盘组织PPAR-1蛋白呈强阳性表达;3．通过测定孕母血清COX-2水平能预测胎儿血清COX-2水平。     

GATA-4在HCY诱导鼠胚心脏畸形中的表达及意义

目的探讨锌指转录因子GATA-4在同型半胱氨酸（Homocysteine,HCY）诱导的大鼠胚胎发育畸形心脏的表达水平及相关意义。方法SD成年健康清洁级雌、雄大鼠各16只,常规方法交配获取孕鼠后,随机分为2组：1正常对照组,2HCY组。各组孕鼠分别于妊娠第13、15、17、19天剖腹取出胚胎,通过切片进行胎鼠心脏组织学观察以确定心脏畸形情况,并通过RT-PCR法半定量测定胎心GATA-4因子mRNA表达。结果HCY组不良胚胎率及胚胎心脏畸形率与对照组相比均显著增高（P〈0.001）;HCY组各妊娠天数胎鼠心脏GATA-4因子mRNA表达均较对照组减少,但无统计学意义（P〉0.05）;而心脏发育畸形胎鼠的心脏GATA-4因子mRNA表达比心脏发育正常胎鼠明显降低（P〈0.001）。结论HCY诱导的孕鼠不良胚胎率及胚胎心脏畸形率均明显增高,且胎鼠畸形心脏组织中GATA-4表达下调,表明锌指转录因子GATA-4的心脏表达抑制与HCY对大鼠胚胎心脏的毒性作用之间存在重要关系。     

MTHFR基因C677T多态性与神经管缺损的相关性研究

目的探讨5,10-甲基四氢叶酸还原酶（5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR）基因C677T突变与神经管缺损（neuraltube defectes,NTD）发病的相关性。方法应用PCR—RFLP法,对67名正常儿童和48例NTD患儿（NTD组）（其中无脑儿16例,脊柱裂32例）进行MTHFR基因C677T突变分析。结果NTD组胎儿MTHFR基因TT基因型频率（68．7％）和T等位基因频率（0．820）均显著高正常对照组儿童（31．3％和0．54）（x^2=15．71,P〈0．01和x^2=17．18,P〈0．01）。与MTHFR基因CC基因型相比,携带TT基因型的胎儿发生NTD的相对风险增加6．28倍（95％CI：2．01～19．62）。结论MTHFR基因C677T多态性与潍坊地区人胎儿NTD发病有关联。     

人PLAGL2基因表达载体质4粒的构建

目的克隆人PLAGL2基因片段并插入（TetO）7-CMV表达载体。方法采用PCR技术扩增出人PLAGL2基因的两个DNA片段，经酶连后获得约2kb的目的DNA片段并插入（TetO）7-CMV载体中，PCR筛选阳性转化株并分析重组质粒的DNA序列。结果DNA测序结果显示重组质粒（TetO）7-CMV-PLAGL2序列正确。结论扩增并连接了人PLAGL2基因的两个DNA片段，最终成功构建了人PLAGL2基因的表达载体质粒-（TetO）7-CMV-PLAGL2。     

子宫内膜样腺癌中Maspin、VEGF—C的表达与肌层浸润程度的临床研究

目的检测maspin和VEGF—C在子宫内膜样腺癌中的表达及与肌层浸润程度的意义。方法采用免疫组化法检测49例子宫内膜样腺癌及15例正常子宫内膜中maspin、VEGF—C的表达及与肌层浸润程度的意义。结果（1）Maspin在子宫内膜样腺癌中表达阳性,肌层浸润深maspin阳性表达率增高,差异无统计学意义（P〉0．05）。（2）VEGF—C在子宫内膜样腺癌中表达阳性,肌层浸润深度〉1／2组阳性率（75．0％）高于肌层浸润深度≤1／2组（36．4％）,差异具有统计学意义（P〈0．05）。（3）子宫内膜样腺癌中maspin和VEGF—C呈正相关关系（P〈0．05）。结论maspin和VEGF—C表达上调可能共同促进了子宫内膜样腺癌的发生、发展、侵袭及转移,二者联合检测可能对临床诊疗、判断预后有指导意义。     

TGFβ1与EGFR在子宫内膜异位症中的表达及意义

目的检测转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）以及表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）在子宫内膜异位症中的表达,探讨两者在子宫内膜异位症发生发展中的作用。方法采用免疫组织化学方法检测子宫内膜异位症患者在位内膜（10例）、异位内膜（10例）、正常子宫内膜（10例）中TGF-β1和EGFR的表达情况。结果TGF-β1在子宫内膜异位症异位内膜组中的表达显著高于子宫内膜异位症在位内膜组及对照组（P〈0.05）,TGF-β1在子宫内膜异位症在位内膜组及对照组中的表达无显著性差异（P〉0.05）;EGRF在子宫内膜异位症异位内膜组及在位内膜组中的表达显著低于对照组（P〈0.05）,EGFR在子宫内膜异位症异位内膜组及在位内膜组中的表达无显著性差异（P〉0.05）。结论TGF-β1及EGFR的异常表达可能与子宫内膜异位症的发生发展有关。     

儿童哮喘血清中SP-A、SP-D、IL-8、IgE的水平变化及临床意义

目的探讨哮喘患儿血清中肺表面活性蛋白A、D(SP-A,SP-D)、白介素8(IL-8)、免疫球蛋白E(IgE)含量的变化及其分析研究。方法测定30例儿童哮喘急性发作期和缓解期的SP-A、SP-D、IL-8、IgE及同期健康儿童30例。结果急性发作期的SP-A、SP-D水平均显著低于对照组(P<0.01),IL-8、IgE水平均显著高于对照组(P<0.01);缓解期的SP-A、SP-D水平明显高于发作期(P<0.05),IL-8水平明显低于发作期(P<0.05),IgE水平与发作期相比差异无显著性(P>0.05)。结论儿童哮喘的发作虽然是多种病因引起,IL-8、IgE等在其中的病理生理、免疫病理改变有重要作用。证明SP-A、SP-D含量及功能改变与哮喘的发病、发展关系密切。     

宫腔镜结合C—erbB-2、nm23及ER表达对子宫内膜癌早期诊断意义

目的 探讨宫腔镜结合C—erbB-2、nm23及ER表达在子宫内膜癌中的诊断意义。方法 宫腔镜检查2400例患者，对筛查出的35例子宫内膜癌、10例内膜不典型增生及10例正常内膜，用免疫组化SP法检测C—erbB-2、nm23和ER表达。结果C—erbB-2、nm23、ER阳性表达率依次为74．29％、51．43％、54．29％；50％、30％、60％；30％、10％、90％。三者nm23、ER阳性表达率明显升高，差异有显著性（P〈0．05）；C—erbB-2阳性表达率明显降低，差异有显著性（P〈0．05）。宫腔镜定位活检确诊子宫内膜癌35例（35／2400），占1．46％。结论 宫腔镜直观病灶，结合c—erbB-2、nm23及ER表达对内膜癌早期诊断有意义。