左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导中转化生长因子β1及Smad2/3的影响

背景:滋补肾阴左归丸、温补肾阳右归丸均可协同诱导剂诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,但其机制尚有待探讨。目的:观察左、右归丸含药血清对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中转化生长因子β1及其信号转导蛋白Smad2/3表达的影响。方法:运用全骨髓贴壁法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞;分别以空白血清对照组,左归丸、右归丸、阳性对照药补佳乐制备的大鼠含药血清加诱导剂(地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠),以及诱导剂组为对照共5组对骨髓间充质干细胞进行干预。采用Western blot法检测Ⅰ型胶原蛋白表达,用免疫组化法检测转化生长因子和Smad2/3在细胞内的表达。结果与结论:左归丸、右归丸含药血清诱导骨髓间充质干细胞成骨后Ⅰ型胶原蛋白、转化生长因子β1、Smad2/3蛋白表达高于空白组、诱导剂组,差异有显著性意义(P0.05),且左归丸优于右归丸(P0.05)。提示左、右归丸含药血清能通过转化生长因子β1调节Smad2/3信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化,且左归丸组效果更好,表明中医"滋肾阴"法更能有效的促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。     

左归丸含药血清通过ERK/TGF-β/Smads信号级联调控MC3T3-E1细胞增殖与分化

目的:研究细胞外信号调节激酶(ERK)/转化生长因子β(TGF-β)/Sma和Mad相关蛋白(Smads)信号级联在左归丸含药血清干预成骨前体细胞系MC3T3-E1细胞增殖与分化中的作用。方法:以倍美力为阳性对照药,对Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠灌服高、中、低剂量的左归丸混悬液,7 d后腹主动脉取血分离含药血清。采用噻唑蓝(MTT)法检测左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞的增殖作用,采用改良钙钴染色法检测碱性磷酸酶(ALP)表达,采用茜素红染色法检测钙化结节,采用Western blotting法检测核结合因子α1(Cbfα1)和Ⅰ型胶原(ColⅠ)蛋白表达,采用real-time RT-PCR法检测TGF-β₁、Smad4和Smad2 mRNA表达。结果:左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞的促增殖作用呈剂量和时间相关性,其中以低剂量且体积分数为15%作用48 h后对MC3T3-E1的促增殖作用最大;左归丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞ALP表达,增强细胞基质钙化,提高Cbfα1和ColⅠ蛋白分泌,上调TGF-β₁、Smad4和Smad2 mRNA表达;加入ERK1/2信号通路特异性阻滞剂PD98059后,MC3T3-E1细胞增殖降低,ALP表达下降,细胞基质钙化减弱,Cbfα1和ColⅠ蛋白分泌降低,Smad4和Smad2 mRNA表达下调,TGF-β₁ mRNA表达进一步上调。结论:左归丸可能通过干预ERK/TGF-β/Smads信号级联而调控成骨细胞的增殖和分化,这可能是其防治骨质疏松症的机制之一。     

鞣花酸通过Wnt/β-catenin信号途径调节成骨代谢

目的探索鞣花酸是否能够通过Wnt/β-catenin信号通路调节BMSCs成骨代谢。方法 CCK-8实验观察鞣花酸对BMSCs增殖的影响。碱性磷酸酶染色和油红O染色检测鞣花酸对BMSCs成骨分化和成脂分化的调节作用。通过Western blot和real time PCR分析鞣花酸对BMSCs中RUNX2、ALP、Col1、PPARγ、Adipoq和β-catenin的调节作用。结果与对照组相比,鞣花酸可以在一定程度上抑制BMSCs的增殖;通过促进BMSCs中RUNX2、ALP和Col1的表达,促进BMSCs的成骨分化;通过抑制BMSCs中PPARγ和Adipoq的表达,抑制BMSCs的成脂分化。鞣花酸可以上调BMSCs中的β-catenin,发挥促进Wnt通路的作用。结论鞣花酸能够通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进成骨代谢。     

