牙髓干细胞的研究与进展

综合分析牙髓干细胞的研究现状及发展方向，以期更好地分离鉴定牙髓干细胞，提高牙髓干细胞的体外增殖活性。通过对入选文献进行分析整理，将牙髓干细胞从干细胞理论、牙髓干细胞概念、牙髓干细胞生物学特性及牙髓干细胞培养4方面进行分析。虽然目前对牙髓干细胞的生物学特性、培养方法及应用前景已有一定了解，但牙髓干细胞的体外培养扩增、鉴定和分子机制等问题尚未完全清楚，这对牙髓干细胞的应用起到决定性作用。牙髓组织取材容易，利用牙髓干细胞研究牙齿器官发育、牙髓损伤修复的分子机制，以期最终能寻找更好地解决牙髓组织损伤修复的治疗方法。     

牙髓干细胞研究进展

牙髓干细胞是来源于牙髓组织的成体干细胞,具有多向分化、高度增殖及自我更新的生物学特性,在牙髓修复、组织再生中表现出越来越重要的应用前景。本文就牙髓干细胞的概述、分离和培养方法、生物特性、相关微环境及在组织工程学中应用等研究进展作一综述。     

人骨髓间充质干细胞的分离和体外培养

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞，研究其在体外生长增殖的生物特性。方法：冲洗手术弃骨骨髓，获取骨髓闯充质干细胞进行培养，倒置相差显微镜观察细胞生长情况，绘制生长曲线，免疫细胞化学法鉴定细胞表面抗原，进行染色体核型分析。观察冷冻保存细胞复苏后的生长状况。在地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的作用下，进行成骨诱导分化。结果：原代和传代培养的细胞呈现梭形外观，具有较强的生长增殖能力；细胞CD44，CD54抗原表达阳性，CD34表达阴性。进行染色体核型分析表明是正常的人二倍体细胞。复苏细胞生物学特性无明显改变。分化细胞表现成骨细胞特性，合成碱性磷酸酶能力增强，矿化结节逐渐出现。结论：建立分离培养人骨髓间充质干细胞和研究其体外培养生物特性的方法，为通过组织工程学方法修复组织损伤奠定基础。     

表皮干细胞与毛囊干细胞生物学特性的比较

背景:获取更合适的组织工程皮肤种子细胞可使皮肤功能得到更好的修复。目的:分离、培养表皮干细胞和毛囊干细胞,并比较两种细胞的生物学特性。方法:体外分离培养2月龄新西兰兔表皮干细胞和毛囊干细胞,取生长良好的第2,3,6代细胞观察其生物学特性。结果与结论:毛囊干细胞较表皮干细胞贴壁快,具有更高的增殖活性。免疫组化及荧光定量PCR检测显示毛囊干细胞β1整合素、角蛋白19蛋白及mRNA表达均明显高于表皮干细胞。提示作为皮肤组织工程的种子细胞,毛囊干细胞较表皮干细胞更具优势。     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转染大鼠牙髓干细胞

背景：对牙髓干细胞进行稳定高效安全的体外标记是示踪技术中首先需要解决的问题,也是牙齿再生体内研究的基础。 目的：探讨慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转染大鼠牙髓干细胞的理想条件及方法,并确定其转染后是否保持干细胞特性。 方法：通过改良酶消化法获得大鼠牙髓干细胞,对其免疫表型及分化潜能进行鉴定,以感染复数为5,10,25,50和100的慢病毒载体介导绿色荧光蛋白作用24 h和48 h,倒置显微镜下检测转染率和荧光强度,并对大鼠牙髓干细胞感染前后的克隆增殖能力、细胞周期及牙向分化能力进行比较,评价感染对其生物学特性的影响。 结果与结论：流式细胞仪检测结果显示大鼠牙髓干细胞STRO-1和CD146表达阳性,CD34和CD45表达阴性,经相应诱导培养后可向成骨和成脂分化。当感染复数为50,作用时间为48 h时,转染效率最高,荧光表达最强;感染前后细胞增殖、克隆形成率及细胞周期等方面差异无显著性意义（P＞0.05）,碱性磷酸酶阳性表达。说明感染复数为50作用48 h是慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转染大鼠牙髓干细胞的理想条件,且不影响牙髓干细胞生物学特性,为大鼠牙髓干细胞的体内研究提供了可靠的示踪方法。     

