电离辐射对小鼠胸腺Th17细胞相关细胞因子的影响

目的 通过研究电离辐射对小鼠胸腺Th17细胞相关细胞因子的影响,探讨高、低剂量辐射诱导不同的免疫效应中Th17细胞功能。方法 将健康ICR小鼠按随机数字表法分为健康对照组、低剂量照射组(0.05、0.075 Gy)和高剂量照射组(0.5、1.0、2.0、4.0 Gy)探讨剂量-效应关系,用X射线深部治疗机进行不同剂量的全身照射,于照射后24 h处死。同时,探讨时间-效应关系,即分为健康对照组、低剂量照射组(0.075 Gy)和高剂量照射组(2.0 Gy),于照射后12、24、48 h处死,取胸腺组织制备成组织匀浆,ELISA法检测小鼠胸腺细胞中白介素-17a(IL-17a)与白介素-21(IL-21)的浓度。结果 在时间-效应结果中,与健康对照组相比,0.075 Gy照射组胸腺细胞IL-17a和IL-21分泌量呈下降趋势,其分泌量于48 h降到最低(t=3.85、4.73,P<0.05);而2.0 Gy照射组均呈大幅度上升趋势,其分泌量在48 h达到最高(t=-6.74、-6.19,P<0.05);在剂量-效应结果中,与健康对照组相比,较低剂量照射组胸腺细胞IL-17a与IL-21分泌量下降,在0.05 Gy最低(t=8.39、16.45,P<0.05);较高剂量照射组胸腺细胞的分泌量上升,在4.0 Gy时升至最高(t=-15.60、-18.62,P<0.05)。结论 高剂量辐射可以诱导小鼠胸腺细胞IL-17a与IL-21分泌量的增加,而低剂量辐射使其下降,表明Th17细胞相关的细胞因子在低剂量辐射诱导的免疫功能增强效应和高剂量辐射诱导免疫抑制效应中起着重要的作用。     

低剂量辐射适应性反应对辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤的影响

目的 探讨低剂量辐射对致癌剂量辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤的影响及其免疫学机理。方法 采用4次1.75GyX射线全身照射C57BL/6J小鼠诱发胸腺淋巴瘤模型, 观察不同剂量照后6个月小鼠胸腺淋巴瘤发生率, 照后1个月脾脏NK细胞毒活性、IL-2和γIFN分泌活性、腹腔巨噬细胞吞噬功能及其TNFα分泌活性以及胸腺细胞分化的变化。结果 每次1.75Gy照射前6h或12h接受25mGy或75mGy全身照射均可降低胸腺淋巴瘤发生率, 且预先接受75mGy全身照射的作用效果更为明显; 每次1.75Gy照射前12h接受75mGy照射小鼠, 上述免疫指标均比单纯1.75Gy照射组增强, 且多数指标接近假照射组; 其胸腺CD4^-CD8^-和CD4^-CD8⁺细胞较单纯1.75Gy照射组减少、CD4⁺CD8⁺细胞增多。结论 低剂量辐射可诱导辐射诱发胸腺淋巴瘤适应性反应, 对致癌剂量辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤有抑制作用, 其抑制作用的免疫学机理可能与低剂量辐射的免疫增强效应及诱导的免疫学适应性反应, 减轻致癌剂量辐射对机体免疫功能的损伤, 使胸腺淋巴瘤前体细胞在形成胸腺淋巴瘤之前被免疫系统清除有关。     

γ线照射小鼠胸腺组织基因表达转录谱分析

目的 探讨6 Gy γ线照射后不同时间小鼠胸腺组织基因表达转录谱的动态变化。方法 应用快速高通量的cDNA基因芯片技术进行研究。结果 1随照射后时间推移,差异表达基因数目和种类逐渐减少,如照射后1、6、14和28 d差异基因数量分别为878、318、162和25;2辐射所诱导的胸腺组织差异表达基因广泛涉及细胞周期、免疫和应激、细胞凋亡、细胞信号转导、转录调节、DNA合成修复和重组、细胞骨架、离子通道和运输、代谢、蛋白翻译和合成、发育、细胞分化多个方面;3照射后对某些重要差异表达基因的分析表明,与细胞周期相关的基因有5个(上调3个:Cyclin G、Anxa1、Fgf1,下调2个:Cdc2a、Cdc25b);与免疫应激相关的5个(上调4个:IL-18、Casp1、IL-15、IL-7,下调1个:Cd28);与细胞凋亡相关的7个(上调4个:Casp1、Anxa1、Perp、IL-7,下调3个:Pten、Api5、Fas)。结论 6 Gy γ线照射后,小鼠胸腺组织差异表达基因随照射后时间延长不仅涉及多个靶点、多个层次,显示出多样性变化的特点,而且显示出时间上的明显差异;从基因水平上揭示了中等剂量照射小鼠胸腺组织损伤修复和重建基因的变化规律,为辐射免疫损伤与修复的分子机制和防治措施的研究提供了新的启示。     