BMP-2通过诱导RBP4表达调控小鼠骨髓间充质细胞的成骨分化

目的　探讨视黄醇结合蛋白4（RBP4）在骨形态发生蛋白（BMP-2）诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化中的作用。  方法　用重组人源BMP-2（rhBMP-2）诱导小鼠BMSCs成骨分化,采用Western-blot和qPCR检测成骨分化过程中RBP4表达情况;RNA干扰技术抑制RBP4表达,检测小鼠BMSCs成骨分化情况。  结果    qPCR和western-blot检测结果表明：rhBMP-2诱导小鼠BMSCs细胞7 d后,成骨分化明显,同时细胞RBP4表达水平显著升高;转染RBP4 siRNA 24 h后以rhBMP-2诱导7 d,小鼠BMSCs细胞成骨分化被显著抑制。   结论    BMP-2通过诱导RBP4表达,促进小鼠BMSCs的成骨分化。     

Klotho对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

目的 探讨延缓衰老基因Klotho对骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖和分化的影响。 方法 体外条件下培养大鼠骨髓间充质干细胞,构建分泌型Klotho(sKL)过表达的BMSCs。Western blotting检测细胞及培养基中sKL的表达;MTT法检测细胞增殖能力;Western blotting检测衰老标志物P53、P21蛋白的表达。利用成骨诱导液定向诱导BMSCs向成骨细胞分化,应用碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨效果;利用成脂诱导液定向诱导BMSCs向脂肪细胞分化,应用油红O染色鉴定成脂效果。 结果 Western blotting结果显示,sKL组细胞和培养基中sKL蛋白表达显著上调（P<0.05）,P53、P21表达显著下调（P<0.05）;MTT结果显示,各组细胞吸光度值（A值）差别无显著性（P>0.05）,sKL组成骨及成脂能力明显强于对照组（P<0.05）。 结论 sKL增强了大鼠BMSCs的延缓衰老能力,对BMSCs的成骨分化和成脂分化产生一定的促进作用,而对BMSCs的增殖无显著影响。     

犬骨髓间充质干细胞的生长特点和在诱骨条件下的成骨特性

为了研究犬骨髓间充质干细胞（canine mesenchymal stem cells，cMSCs）的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。使用密度梯度法分离成年犬骨髓间充质干细胞进行培养，保留贴壁细胞传代，观察，以地塞米松、β甘油磷酸钠、抗坏血酸为成骨诱导剂。利用倒置光学显微镜和透射电镜观察细胞形态特征，四甲基偶氮盐（MTT）比色测定增殖，用碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性及骨钙素（Osteocalcin，OCN）含量来研究细胞分化情况。形态学观察表明，cMSCs贴壁细胞呈集落生长，有成纤维细胞样外观，透射电镜可见成骨诱导后cMSCs具有分泌型细胞的特征；推测成骨诱导剂可促进骨髓间充质干细胞成骨，表现为ALP活性、OCN含量明显升高。本实验表明所培养的cMSCs保持了未分化状态，并在成骨诱导剂的作用下可向成骨细胞分化。     

不同浓度的骨碎补总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的:通过在体外条件下对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)实施干预诱导,探寻骨碎补总黄酮对BMSCs的成骨诱导分化能力及不同浓度下可能存在的剂量效应关系。方法:应用全骨髓贴壁培养法对BMSCs进行分离、纯化,并通过流式细胞术对BMSCs进行鉴定,再通过设立含不同浓度骨碎补总黄酮条件培养基,分组对BMSCs进行干预,观察各组7d和14d碱性磷酸酶(ALP)的表达,同时通过ALP染色和矿化结节染色进行定性分析。结果:用全骨髓贴壁法成功分离获得了均一稳定的BMSCs,各浓度骨碎补总黄酮作用BMSCs7d和14d后,诱导不同程度的ALP表达,经10-5g/L骨碎补总黄酮诱导,ALP染色及矿化结节染色均阳性。结论:低浓度骨碎补总黄酮能促进BMSCs向成骨细胞分化,其ALP生成量随着骨碎补总黄酮浓度的降低大致呈增加趋势。     