脂肪间充质干细胞多向分化潜能的特征

脂肪间充质干细胞具有较强的体外增殖能力，因存在生物学特性稳定、来源充足、体外培养条件低等优势已引起各国学者的关注。在一定条件下，可成功地将其诱导为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪前体细胞、心肌细胞、神经样细胞。现阶段尚未找到脂肪间充质干细胞的特异性分子标记，对其多向分化潜能判定的公认方法是观察检测分化所得细胞的形态学变化及表面标记物的表达，基本未涉及细胞特异性功能分析。脂肪间充质干细胞凭借其多向分化潜能，是人体干细胞库潜在的重要来源，可作为多种组织工程种子细胞应用于组织缺损的修复，但多向分化潜能的科学性、重复性及安全性等问题均有待深入分析。     

人骨髓间充质干细胞的分离和体外培养

目的:分离培养人骨髓间充质干细胞,研究其在体外生长增殖的生物特性。方法:冲洗手术弃骨骨髓,获取骨髓间充质干细胞进行培养,倒置相差显微镜观察细胞生长情况,绘制生长曲线,免疫细胞化学法鉴定细胞表面抗原,进行染色体核型分析。观察冷冻保存细胞复苏后的生长状况。在地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的作用下,进行成骨诱导分化。结果:原代和传代培养的细胞呈现梭形外观,具有较强的生长增殖能力;细胞CD44,CD54抗原表达阳性,CD34表达阴性。进行染色体核型分析表明是正常的人二倍体细胞。复苏细胞生物学特性无明显改变。分化细胞表现成骨细胞特性,合成碱性磷酸酶能力增强,矿化结节逐渐出现。结论:建立分离培养人骨髓间充质干细胞和研究其体外培养生物特性的方法,为通过组织工程学方法修复组织损伤奠定基础。     

牙髓干细胞MHC分子表达与体外混合淋巴细胞的增殖

背景：若牙髓干细胞诱导分化后仍然具有与未分化时相似的免疫调节能力,则有可能为组织工程提供同种异体种子细胞来源。目的：观察牙髓干细胞表面免疫分子的表达以及体外调节淋巴细胞反应的功能。方法：从C57BL/6小鼠牙髓组织中分离获取牙髓干细胞,体外培养至第2代,流式细胞仪检测免疫分子MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达。以1×105/孔牙髓干细胞刺激异体淋巴细胞,观察细胞增殖情况。以1×105/孔数量的牙髓干细胞或经γ-干扰素作用后的牙髓干细胞加入混合双向淋巴细胞反应体系中,观察淋巴细胞增殖情况。结果与结论：牙髓干细胞表达MHC-Ⅰ类分子,但未检测到MHC-Ⅱ类分子阳性表达。γ-干扰素刺激48 h后,MHC-Ⅰ表达未见明显增高,MHC-Ⅱ类分子表达明显增高。异体或经γ-干扰素作用的牙髓干细胞均未能刺激淋巴细胞体外增殖。说明牙髓干细胞可在体外调节淋巴细胞增殖反应,有可能成为组织工程或细胞治疗中同种异体细胞来源。     

神经干细胞修复脊髓损伤

背景：神经生物学和干细胞技术的发展.使通过细胞移植增加脊髓神经数量、减少胶质瘢痕和空洞的形成成为可能。目的：复习相关文献,就神经干细胞的鉴定及特性、神经干细胞修复脊髓损伤的可能机制、临床前研究及临床应用方面进行综述。方法：以＂neural stem cells,transplant,spinal cord injury＂为英文检索词,以＂神经干细胞,移植,脊髓损伤＂为中文检索词,由第一作者检索1997/2010PubMed数据库及万方数据库有关神经干细胞鉴定、特性、神经干细胞修复脊髓损伤的可能机制、临床前研究及临床应用方面等方面的文章。排除发表时间较早、重复及类似研究,对29篇符合标准的文献进行归纳总结。结果与结论：神经干细胞有产生神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞,并替代受损的神经细胞功能等。文章从神经干细胞的鉴定及特性,神经干细胞修复脊髓损伤的可能机制,神经干细胞治疗脊髓损伤的实验研究及临床应用等方面进行了讨论。关于干细胞来源的神经元或胶质细胞移植后的长期生存及表型稳定性,以及逃脱分化及选择性程序的很少部分胚胎干细胞,可能会自在移植后的移植位点扩增并形成肿瘤等问题有待进一步解决。     

