贵州省2011年黑线姬鼠钩端螺旋体分离株16S rRNA基因序列分析及基因种鉴定

摘要 目的 了解贵州省钩端螺旋体病（简称钩体）病原学特征,分析2011年贵州省钩体病疫区黑线姬鼠钩体分离株16S RNA基因序列并对其进行基因种鉴定,为贵州省钩体病的有效预防和控制提供科学依据。方法 应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,从NCBI数据库下载钩体17个基因种代表菌株及及伊尼利螺旋体和短小螺旋体16S rRNA基因序列,采用生物信息软件比较分离株和各基因种代表株间的核苷酸序列,分析其亲缘进化关系,确定分离株基因种。结果 通过PCR扩增和基因测序技术获得4株钩体分离株16S rRNA基因核苷酸序列（1492 bp）,4株钩体分离株的核苷酸同源性为100%,与17个钩体基因种中的问号钩体（L. interrogans）基因种黄疸出血群代表菌株的同源性最高（99.9%）,系统进化树分析显示,钩体分离株与17个基因种代表菌株及伊尼利螺旋体和短小螺旋体形成致病性、非致病性、未知致病性和其它分支,贵州4株分离株分属于致病性基因种分支,其中与致病性钩体8个基因种中的问号钩体基因种亲缘关系最近。结论 贵州省2011年钩体病疫区黑线姬鼠钩体分离株均属致病性钩体的L. interrogans 基因种,该基因种菌株可能为当地流行菌株,该结果将为贵州省钩体病的预防和控制提供科学依据。     

钩端螺旋体血小板激活因子乙酰水解酶基因特征分析

目的　由于钩端螺旋体病的主要特征之一是组织器官广泛性出血 ,出血部位发生在黏膜、脏器、浆膜和皮肤等处 ,严重者出现大面积肺弥散性出血、咳血 ,是危重钩端螺旋体病早期最常见的死因 ,其致病机理仍不清楚。本文使用生物信息学软件分析钩端螺旋体基因LA2 14 4 (血小板激活因子乙酰化酶 ,PafAH)所编码蛋白的结构和功能 ,并探讨其在致病过程中的作用。方法　使用NCBI ,Swissprot/TrEMBL ,ProDom ,Pfam ,Jpred2 ,SWISS -MODEL ,TMpred ,SignalP ,ClustW对问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株全基因组ORF基因诠释 ,编码蛋白进行在线分析 ,并使用Bioedit软件进行氨基酸同源性比较分析。结果　确定了问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株血小板激活因子乙酰化酶基因 ,该基因编码蛋白质与哺乳动物 pafAH在一级结构上相似性达 4 2 % ,以牛脑 pafAH(Ib)γ亚基 (1WAB/PDB)为模件模拟该蛋白三级结构 ,发现两者立体结构与非常相似 ,催化位点完全相同 ,均由Ser-His-Asp组成催化三合体。结论　该基因可能与钩体染色体所编码的胶原酶基因 ,溶菌酶基因 ,YopM基因 ,VwA基因协同在钩端螺旋体病出血过程中起作用 ,最终导致弥散性出血和咳血     

贵州省3株钩端螺旋体分离株PFGE分型与基因种鉴定

目的应用脉冲场电泳（PFGE）分型技术和16S rRNA基因测序分析技术分别对贵州省3株动物宿主钩 端螺旋体分离菌株进行分子分型和基因种鉴定,了解贵州省钩端螺旋体的分子流行病学特征。方法应用 DNA限制性内切酶Not I对钩端螺旋体染色体DNA酶切后,用PFGE将DNA片段分离,采用BionumericsV4.0将3 株钩体菌株PFGE图谱与中国15群15型参考菌株进行聚类分析;同时,应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,并与GenBank数据库已注册的核酸序列进行同源性比对 、确定基因种、分析亲缘进化关系。结果来自贵州省的3株动物宿主分离钩体菌株PFGE带型命名为LepNot I 002和LepNot I 003,经聚类分析,3株菌株与黄疸出血群黄疸出血型赖株的相似性大于95%。16S rRNA 基因测序和分析表明,3株贵州分离钩体菌株之间的同源性为100%,与致病性钩体问号钩端螺旋体种（L. interrogans）不同血清型参考菌株的同源性达100%。结论3株贵州动物分离钩体菌株经PFGE分型鉴定与黄 疸出血群赖型赖株的相似性大于95%,经16S rRNA基因测序分析鉴定为L. interrogans种,上述两种方法 对贵州省钩体分离菌株的鉴定结果一致,有助于贵州省钩端螺旋体病的主动监测、暴发调查和传染源追踪 。     

