肝癌组织差异表达基因cDNA序列的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定肝癌组织特异表达基因。方法：通过菌落原位杂交技术筛选用抑制消减杂交法构建肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库，用PCR方法进一步筛选出有插入片段的阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序和同源性比较分析，用Northern印迹方法对新的cDNA序列进行初步鉴定。结果：从消减文库中随机挑取的100个白色克隆中筛选出13个阳性克隆，DNA测序获得11个不同的cDNA序列；同源性比较分析表明，6个cDNA片段与在基因高度同源，5个cDNA片段为新的序列。其长度大于300bp的3个新序列，Norther印迹证实它都来源于肝癌组织。结论：用抑制消减杂交方法构建的肝癌差异表达基因消减cDNA文库富含肝癌特异表达基因，经验证的3个新的cDNA序列可能为肝癌特异的基因序列。     

酵母双杂交系统筛选CLN8P相互作用蛋白

目的：应用酵母双杂交系统筛选CLN8P相互作用蛋白质,通过对相互作用蛋白质的筛选及研究,探讨CLN8的功能,为NCL8和NCLs疾病群的发病机制研究提供线索,并为疾病的蛋白质相互作用网络提供资料。方法 应用酵母双杂交技术,以pLexA-CLN8为诱饵质粒筛选人胎脑cDNA文库,得到Leu+LacZ+阳性克隆,进一步进行验证,并对验证后的阳性克隆的外源性片断进行测序及同源性分析。结果 从人胎脑cDNA文库中筛选得到60个Leu+LacZ+阳性克隆;将获得的具有外源性片段的文库质粒与诱饵质粒一对一重新转入酵母体内对相互作用进行验证,共获得阳性克隆22个;对验证后阳性克隆测序并进行同源性分析,共获得不同的候选基因序列10个。结论 应用酵母双杂交系统,共筛选得到10个不同的基因,其编码蛋白与CLN8P有相互作用,可能与NCLs 发病机制相关。     

类风湿关节炎滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库的构建

目的构建类风湿关节炎(RA)滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选和鉴定RA特异性基因的研究奠定基础。方法取确诊RA患者的滑膜组织,用Trizol试剂提取总RNA,Oligotex离心柱分离mRNA,电泳检测其质量,逆转录合成双链cDNA,经末端修平、接头连接、酶切后去除过多接头,收集>300bp的cDNA片段,与T7Select10-3载体连接,体外包装并扩增得到类风湿关节炎滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库。最后,通过铺平板滴度测定及PCR技术鉴定文库质量。结果所构建原始文库重组克隆数为2×107pfu,扩增滴度8.9×1010pfu/ml。PCR法检测片段插入率为90%,插入片段在300～2000bp之间。文库噬菌体裂解液PCR扩增得到BiP基因片段。结论成功构建了高质量的RA滑膜T7噬菌体展示cDNA文库,为下一步RA自身抗原的筛选奠定了基础。     

IgA肾病肾阴虚证cDNA文库的构建

目的应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术构建汉族人IgA肾病肾阴虚证cDNA消减文库。方法选择IgA肾病且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交。采用Trizol BD法提取总RNA,用SMART技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaⅠ酶切基因组cDNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,然后将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建IgA肾病肾阴虚证消减文库。结果用SSH方法筛选出了IgA肾病肾阴虚证的差异cDNA片段,其中正向消减文库共获得325个阳性克隆．反向消减文库获得306个阳性克隆,从而成功地构建了IgA肾病肾阴虚证的cDNA消减文库。结论SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段,成功构建了IgA肾病肾阴虚证的cDNA文库,为进一步克隆肾阴虚证的相关基因奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术筛选及鉴定高温致金黄地鼠神经管畸形下调表达基因

目的克隆高温致金黄地鼠神经管畸形下调表达基因，探讨其分子生物学机理。方法应用抑制性消减杂交技术构建高温致畸金黄地鼠胚胎神经管反向消减cDNA文库；联合蓝白斑和菌落PCR方法筛选阳性克隆进行测序和同源性分析；用Northern印迹方法证实这些基因的表达。结果成功构建高温致畸金黄地鼠胚胎神经管反向消减cDNA文库，从中筛选到15个基因，均与GenBank中已知基因有同源性。Northern印迹证实这些基因在高温致畸胚胎神经管中均呈下调表达。结论发现了高温致金黄地鼠神经管畸形过程中的一些重要相关基因并对其功能进行了初步探讨。     