低剂量辐射增强小鼠肿瘤基因-放射治疗效应的免疫学机制研究

目的 探讨低剂量辐射全身照射对小鼠Lewis肺癌移植肿瘤基因-放疗方案中的免疫增强作用机制。方法 小鼠右后肢皮下接种Lewis肺癌细胞建立荷瘤模型,基因-放疗组中小鼠肿瘤局部注射由多聚乙烯亚胺包裹的pEgr-IL18-B7.1重组质粒,分别接受由2 Gy 局部照射和0.075 Gy 全身照射组合的不同治疗方案,通过³H-TdR标记方法检测小鼠CTL和NK细胞毒活性,ELISA方法检测TNF-α和IFN-γ分泌活性,观察各治疗组对荷瘤小鼠抗肿瘤免疫的作用。结果 在pEgr-IL18-B7.1基因治疗方案中,单次大剂量辐射局部照射后加多次低剂量全身照射与常规多次大剂量辐射局部照射相比,小鼠CTL和NK细胞毒活性显著增强,TNF-α和IFN-γ分泌活性有不同程度的增高。 结论 低剂量辐射可以通过促进CTL和NK细胞毒效应,上调TNF-α和IFN-γ细胞因子表达,从而增强机体抗肿瘤免疫功能,提高肿瘤基因-放疗的抑瘤效果。     

2 Gy γ射线照射对小鼠调节性T细胞和Th17细胞及其免疫平衡的影响

目的 观察2 Gy γ射线照射对小鼠Treg/Th17免疫平衡的影响。方法 50只C57BL/6雄性小鼠随机数字表法分为对照组和照射组,照射组小鼠接受2 Gy γ射线一次性全身照射(剂量率为164.94 Gy/min),对照组行假照射。于照射后1、3、7、14和28 d检测外周血象的变化;流式细胞仪分析外周血、胸腺及脾脏调节性T细胞(Treg细胞)和脾脏Th17细胞数量的改变。结果 受照后小鼠外周血白细胞总数和淋巴细胞数降低(t=8.89～33.54, P<0.05)。小鼠外周血Treg略有升高;胸腺Treg在照后1、3 d显著高于对照组(t=-6.45和-10.59, P<0.05),至28 d明显低于对照组(t=5.34, P<0.05);脾脏Treg在照后1～14 d显著高于对照组(t=-6.82～-3.89, P<0.05)。脾脏Th17细胞于照后1 d出现显著增高,3 d达到最大值(t=-2.42, P<0.05),较脾脏内Treg增长更为明显。Treg/Th17比值在照后1～14 d降低,差异有统计学意义(t=4.02～8.04, P<0.05),导致Treg/Th17平衡模式向Th17方向明显偏移。结论 Treg/Th17免疫平衡失调在辐射所致免疫功能损伤中可能扮演重要角色。     

维生素D对不同剂量X射线照射小鼠免疫功能的保护作用

目的 观察维生素D对不同剂量X射线照射小鼠免疫功能的影响。方法 将小鼠采用随机数字表法分为5组:健康对照组、2 Gy和5 Gy照射组、2 Gy+药物(维生素D)组和5 Gy+药物(维生素D)组。给药组小鼠在不同剂量X射线照射后,连续7 d腹腔注射6 IU维生素D[1,25(OH)₂D₃]/g体重,于给药后第8天,5组小鼠均处死。测定小鼠体重、胸腺和脾脏指数,ConA诱导的脾脏T淋巴细胞增殖能力,ELISA法检测脾细胞IL-2的分泌量。结果 与健康对照组相比,2和5 Gy照射组小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力、脾细胞IL-2的分泌量均显著降低(F=36.20、7.13,P<0.05);与2 Gy照射组相比,2 Gy+药物组小鼠胸腺指数、脾脏指数、脾脏T淋巴细胞增殖能力均显著增高(t=-2.54、-2.24、-2.84,P<0.05);与5 Gy照射组相比,5 Gy+药物组小鼠的胸腺指数、脾细胞IL-2的分泌量显著增高(t=-5.02、-2.64,P<0.05)。结论 维生素D能够改善受照小鼠的免疫功能,但随照射剂量增大,改善作用减弱。     