问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121的初步研究

目的　探讨问号赖型钩端螺旋体抗原基因的特点。方法　应用６ 种常见内切酶（ＢａｍＨＩ,Ｂｇｌ Ⅱ,ＥｃｏＲⅠ,Ｈｉｎｄ Ⅲ,ＰｓｔⅠ,Ｐｖｕ Ⅱ）对从问号赖型钩端螺旋体０１７ 株的基因文库中筛选出来的重组质粒ｐＤＬ１２１ 外源基因进行酶谱分析,同时用Ｄｉｇｏｘｉｎ 标记的ｐＤＬ１２１ 外源基因片段作探针对不同种属的致病性钩端螺旋体和非致病性钩端螺旋体基因进行杂交分析。结果　显示问号赖型钩端螺旋体重组质粒ｐＤＬ１２１ 外源基因没有６ 种内切酶的酶切位点,重组探针与致病性钩体（ｓｅｒｏｖａｒｌａｉｓｔｒａｉｎ０１７,ｓｅｒｏｖａｒ ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓｓｔｒａｉｎ ５６６１０ ,ｓｅｒｏｖａｒ ｐｏｍｏｎａｓｔｒａｉｎ ５６６０８）有杂交信号,与非致病性钩体（ｓｅｒｏｖａｒ ｐａｔｏｃ ｓｔｒａｉｎ Ｐａｔｏｃ Ⅰ,ｓｅｒｏｖａｒｉｌｌｉｎｉｓｔｒａｉｎ ３０５５）无杂交信号,亦不识别大肠杆菌。结论　重组质粒ｐＤＬ１２１ 外源基因可能是问号赖型钩端螺旋体的一个新基因,进一步测序分析将揭示该基因本质,同时因该重组探针能鉴别致病性钩体和非致病性钩体,提示其可用于钩端螺旋体病的早期诊断及钩端螺旋体的鉴定和分类。     

钩端螺旋体鞭毛蛋白B(FlaB)基因flaB在大肠杆菌内的表达

目的　在大肠杆菌中高效表达钩端螺旋体内鞭毛蛋白 (FlaB)用于钩体病的诊断和预防。方法　将目的基因flaB定向克隆至原核表达载体 pGEX - 5T ,构建重组融合表达质粒 pGF ;Western -blot鉴定其特异性 ,ELISA法判定其用于钩体病诊断的可行性。结果　GST -FlaB主要以包涵体形式表达 ,表达量约占菌体总蛋白的 4 0 % ;Western -blot结果显示该蛋白与FlaB抗血清能呈现明显的单一条带 ;包涵体经TritonX - 10 0及尿素纯化后 ,纯度可达 90 % ,并且能溶于包被缓冲液中 ;ELISA检测显示纯化后的GST -FlaB具有较好的特异性。结论　钩端螺旋体FlaB可以高效表达并可能用于ELISA检测及钩体病的预防。     

钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达重组质粒．利用脂质体体外转染HeLa细胞，探讨其在体外真核细胞中的表达情况，为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据。方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增lipL21基因，纯化回收后克隆入pUCM-T载体，再亚克隆入真核表达载体poD-NA3．1（＋），运用脂质体2000将重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21转染入HeLa细胞，细胞免疫组化法观察目的基因的表达。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了lipL21真核表达重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21，DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。重组质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21体外在HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21。结论成功构建了钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21，且能够在体外真核细胞中表达；为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础。     