应用酵母双杂交系统筛选E2F1相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交系统从人正常胃黏膜细胞的cDNA文库中筛选E2F1转录因子的相互作用蛋白。方法:以pGBKT7-E2F1为诱饵质粒筛选人正常胃黏膜细胞的cDNA文库,得到阳性克隆,反复验证,并对验证后的阳性克隆进行测序及同源性分析。结果:从人正常胃黏膜细胞的cDNA文库中筛选得到20个阳性克隆,经测序和同源性分析,筛除假阳性克隆,最终得到18个不同的候选基因序列。其中,17个为可知基因序列,它们分别是:组织蛋白酶B、SIVA1、干扰素调节因子7、鸟苷酸激酶1、ATP酶抑制因子1、核糖体蛋白SA、纤溶酶原激活物抑制剂1 mRNA结合蛋白、精氨琥珀酸合酶1、卵泡抑素类似物3、金属硫蛋白2A、内质网钙结合蛋白1、WNT1可诱导信号通路蛋白2、CDC42 效应蛋白1、可溶性半乳糖凝集素结合蛋白1、中胚层发育候选2、外切酶体成分7和含EGF腓骨蛋白样胞外基质蛋白 1,尚有一未知基因片段。结论:应用酵母双杂交系统成功筛选出18种E2F1相互作用蛋白,为进一步探讨E2F1影响胃癌细胞生物学行为的分子机制奠定了基础。     

抗CCP抗体与RF联合检测在类风湿关节炎早期诊断中的意义

目的 探究抗CCP抗体与RF联合检测在类风湿关节炎早期诊断中的意义。方法 选取2017年11月~2018年11月我院收治的30例类风湿关节炎患者设为研究组,另选取同期进行健康体检者30例设为对照组,对两组进行抗CCP抗体与RF联合检测,并且分析抗CCP抗体、RF单独及两者联合检测的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。结果 研究组抗CCP抗体阳性率96.67%、RF阳性率93.33%和两者联合检测阳性率86.67%均高于对照组的6.67%、3.33%及3.33%;研究组抗CCP抗体水平（78.65±14.33）U/ml和RF水平（314.22±20.56）IU/ml均高于对照组的（2.69±2.14）U/ml和（10.01±3.54）IU/ml（P＜0.05）。结论 对类风湿关节炎患者抗CCP抗体与RF的诊断敏感度拥有着一定的相似性,但抗CCP抗体特异度高于RF的特异度,若两者联合检测可极大提高敏感度,对于类风湿关节炎患者早期诊断工作的开展拥有着积极的推动作用。     

类风湿性关节炎新型自身抗原视黄醇结合蛋白1 类似蛋白相关分析研究

目的:类风湿性关节炎(RA)是一种全身性自身免疫性疾病,但其发病原因尚不清楚。因此,迫切需要找到诱发此病的相关抗原,但国内外鲜有关于新的自身抗原的报道,本课题组运用克隆技术发现新型自身抗原。方法:从滑膜细胞中提取mRNA,构建cDNA 文库,取类风湿性关节炎患者关节滑膜液中的抗体作为探针,筛选cDNA 基因库,得到阳性克隆后测序分析,寻找已知相似基因,进而分析蛋白质的构造和Northern 印迹杂交(Northern blotting)。结果:发现新型自身抗原cDNA 克隆,其与视黄醇结合蛋白1(RBP1)有36.5%的氨基酸序列相同,并发现AT-rich interaction domain,chromo domain,A+T-hook 以及TAF homology domain 这些特殊的蛋白质构造。因此将其命名为视黄醇结合蛋白1 类似蛋白(RBP1 like protein,Rbik)。Rbik RNA 不仅表达于滑膜,也表达于心脏、小肠、肌肉等多个器官组织中。结论:此自身抗原的发现可为类风湿性关节炎的实验诊断和治疗提供新的可能指标和靶点。     

酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1(1),pDBLeu-GATA1(2),pDBLeu-GATA1(3),筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.     