X射线全身照射诱导小鼠胸腺Egr-1和Egr-4基因表达水平的实时定量RT-PCR分析

目的 应用实时定量RT-PCR技术检测X射线全身照射诱导小鼠胸腺Egr-1和Egr-4基因的表达变化。方法 小鼠接受X射线全身照射后4和24 h,提取胸腺mRNA,以GAPDH作为内参基因,利用实时定量RT-PCR检测方法,探讨Egr-1和Egr-4基因的相对表达量与不同照射剂量之间的关系。同时计数骨髓嗜多染红细胞微核率作为辐射生物剂量参照。结果 Egr-1和Egr-4基因表达量在0.5～6 Gy全身照射后4和24 h均与照射剂量之间存在显著的相关性(r =0.974,0.987,0.978,0.999, P＜0.01),其剂量效应曲线可拟合成线性平方方程。各剂量点Egr-1和Egr-4基因表达量与骨髓嗜多染红细胞微核率高度相关(r =0.866、0.947、0.983、0.835, P＜0.05)。进一步分析表明,照射后4 h Egr-4基因表达不仅剂量效应关系良好,且增幅最为明显,并与骨髓嗜多染红细胞微核率的剂量效应曲线相平行。结论 实时定量RT-PCR技术检测Egr-4基因的早期表达有可能成为建立大批量、快速辐射生物剂量估算方法的候选者。     

低剂量预照射对小鼠放射性肺损伤的预防作用及其可能的机制

目的 评估低剂量辐射预照射对放射性肺损伤的预防作用及其可能机制。方法 320只6周龄雌性C57BL/6j小鼠用随机数表法将其分为对照组(0 Gy)、低剂量组(0.5 Gy)、高剂量组(20 Gy)和低剂量预照射组(0.5 Gy+20 Gy),每组80只。将低剂量组和低剂量预照射组的小鼠于充分清醒的状态下放入固定装置中进行0.5 Gy低剂量X射线全身照射。2周后将高剂量组和低剂量预照射组的小鼠进行麻醉,行20 Gy的高剂量X射线胸部照射。而对照组小鼠行模拟照射(0 Gy)。所有小鼠在完成照射计划后按照设计的时间点(24 h、1个月、3个月和5个月)进行处理,每个时间点处理小鼠20只/组。取小鼠肺组织标本,采用苏木精-伊红染色法(HE染色)和Masson三色染色法观察病理变化;RT-qPCR和Western blot检测肺纤维化相关因子mRNA和蛋白的表达。结果 单次高剂量20 Gy照射后1个月的肺组织发生病理改变,主要表现为放射性肺炎和少量胶原蛋白堆积,随着照射后时间的递增,病理改变越为严重;而低剂量预照射组在各个时间点的肺组织病理学改变均较高剂量组的轻。同时,除照射后3个月和5个月组的proSP-C蛋白外,低剂量预照射组的proSP-C和HOPX的mRNA和蛋白水不同程度地高于高剂量组。更为显著变化的是,高剂量组TGF-β1的mRNA 水平在照射后5个月时是其他组的5.8~13.6倍。 在照射后5个月,高剂量组β-catenin的mRNA和蛋白水平均远高于低剂量预照射组 (t=4.22、5.11,P<0.05)。同时,在照射后24 h和1个月的低剂量预照射组vimentin蛋白水平显著高于高剂量组(t=6.54、4.28,P<0.05)。结论 生物组织接受0.5 Gy低剂量电离辐射预照射可诱导正常组织产生适应性保护反应,进而对后续的治疗剂量的辐射产生耐受作用。     