表皮干细胞在组织工程创面修复中的应用

背景:随着细胞生物学、分子生物学技术、组织工程学的快速发展,探寻组织工程化皮肤创面覆盖物的"种子细胞"的研究逐渐增多。目的:总结表皮干细胞的生物学特性,探讨其在皮肤创面修复过程中的再生作用与临床应用价值。方法:应用计算机检索CNKI和Pub Med数据库中2002-07/2011-12关于表皮干细胞修复皮肤损伤研究的文章,以"表皮干细胞,创面修复,组织工程,皮肤"或"epidermal stemcells,tissue engineering skin,wound surface"为检索词进行检索。选择文章内容与表皮干细胞修复皮肤损伤研究进展有关的文章,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。初检得到129篇文献,根据纳入标准选择28篇文献进行综合分析。结果与结论:表皮干细胞是表皮发生、分化和创面修复的基础,其正常增殖分化是维持皮肤正常组织结构和细胞内环境稳定的基本要求,也是皮肤组织工程理想的种子细胞。对烧伤、创伤等大面积皮肤缺损的治疗,对皮肤疾病的细胞疗法、基因治疗等方面都有很好的应用前景。表皮细胞的体外培养是复合人工皮肤组织工程学研究的先决条件。随着对表皮干细胞分离、纯化和培养技术的不断完善,可达到迅速构建表皮层的目的。但表皮干细胞的应用研究仍需要进一步的探索。     

酶解组织块法原代培养人牙周膜干细胞和牙髓干细胞

背景:酶解组织法是一种高效的原代细胞培养方法,利用该法可提高牙周膜干细胞和牙髓干细胞的培养成功率。目的:比较牙周膜干细胞和牙髓干细胞的原代培养成功率、细胞形态、生长特征,并对其进行多种细胞标志的鉴定。方法:取因正畸需要拔除健康牙20颗,其中16颗用于牙周膜干细胞原代培养,4颗用于牙髓干细胞培养。酶解组织块法培养两种细胞,MTT法检测两种细胞的生长曲线,利用RT-PCR法、细胞免疫组化法、细胞免疫荧光法鉴定两种细胞的标志。结果与结论:牙髓干细胞的原代培养成功率明显高于牙周膜干细胞,显示更快的生长能力。通过酶解组织法分离纯化的两种干细胞均显示正常的细胞形态和生长特征,表达相应的细胞标志CD105,CD73,波形丝蛋白vimitin,Stro-1,不表达角蛋白CK-17和CD45。提示酶解组织块法是一种高效的原代培养牙周膜干细胞和牙髓干细胞的方法。     

改良酶消化法分离培养人乳牙牙髓干细胞

背景：乳牙牙髓干细胞具有极强的增殖活力,可以在短期内获得组织工程需要的细胞量。目的：比较传统酶消化法和改良酶消化法获取人乳牙牙髓干细胞的成功率及生物学特性。方法：取无龋滞留乳切牙12颗,随机数字表法均分为两组,分别应用传统酶消化法和改良酶消化法分离获取乳牙牙髓细胞,在不同代次细胞中检测细胞扩增天数、收获量、生长曲线、倍增时间、克隆形成率、细胞表面特异标记物STRO-1、CD146、CD34和CD45的表达。细胞成骨、成脂诱导分化能力及通过检测碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白表达水平,判定细胞牙向分化潜能。结果与结论：两组细胞生长曲线,扩增天数、细胞收获量及细胞倍增时间相比,差异有显著性意义（P〈0.05）;牙向分化实验结果显示,改良酶消化法碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白较传统酶消化法和对照组而言呈强阳性表达。然而,两组在克隆形成率、细胞表面特异标记物及多项诱导分化等方面差异无显著性意义（P〉0.05）。说明改良酶消化法与传统酶消法相比,可在较短时间内完成同源乳牙牙髓干细胞体外扩增培养,可为牙齿再生治疗提供高质量种子细胞,是乳牙牙髓干细胞体外培养的可靠方法。     