日本血吸虫尾蚴cDNA文库的免疫学筛选及EST序列的分析

目的为获得日本血吸虫（Schistosoma japonicura，Sj）转化生长因子β1（TGF—β1）基因的部分或全长cDNA序列。同时验证用针对某一蛋白的抗体筛选表达文库是否可以得到相应蛋白对应的基因序列。方法采用兔抗鼠TGF—β1血清，对Sj尾蚴cDNA表达文库进行免疫学筛选，对阳性克隆进行PCR扩增后，将大于500bp的克隆进行复筛，对复筛阳性的克隆进行测序和生物信息学鉴定。结果对大约10^6个噬菌斑进行了初筛。共获得7个阳性克隆；经过PCR扩增后，其中有4个克隆大于500bp，复筛获得3个持续阳性克隆；对测序后的阳性克隆进行生物信息学鉴定，得到的三个克隆均与日本血吸虫辅酶Q10氧化还原酶（SjCHGC）基因具有高的同源性（Bhata分值都大于200）。结论SjCHGC蛋白与兔抗鼠TGF—β1抗体的反应为交叉反应，用抗某一蛋白的抗体筛选表达文库得到相应蛋白的基因序列的方法不一定可行。     

Construction of cDNA library from NPC tissue and screening of antigenic genes

To construct cDNA library of nasopharyngeal carcinoma (NPC) and obtain the NPC associated or specific antigens from it, we used a powerful new method to identify the antigens eliciting humoral immune response, which is SEREX (serological identification of antigen by recombinant cDNA expression library). Autologous serum of NPC patient was used to screen the reactive clones in the human NPC tissue cDNA library consisted of 3.64×106 recombinants. The 23 exact positive clones were subcloned to monoclonality and the size of cDNA inserts was identified by PCR. Then the nucleotide sequence of cDNA inserts was determined, and the sequence alignments were performed with BLAST software on GenBank database. They represented 16 different antigens. A detailed sequence analysis showed that 10 of 16 genes were high homologous to genes known in GenBank, such as RPL31, S100 A2, MT2A, etc. However, there were also 6 genes with low homology to genes in GenBank. Furthermore, 3 of 6 genes may be novel genes. The associations of these genes to NPC and the roles that they played in the occurrence and development of NPC should be further revealed.     

人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的: 构建人源抗SARS病毒的Fab片段抗体基因的噬菌体表面呈现文库, 筛选抗SARS病毒特异性的噬菌体抗体。方法: 用PCR扩增人Fab片段抗体基因, 连入载体pComb3内, 构建噬菌体抗体库。以固相化的SARS抗原淘筛抗体库, 并用ELISA检测噬菌体抗体结合SARS病毒的特异性。结果: 用PCR共扩增出 13条Ig基因片段。电转化构建的噬菌体抗体库的库容为 1. 3×106, Fab基因的重组率为60%。以纯化的SARS抗原淘筛 3轮, 特异性富集了抗SARS病毒的噬菌体抗体, 并用ELISA法从中筛选出了 10个结合活性好、特异性强的克隆。结论: 成功地构建了人源抗SARS病毒的组合抗体文库, 从中获得人源抗SARS病毒的特异性抗体。     

Screening and Primary Characterization of NewAntigen Genes of Schistosoma Japonicum

Thestudiesonanti schistosomiasisvaccineshavebeen studiedwithrapidprogressinrecentyears[1].Aseries ofantigenicgenesofSchistosomahavebeencloned,but thesevaccinecandidatescouldnotinducehighlevelsof resistanceagainstschistosomeinfection.Currentexperim entsso…     

抑制性消减杂交技术筛选重组IFNβ下调HepG2细胞靶基因

目的利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建重组干扰素β（IFNβ）刺激人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库，筛选IFNβ下凋HepG2相关基因。方法重组IFNβ2000U／ml刺激对数生长期HepG2细胞，以生理盐水作用的HepG2细胞为阴性对照；制备细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分成两份，分别与两种不同的接头连接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建重组IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后，得到58个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。随机挑选其中35个插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得12种编码基因。结论应用SSH技术成功构建了IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库，为进一步了解IFNβ在肝细胞内的免疫调节机制提供了依据。     