Shh在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用

 目的：研究Sonic Hedgehog（Shh）在雷奈酸锶（strontium ranelate,Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞分化中的作用。方法：采用全骨髓贴壁培养法分离、纯化、培养大鼠BMSCs,取第3~5代BMSCs加入成骨诱导液诱导成骨分化,再加入不同浓度Sr及Shh拮抗剂cyclopamine（Cy）,分别观察它们对BMSCs向成骨细胞分化的影响。酶标法检测成骨细胞分化早期标志物碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性;茜素红染色检测细胞钙化水平;Western blotting法检测Shh和Runx2蛋白的表达情况。结果：Sr（3 mmol/L）可以使细胞ALP活性增高,钙结节形成增加。Sr（0.1～5 mmol/L）作用BMSCs 7 d,可明显促进Shh和Runx2蛋白的表达,且Shh蛋白在1 mmol/L Sr作用时表达最多,而Runx2在3 mmol/L Sr作用时表达最多。1 mmol/L Sr作用BMSCs不同时间（1、3、5、7 d）,呈时间依赖性地上调Shh和Runx2蛋白的表达。Cy（10 μmol/L）不仅拮抗Sr对Shh和Runx2表达的上调作用,还抑制Sr对ALP和钙结节形成的促进作用。结论：Sr可通过上调Shh蛋白及成骨特异性转录因子Runx2的表达促进BMSCs向成骨细胞分化。     

辛伐他汀促进大鼠BMSCs分化为成骨细胞

目的 探讨辛伐他汀对体外诱导培养的大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）成骨分化的作用,以及对大鼠BMSCs基因表达谱的影响。方法 取6周龄雄性SD大鼠股骨、胫骨BMSCs进行培养,第3天改用成骨诱导培养基,同时实验组（SIM）加入辛伐他汀（1×10-7mol/L）,对照组（V）加入等量溶剂。细胞培养的第14天进行碱性磷酸酶（ALP）比活性测定;第21天进行如下检测：Von Kossa染色观察细胞外基质矿化情况;提取、纯化mRNA,逆转录合成cDNA,荧光标记后与大鼠全基因组寡核苷酸芯片（G4130A）杂交、扫描后筛选出差异表达的基因,Real-time RT-PCR验证部分差异表达基因mRNA的表达。 结果 1. SIM组ALP比活性及细胞外基质矿化能力明显强于V组(p<0.05);2. 在22,575个基因中,共检测出678个差异表达基因,其中包括ALPl、TGFβ1、OCN、 DLX5、Axin2、BMP-2、IBSP、MMP13等与成骨分化相关的基因。结论 辛伐他汀能够促进体外诱导培养的BMSCs向成骨细胞分化,其作用机制可能与调控多种成骨相关基因的表达有关。     

羌活鱼研粉物、水提及酸提物含药血清对骨髓间充质干细胞增殖及向成骨分化的影响

背景：羌活鱼经大量的临床观察和报道有促进骨折愈合的作用,其具体的作用机制及其有效成分的研究报道尚少。 目的：分析羌活鱼研粉物、水提及酸提物含药血清对体外培养骨髓间充质干细胞增殖与成骨性分化的影响。 方法：制备羌活鱼研粉、水提物、酸提物,分别采用高、中、低剂量灌服大鼠制得羌活鱼研粉物、水提及酸提物含药血清,以灌服等体积生理盐水制得对照血清;采用贴壁筛选法培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过MTT法检测细胞增殖;于干预后的不同时间点分别测定细胞碱性磷酸酶活性、钙盐沉积量、成骨性分化基因表达以及钙化结节数、并比较各组间差异。 结果与结论：羌活鱼研粉物及水提物含药血清具有刺激骨髓间充质干细胞增殖活性及促进其成骨性分化的能力,其中尤其以研粉物中剂量组最为明显,而酸提物含药血清并无此功效。主要表现在细胞增殖、碱性磷酸酶活性、钙盐沉积量、成骨性分化基因和钙化结节数显著高于空白对照组(P < 0.05)。     

Hedgehog/Gli1通路在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用

目的:探讨Hedgehog/Gli1信号通路在雷奈酸锶(strontium ranelate,Sr)促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化中的作用。方法:体外分离培养大鼠BMSCs,诱导其成骨分化,根据实验目的加入不同浓度的Sr、Hedgehog受体拮抗剂cyclopamine(Cy)及Gli1小干扰RNA(Gli1-siRNA)。用Western blotting法检测Gli1及Runx2的表达,酶标法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色法检测钙结节水平。结果:应用不同浓度的Sr(0.1~5 mmol/L)处理BMSCs细胞7 d后,细胞内Gli1蛋白表达增高,Sr的浓度为3 mmol/L时,Gli1表达达到高峰;使用Cy与Sr共处理BMSCs 7 d,能拮抗Sr对Gli1蛋白表达的上调作用;应用Gli1-siRNA转染细胞后,能下调Gli1蛋白的表达,并抑制Sr对Gli1下游Runx2蛋白表达的上调作用,还可拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论:Hedgehog/Gli1通路参与了Sr促进骨髓间充质干细胞向成骨分化的过程。     