电离辐射对小鼠脾细胞中调节性T细胞及其相关分子表达的影响

目的 观察不同剂量X射线照射后不同时间小鼠脾细胞中调节性T细胞和叉头状转录因子(Foxp3)的表达变化,探讨X射线对调节性T细胞以及相关因子Foxp3的影响。方法 112只雄性ICR小鼠,随机平均分为低剂量(0.075 Gy)组和高剂量(2 Gy)组,用X射线深部治疗机分别进行0.075和2 Gy全身照射,于照射后0、4、8、16、24、48和72 h处死,取脾脏,分别应用流式细胞术和RT-PCR法检测调节性T细胞和Foxp3的表达水平。结果 0.075和2 GyX射线全身照射后,小鼠脾细胞CD4+CD25+Treg 细胞百分比均在照射后8 h达高峰,随后一直保持较高水平,高于照射前水平(2 Gy,在8、16、48、72h时,t=4.65、4.28、3.71、2.88,P<0.05; 0.075 Gy,在8、16、24、72h时,t=8.73、10.55、4.21、4.65,P<0.05)。Foxp3在mRNA水平,0.075 Gy照射后变化不明显,而2 Gy照射后于24 h形成峰值。Foxp3在蛋白质水平,0.075 Gy照射后并未有显著变化;而2 Gy照射后于16 h形成峰值,随后略有下降,但仍保持较高水平。结论 调节性T细胞及相关分子Foxp3的不同变化可能成为高、低剂量X射线诱导不同免疫效应的原因之一。     

γ射线照射对IER5基因mRNA表达的影响

目的 应用实时PCR技术分析⁶⁰Co γ射线照射正常人淋巴母细胞(AHH1)、宫颈癌细胞(HeLa)与接种人肿瘤细胞的裸鼠后IER5基因表达的影响。方法 对于离体培养的AHH1 、HeLa与BALB/c-nu裸鼠,按照不同剂量(0.5、2、4、6、10、15 Gy)与照射后不同时间点(2、4、8、12、24 h)进行分组进行提取mRNA、反转录与IER5基因表达量测试。结果 在相同条件下AHH1对照射比HeLa更灵敏,其表达量的峰值对应的剂量比HeLa的要低。对于AHH1细胞,对2 Gy低剂量的照射反应比10 Gy的高剂量反应要快,而HeLa细胞,对于2 Gy的低剂量与10 Gy的高剂量的照射反应没有太大差异,在照射后2 h都出现基因表达的最大值。此外,人肝肿瘤的IER5基因对照射比较敏感,而人肺与脑肿瘤的IER5基因不敏感。结论 IER5基因有可能成为宫颈癌与肝肿瘤新的辐射损伤生物分子的一个标记物,对肝肿瘤放疗具有潜在的应用价值。     

放射性肺损伤小鼠晚期转录水平特征性基因标志物的研究

目的 研究不同剂量X射线照射小鼠肺部后的差异基因并进行转录水平分析,探讨小鼠放射性肺损伤（RILI）潜在的基因标志物。 方法 8周龄C57BL6雌性小鼠96只,X射线单次照射分为3组（12只/组）:对照组（未接受照射）、中等剂量组（MD组,10 Gy单次照射）、高剂量组（HD组,20 Gy单次照射）,余60只分为5组进行X射线全肺野梯度剂量照射。采用全基因组表达芯片对小鼠肺组织进行RNA检测并生成基因表达矩阵,使用R语言软件包进行基因表达数据转换,对特征性基因标志物表达水平进行验证与数学建模,对HD组小鼠基因表达水平进行基因本体论生物学功能基因集富集分析。采用经典贝叶斯检验方法进行组间基因表达差异的比较,采用线性回归模型分析2组独立数据的关联程度（关联系数为R2）。 结果 MD组和HD组小鼠照射后肺组织转录组学分析,共筛选出RILI差异表达基因539个,其中差异最显著的5个基因为Phlda3、Fgg、Kng1（上调基因）和Ptprb、Kit（下调基因）。梯度剂量X射线分次照射实验结果证实,3个上调基因均随X线剂量的增加而表达增强;2个下调基因则随剂量的上升而表达降低。上调基因的逻辑回归模型拟合程度较高（χ2=11.66, R2=0.88）;下调基因的表达值与剂量具有良好的相关性（R=?0.95,R2=0.89）。基因集富集分析结果显示,上调基因富集于p53信号通路、固有免疫反应等生物学过程,下调基因富集于细胞代谢、肺部发育等生物学过程。 结论 上调基因Phlda3、Fgg、Kng1与下调基因Ptprb、Kit可作为客观反应RILI严重程度的潜在基因标志物,为日后开展临床与辐射防护相关应用奠定前临床基础。     