卵巢上皮癌相关肿瘤抗原新基因的研究

目的探讨卵巢癌相关肿瘤抗原新基因在卵巢癌诊断和免疫治疗中的应用价值。方法利用网上生物信息学分析软件对筛选到的55个克隆的核苷酸序列进行分析,并检测其中8个新基因在卵巢癌患者和正常女性血清中的抗体。结果55个克隆的核苷酸序列代表45个卵巢癌抗原基因,其中8个是国内外首次发现的在GeneBank中尚未登记的新基因,是具有免疫原性的功能基因。其中OCY-142新基因是抑癌基因BARD1的可剪切变异体,可被CD4+和CD8+T细胞识别。8个卵巢癌肿瘤抗原新基因中7个在卵巢癌患者血清中的阳性率显著高于正常人,7个卵巢癌肿瘤抗原新基因对卵巢癌患者和正常女性进行联合检测,其敏感性和特异性达到96.9%和95.2%。CAl25异常的卵巢癌41例患者中,OCY-142单独检测的阳性率为95.12%,而CA125正常的卵巢癌57例患者中,OCY-142检测发现21例(36.9%)阳性。结论这些卵巢癌相关肿瘤抗原新基因在卵巢癌患者血清中产生的相应抗体可能成为卵巢癌的新的血清学标志物,可能是卵巢癌免疫治疗理想的新靶点。     

Glycolytic enzymes of Candida albicans are nonubiquitous immunogens during candidiasis.

A cDNA library was made with mRNA from Candida albicans grown under conditions favoring the hyphal form. The library was screened for sequences that encode immunogenic proteins by using pooled sera from five patients with oral candidiasis and five uninfected patients. Most of these patients were human immunodeficiency virus positive. From 40,000 cDNA clones screened, 83 positive clones were identified. Of these, 10 clones were chosen at random for further analysis. None of these 10 cDNAs were derived from a multigene family. The 5' and 3' ends of all 10 clones were analyzed by DNA sequencing. Two cDNAs were separate isolates of a sequence with strong homology to pyruvate kinase genes from other fungi (59 to 73%) and humans (60%). A third cDNA had strong sequence homology to the Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces lactis alcohol dehydrogenase genes (68 to 73%). A fourth cDNA was homologous (81%) to an S. cerevisiae protein of unknown function. The functions of the remaining six C. albicans cDNAs are not known. A more detailed analysis of the clones encoding glycolytic enzymes revealed that sera from few patients recognized them as antigens. Therefore, although glycolytic enzymes constitute a group of C. albicans proteins that are immunogenic during oral and esophageal infections, their detection cannot be exploited as an accurate marker of infection.     

全人源抗肝癌噬菌体单链抗体的筛选与鉴定

目的: 构建人源抗肝癌噬菌体单链抗体库, 从中筛选抗肝癌单链抗体(scFv), 并对其特异性进行鉴定.方法: 采用体外致敏法和EBV转化技术联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库.对初级抗体库进行亲和富集及ELISA筛选, 获得的阳性克隆进行免疫组化鉴定并测序.结果: scFv基因与载体连接后得到库容量为1.0×108的初级噬菌体抗体库.对抗体库进行3轮正负淘选和富集后, 随机挑取2 798个克隆进行ELISA, 发现3个克隆对HepG2呈强阳性反应, 而与QSG-7701等人正常细胞系呈弱阳性或不反应.对克隆SA3进行免疫细胞化学鉴定, 结果与ELISA一致.免疫组织化学鉴定表明SA3与肝癌组织和肝组织阳性率的差别有统计学意义.结论: 构建了库容量达1×108的全人源抗肝癌噬菌体抗体库.通过淘选富集、 ELISA和免疫组织化学鉴定获得特异性较强的噬菌体克隆, 为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础.     

应用噬菌体肽库技术获得与猪鼻支原体蛋白P37结合的多肽序列

本研究以猪鼻支原体P37蛋白作为筛选分子,对噬菌体展示随机肽库进行亲和淘选。利用ELISA法鉴定亲和力高的阳性噬菌体克隆,对其进行DNA测序和分析,据此推导随机多肽的氨基酸序列,然后构建、表达GST-多肽重组蛋白,经GST-pull down进一步鉴定该多肽与P37的结合力。经过4轮筛选和单克隆检测,获得18个有较强特异反应的阳性克隆,18个克隆包括了5种不同的小肽序列,它们分别为ACAPKPPWLC(12/18)、RPLSIDP-WSPHL(3/18)、RPLSNDPWSPHL(1/18)、QNMMSPIEGVRI(1/18)和WAPEKDYMQLMK(1/18)。用ACAPK-PPWLC、RPLSIDPWSPHL与GST重组的融合蛋白进行GST-pull down实验表明,RPLSIDPWSPHL多肽能与P37相互作用。本研究为进一步筛选与P37相互作用的蛋白提供了实验依据和结构基础。