健康人群血清钩端螺旋体抗体调查

钩端螺旋体病（Leptospirosis，简称钩体病），是由致病性钩端螺旋体（Leptospira interrogans，简称钩体）引起的一种分布广泛的自然疫源性疾病，我国是受钩体病危害十分严重的国家。1937年汤择光首次报告3例钩端螺旋体病，1955年本病被列入法定传染病，迄今全国累计发病人数已超过250万。平均病死率约为1％。近年来我校面向全国十几个省市自治区招生，我们曾对本省籍在校学生钩端螺旋体感染情况进行过研究，为了解来自其他省市自治区学生钩端螺旋体感染状况，我们又对本校2003、2004级外省籍学生进行了血清钩端螺旋体抗体检测。     

螺旋体传染病

钩端螺旋体主要属特异性蛋白抗原分布及其免疫性研究，钩端螺旋体毒力因子研究现状，肺出血型钩端螺旋体病CT表现及与临床的关系（附17例分析），钩端螺旋体HpL21基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达。     

钩端螺旋体病肺部出血性损害65例临床观察

钩端螺旋体病肺部出血性损害６５例临床观察四川泸州医学院附属医院传染科（６４６０００）黄永茂李强钟森余光开钩端螺旋体病（钩体病）是一严重的人兽共患的动物源性疾病。本病以钩体菌血症基础上出现肺、肝、肾、心及中枢神经系统等多器官的不同程度损害为特点。依其临...     

问号钩端螺旋体溶血素基因特征分析

目的　预测问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株致病因子———溶血素基因 ,并对其编码蛋白结构特征进行深入分析。方法　使用NCBI ,Swissprot/TrEMBL ,ProDom ,Pfam ,Jpred2 ,TMpred ,SignalP ,ClustW对问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株溶血素基因诠释 ,所编码蛋白进行在线分析 ,并使用Bioedit软件进行氨基酸同源性比较分析。结果　确定了问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株 9个溶血素基因 ,分为两大类 :鞘磷脂酶类溶血素基因和非鞘磷脂酶类溶血素基因。并对溶血素基因编码蛋白二级结构、结构域、跨膜区域、信号肽及进化等进行了分析。结论　多种类型多条溶血素基因同时存在于钩端螺旋体菌中 ,暗示溶血素基因和钩端螺旋体致病性之间有密切的关系 ,可能在致病过程中起重要作用     

钩端螺旋体赖株豚鼠感染模型的建立和免疫组化法对钩体抗原的检测

目的　建立钩端螺旋体赖型赖株感染豚鼠的动物模型 ,并用免疫组化法检测钩端螺旋体抗原在组织中的分布。方法　不同剂量钩端螺旋体赖株通过腹腔内注射感染豚鼠 ,观察豚鼠发病情况 ,及时解剖死亡豚鼠 ,HE染色观察肝、肾、肺等器官病变 ,EnVision二步法染色检测肝、肾、肺组织中钩体抗原。结果　感染后豚鼠发病 ,死亡与感染的钩端螺旋体剂量明显相关 ,大体标本及HE染色光镜下均出现典型钩体病病变。免疫组化显示在肝、肾、肺组织中均存在钩体抗原。结论　通过钩端螺旋体赖株腹腔注射的方法成功地建立了豚鼠动物模型。应用EnVision二步法染色 ,可有效显示组织中的钩体抗原。为进一步研究钩端螺旋体发病机制奠定了基础。     

钩端螺旋体病癫痫发作149例探讨

本文报道１４９例钩端螺旋体病癫痫发作，进一步对病因及发病机理和临床治疗进行探讨，认为本病的发生主要是钩端螺旋体感染或者是钩端螺旋体Ｌ型直接损伤了脑组织或脑部供血血管，所致脑部间质性炎症变及内毒素刺激诱发癫痫症状。治疗不仅是控制癫痫发作，最主要选用易透过血脑屏障药物，损伤钩体ＤＮＡ结构。甲硝哒唑静滴为首选，其次选青霉素、地塞米松，可减少钩端螺旋体病的后发症，彻底控制癫痫发作。     

钩端螺旋体病神经系统后发症

钩端螺旋体病神经系统后发症广州中山医科大学附属第三医院神经科（５１０６３０）边连防李津钩端螺旋体病（钩体病）临床表现较复杂，急性期可有高热、头痛、腓肠肌痛、淋巴结肿大压痛，肝、肾损害及出血倾向等，亦可无典型急性期症状而以神经系统损害成为唯一的临床表现...     