脑络欣通和左归丸药物血清体外培养神经干细胞的增殖与分化

BACKGROUND:Because of limited source and a relatively weak ability of differentiation and proliferation, how to take positive and effective measures to promote neural stem cell proliferation, differentiation has become the focus of research. OBJECTIVE:To investigate the effects of drug-contained sera of Naoluo Xintong versus Zuogui pill on the proliferation and differentiation of in vitro cultured rat neural stem cells. METHODS:Embryonic neural stem cells of Sprague-Dawley rats were isolated and cultured in vitro, and then were co-cultured with the serum medium containing 10% Naoluo Xintong and 10% Zuogui pill, respectively. Comparative observations were performed between two groups by inverted microscope and immunofluorescence staining. RESULTS AND CONCLUSION:Under the inverted microscope, the cells began to grow in cluster and gather into a ball, but the diameter was relatively small after 24-hour culture; the neurospheres expended further, with relatively regular shape, but no neurosphere differentiation appeared after 48 hours of culture. The average prominent length of the neurospheres in the Zuogui pill group was significantly greater than that in the Naoluo Xintong group after 5 days of culture (P < 0.05). The rate of rat neural stem cells differentiating into MAP-2-positive cells in the Zuogui pill group was significantly lower than that in the Naoluo Xintong group (P < 0.05), but the rate of differentiated cells positive for glial fibrillary acidic protein in the Zuogui pill group was significantly higher than that in the Naoluo Xintong group (P < 0.05). After 48 hours of culture, neurospheres were cultured in the different drug-contained media, and 12 hours later, the neurospheres adhered to the wall, and a small amount of cell migration occurred. Then, cell migration began to increase with time. Under the immunofluorescence staining: prominent neurons with long protrusions were increased in both two groups, but there were no significant differences in the proportion of neurons and astrocytes between two groups (P > 0.05). These findings suggest that drug-contained sera of Naoluo Xintong and Zuogui pill can both not only promote the proliferation and differentiation of in vitro cultured rat neural stem cells, but also provide a suitable microenvironment for neural cell proliferation. Additionally, there are significant differences between the two drugs. Consequently, it is feasible to induce neural cell proliferation and differentiation by Naoluo Xintong and Zuogui pill.     

microRNA-25-3p suppresses osteogenic differentiation of BMSCs in patients with osteoporosis by targeting ITGB3

This study was conducted to investigate the impact of the microRNA (miR)-25–3p/ITGB3 axis on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) from patients with osteoporosis (OP). BMSCs isolated from the bone marrow of healthy controls and OP patients were identified by flow cytometry, in which ITGB3 mRNA and miR-25–3p expression was detected by RT-qPCR and ITGB3, Runx2, OPN, ALP, and OSX protein expression by western blot. The binding between ITGB3 and miR-25–3p was assessed by dual-luciferase reporter gene and Ago2-RIP assays. BMSC osteogenic differentiation was observed by alizarin red staining and ALP activity. The differentiation of BMSCs to adipocytes and chondrocytes was measured by oil red O staining and alcian blue staining, respectively. BMSCs were successfully isolated from the bone marrow of healthy controls (normal-BMSCs) and OP patients (OP-BMSCs). ITGB3, Runx2, OPN, ALP, and OSX expression was poorer and miR-25–3p expression was higher in OP-BMSCs than in normal-BMSCs. Mechanistically, ITGB3 was negatively targeted by miR-25–3p. After osteogenic, adipogenic, and chondrogenic differentiation of BMSCs were successfully induced, adipogenic differentiation increased and osteogenic and chondrogenic differentiation decreased in OP-BMSCs compared with normal-BMSCs. Overexpression of ITGB3 facilitated mineralized nodule formation and elevated ALP activity and Runx2, OPN, and ALP expression in OP-BMSCs. miR-25–3p upregulation diminished mineralized nodule formation, ALP activity, and Runx2, OPN, and ALP expression in OP-BMSCs and normal-BMSCs, which was annulled by additional ITGB3 overexpression. miR-25–3p targets ITGB3, thereby suppressing osteogenic differentiation of BMSCs from OP patients.     