还原型谷胱甘肽对小鼠放射性肺损伤的影响

目的 研究还原型谷胱甘肽(GSH)对放射性肺损伤(RILI)小鼠的作用及其损伤机制。方法 100只BALB/c小鼠随机数字表法分为健康对照组、15 Gy组、30 Gy组、15 Gy+GSH组和30 Gy+GSH组,每组20只。GSH组小鼠腹腔注射0.2 ml 240 mg/ml GSH,单纯照射组腹腔注射等体积的生理盐水作对照,建立15和30 Gy X射线的RILI模型。于照射前、照射后1、2、3周收集血样,采用ELISA法检测MMP-9、TIMP-1、IL-4和IL-6的表达量,HE染色观察病理情况,并分析小鼠的体重和免疫系统变化。结果 照射后,小鼠的脾脏指数先急速下降,下降速度随照射剂量增加而降低(F=29.84,P<0.05);1周后随照射剂增加而慢慢上升(F=13.91、4.61,P<0.05)。血清MMP-9与IL-6表达随照射剂量增加而升高(F=81.27、10.86,P<0.05),TIMP-1和IL-4相反。随照射后时间延长,MMP-9表达量先上升后下降(F=52.22,P<0.05),TIMP-1和IL-4先下降后上升(F=138.96、8.48,P<0.05),IL-6表达始终上升。结论 GSH具有抗放射性肺损伤作用,尤其在低剂量照射下更明显。     

0.075 Gy X射线诱导EL-4细胞凋亡及细胞周期的适应性反应

观察低剂量Ｘ射线照射能否诱导ＥＬ－４细胞凋亡及细胞周期的适应性反应。方法采用流式细胞术（ＦＣＭ）检测细胞凋亡及细胞周期。结果单纯２ＧｙＸ射线照射后１２小时ＥＬ－４细胞凋亡显著增多，并伴有明显Ｇ１阻滞；０．０７５Ｇｙ预照射可明显减轻间隔６小时后２Ｇｙ攻击剂量照射所致的细胞凋亡和Ｇ１阻滞。结论０．０７５ＧｙＸ射线离体照射可诱导ＥＬ－４细胞凋亡及Ｇ１阻滞的适应性反应     

双向调控Cox-2表达对人食管癌EC9706细胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影响

目的 探讨上调和下调Cox-2基因表达对食管癌EC9706细胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影响。方法 构建针对Cox-2基因的siRNA载体及Cox-2基因真核表达载体,通过脂质体转染技术将其转入食管癌EC9706细胞,G418筛选得到稳定转染细胞系。荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测细胞中Cox-2 mRNA和Cox-2蛋白表达水平;裸鼠移植瘤实验检测上调和下调Cox-2表达联合X射线照射对食管癌的生长抑制作用。结果 Cox-2下调组食管癌EC9706细胞内Cox-2基因表达明显降低,Cox-2上调组明显升高。Cox-2下调组裸鼠移植瘤平均体积明显小于对照组(F=34.26,P<0.05);Cox-2上调组的瘤体平均体积大于对照组(F=26.38,P<0.05)。20 Gy γ射线照射后Cox-2下调组瘤体平均体积较照射前明显减小(F=16.35,P<0.05);而上调组裸鼠皮下种植瘤平均体积较照射前无明显变化。结论 下调Cox-2表达能抑制人食管癌EC9706细胞裸鼠移植瘤的生长,增强瘤体的放射敏感性,上调Cox-2表达则使肿瘤辐射抗拒。     

低剂量辐射对小鼠睾丸生精细胞中细胞色素c和caspase-3表达的影响

目的 研究低剂量电离辐射对小鼠睾丸生精细胞细胞色素c（Cytc）和caspase-3蛋白表达的影响。方法 采用免疫组化法（SABC法），观察低剂量X射线照射后，小鼠睾丸各类生精细胞Cytc和caspase-3表达的剂量与时程效应关系。结果 0、0.025、0．05、0．075、0．1和0.2Gy照射后12h，小鼠睾丸各类生精细胞不同程度表达Cyt c和caspase-3，以精原细胞和精母细胞表达为主，精于细胞和精于则表达相对较少，而且，随着剂量的增加，表达也增多。0．075Gy照射后。两种蛋白的表达开始随时间推移而增强，12h达到峰值，然后下降，但仍高于正常组。结论低剂量电离辐射诱导小鼠睾丸生精细胞Cytc和caspase-3蛋白的表达具有一定的剂量和时程效应规律性。