螺旋体传染病

莱姆病关节炎的循证治疗；西部大开发中环境改变对莱姆病传播的影响；肺钩端螺旋体病的X线分析；赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因的克隆分析及蛋白表达；一新型钩端螺旋体的毒力研究；[编按]     

2021年贵州省环境致病性钩端螺旋体分离培养及基因种分析

目的 对贵州省2021年钩端螺旋体(钩体)病疫区环境标本进行致病性钩体分离培养,了解其基因种特征,为钩体病防控提供科学依据。方法 采集钩体病疫情发生地环境水和土壤样品,采用EMJH培养基进行钩体分离培养。提取疑似钩体生长培养物基因组DNA,采用致病性钩体特异性PCR进行检测,同时采用16S rRNA序列分析法对其进行基因种鉴定,并应用MEGA 7.0软件构建系统发育树,分析菌株间进化关系。结果 从112份环境样品中分离出50株疑似钩体菌株,致病性钩体特异性PCR检测显示其中3株为致病性钩体,包含环境水样分离出的2株和土壤样品中分离出的1株。16S rRNA序列比对分析显示,经PCR检测为致病性钩体的3株菌株属于钩体致病性基因种,其中2株为Leptospira noguchii基因种,1株为Leptospira borgpetersenii基因种;另外47株菌株中5株菌株属于钩体中间种,42株菌株属于钩体非致病性基因种。系统发育树显示,致病性钩体菌株与其基因种代表性菌株进化关系较近。结论 贵州省钩体病疫区环境钩体基因种复杂,同时存在致病性基因种和非致病性基因种,本次检出的2种致病性钩体基...     

对TR/Patoc 1肉眼玻片凝集试验早期快速诊断钩端螺旋体病的评价

<正> 为了对TR/Patoc 1 肉眼玻片凝集试验(简称玻凝)诊断钩端螺旋体病(简称钩体病)作出评价,我们以玻凝、显微镜凝集试验(显凝)和血液培养钩端螺旋体(简称血培养)3种方法,对33例患者双份血清进行诊断钩体病实验比较,现报告如下。     

螺旋体传染病

洪雅县钩端螺旋体病流行特征分析；问号钩端螺旋体lipL21基因改建及其表达产物免疫原性变化和定位；梅毒螺旋体TpN15重组抗原的克隆与表达;杭州市莱姆病血清流行病学调查;     

3株钩端螺旋体外膜蛋白基因的序列分析

目的 探讨钩端螺旋体外膜蛋白基因在钩体遗传分类中的作用。方法 对我国的2株问号钗体赖型56601株和爪哇型56602株的外膜蛋白基因Ompl1进行PCR扩增,得到外膜蛋白基因并进行了全基因序列分析,测序的2株钩体与流感伤寒型RH52株进行了核苷酸序列比较和推导的氨基酸序列比较。结果 赖型56601和爪哇型56602株钩体Ompl1基因核苷酸序列与流感伤塞型RH52株的同源性分别为89％和80％,的外膜蛋白氨基酸序列的同源性分别为92％和88％。由此可以看出56601株、56602株与RH52株分别属于不同的血清群,这与Yasuda的遗传分类相。结论 我国的赖型56601株和爪哇型56602株及流感伤寒型RH52株Ompl1基因的核苷酸序列存在一定差别,利用Ompl1基因可对钩端螺旋体进行分类和鉴定。     

螺旋体传染病

flaB—PCR在钩端螺旋体病检测中应用，钩端螺旋体致病机制的研究进展（综述），钩端螺旋体病26例临床分析，钩端螺旋体疫苗的过去、现在和未来，     

钩端螺旋体毒力相关因子分子生物学研究进展

钩端螺旋体病(Leptospirosis，简称钩体病)，又称外耳氏病(weil's disease)，是由致病性钩端螺旋体(Leptospira interrogans，简称钩体)引起的一种分布广泛的自然疫源性疾病。人主要是通过间接接触受带菌动物(野鼠、家畜等)尿液污染的水体、土壤而感染本病，但也可在畜牧养殖、屠宰、加工过程中直接接触病原体而被感染。钩体病的临床表现轻