低氧条件下载二甲基草酰甘氨酸电纺纤维促血管化及成骨性能研究

目的 通过聚L-丙交酯-己内酯电纺纤维（PLCL）负载二甲基草酰甘氨酸（DMOG）,研究其在低氧和常氧成骨诱导过程中对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的血管化和体外成骨分化的作用。方法 本研究经静电纺丝技术制备PLCL电纺纤维（P）和负载DMOG的PLCL电纺纤维（PD）,通过扫描电镜观察电纺纤维形貌;通过细胞骨架染色观察BMSC在不同电纺纤维上的黏附和生长状态;通过碱性磷酸酶和茜素红染色检测在不同电纺纤维上的BMSC经常氧和低氧成骨诱导7 d后的碱性磷酸酶表达和14 d时的钙沉积情况;通过RT-PCR检测在不同电纺纤维上的BMSC经常氧和低氧成骨诱导7 d和14 d时的成骨相关基因（ALP、Runx2、Col1和OCN）和促血管化相关基因（VEGF）的表达情况。结果 扫描电镜结果表明,P和PD具有纤维状形态并呈现为多孔结构。细胞实验表明,BMSC可在P和PD表面黏附生长,且低氧条件下在PD上表现出更好的形态。与常氧条件相比,在低氧条件下,P和PD在7 d时的碱性磷酸酶表达减少。但低氧条件成骨诱导14 d时PD仍能促进钙的沉积。在常氧条件下,电纺纤维P可上调ALP、Runx2、Col1、OCN和VEGF的表达,但低氧条件下其对上述基因的上调作用不明显。而电纺纤维PD在常氧和低氧条件下均可促进ALP、Runx2、Col1、OCN和VEGF的表达。结论 本研究制备的负载DMOG的PLCL电纺纤维在低氧条件下具有良好的体外促血管化和促成骨分化性能,预期可作为一种较好的成骨修复材料。     

雷奈酸锶通过TGF-β1/Smad通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

 [摘 要] 目的:研究转化生长因子β1（TGF-β1）/Smad通路在雷奈酸锶（strontium ranelate,Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞分化中的作用。方法: 在大鼠BMSCs向成骨细胞的诱导分化过程中,用Sr处理细胞,用Western blotting法检测磷酸化Smad2（phosphorylated Smad2,p-Smad2）和Runx2的表达。用TGF-β1特异性阻断剂SB431542或Smad2小干扰RNA（Smad2-siRNA）预处理BMSCs后加入Sr,再观察p-Smad2和Runx2表达的改变。应用试剂盒检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性及钙结节水平。结果: 在大鼠BMSCs向成骨细胞的诱导分化过程中,Sr可增加p-Smad2和Runx2的表达,Sr 浓度为1 mmol/L、作用1 h时,p-Smad2表达最多;Sr 浓度为1 mmol/L、作用5 d时,Runx2表达最多;用SB431542或Smad2-siRNA预处理BMSCs后再加入Sr,不仅可以抑制p-Smad2和Runx2的表达,且ALP活性与钙结节数量也受到明显的抑制。结论: Sr可通过TGF-β1/Smad通路促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化。     

骨髓间充质干细胞复合羟基磷灰石/磷酸三钙植骨材料的体外研究

目的研究兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)在羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)植骨材料上的黏附增殖情况。方法抽取兔股骨骨髓,进行贴壁培养BMSCs。在成骨诱导液中诱导BMSCs,于7d用钙钴法检测碱性磷酸酶活性,10d进行茜素红矿化结节染色;在成脂诱导液中诱导BMSCs,于21d进行油红O染色。将BMSCs接种到HA/TCP植骨材料上,加入成骨诱导液,采用倒置显微镜、荧光显微镜及扫描电镜检测,并采用四氮唑蓝(MTT)比色法测定HA/TCP植骨材料上BMSCs的增殖情况。结果BMSCs在成骨诱导液中7d碱性磷酸酶呈强阳性,10d矿化结节染色呈橘红色;在成脂诱导液中,21d油红O染色呈阳性。BMSCs在HA/TCP植骨材料上孔隙周围及孔隙内生长良好并大量增殖。MTT分析结果显示,HA/TCP对BMSCs的体外增殖无抑制作用。结论BMSCs与HA/TCP植骨材料有良好的生物相容性。