不同浓度骨碎补提取液对体外培养人牙髓细胞增殖及超微结构的影响

背景:体外培养人牙髓细胞难度很大,国内外已有生长因子对体外培养牙髓细胞增殖分化作用的研究,而中药骨碎补对体外培养牙髓细胞的影响,经作者检索未见报道.目的:观察不同浓度骨碎补提取液对体外培养的人牙髓细胞增殖分化的影响.设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-03/2007-05在河北医科大学第四医院科研中心完成.材料:人牙髓细胞组织选自河北医科大学第四医院口腔科要求正畸治疗需拔除的健康阻生智齿着,取得所有供者对标本采集的知情同意.产地云南的骨碎补购自河北医科大学第四医院中药房.方法:采用组织块法体外培养人牙髓细胞.水提醇沉法提取骨碎补有效成分,以每1 mL药液含生药1 g加入积体分数为0.02的胎牛血清培养液,稀释成质量浓度为10,50,100,500,1 000 mg/L.分别以此培养液作用于体外培养的人牙髓细胞,以不加骨碎补提取液培养的细胞做对照.主要观察指标:①人牙髓细胞原代培养和来源鉴定.②四甲基偶氮唑盐法检测各质量浓度组骨碎补对人牙髓细胞增殖的作用.③免疫组织化学法观察各浓度组骨碎补对人牙髓细胞纤维连接蛋白的表达.④扫描电镜和透射电镜下观察骨碎补对人牙髓细胞超微结构的影响.结果:原代培养的人牙髓细胞呈梭形或多角形.各浓度骨碎补均对体外培养的人牙髓细胞有促增殖作用,其中以100 mg/L浓度组促增殖作用最明显,可诱导牙髓细胞合成、分泌纤维连接蛋白.电镜下实验组人牙髓细胞表面枝状嵴丰富,细胞周围可见细胞外基质,细胞浆内有丰富粗面内质网和游离的核糖体,核内常染色质均匀分散,异染色质少.结论:含1 00 mg/L骨碎补培养液对体外培养的人牙髓细胞有明显的促增殖作用.     

牙胚组织中可分离得到大量间充质干细胞

背景:已经有研究从牙髓、牙囊和牙周组织中分离得到间充质干细胞.牙胚是牙的前体,能否从中直接分离间充质干细胞,目前未知.目的:从人流产胎儿牙胚中分离间充质干细胞,检测其生物学特征.方法:无菌条件下挖出水囊流产胎儿牙床中的整个牙胚,剪碎后分别用胶原酶Ⅱ和胰酶消化,过滤除去颗粒物后,细胞悬液用培养液洗涤,培养、扩增得到贴壁细胞,进行细胞形态学观察、免疫表型测定和多向分化功能鉴定.结果与结论:经过3 次传代后,从单个胎儿牙胚中即可获得超过107 形态均匀的、梭形贴壁细胞,其表达CD105、CD73、CD90 和CD44 等表面标志,不表达CD34、CD45 标志;在体外向成骨、成脂分化,在体内可以分化为软骨细胞.提示用贴壁法可从人胎儿牙胚中分离得到大量的间充质干细胞.     

Treated dentin matrix paste as a novel pulp capping agent for dentin regeneration

Regenerating dentin and preserving pulp vitality are the two key targets for the treatment of dental pulp exposure. Calcium hydroxide (CH), the widely used capping agent, may induce potential tunnel defect in reparative dentin and cause inflammation or even necrosis in pulp tissues. This study aimed to produce a novel pulp capping agent with better bioactivities. Treated dentin matrix (TDM) paste (TDMP) was fabricated consisting of TDM powder and aqueous TDM extract. The chemical and biological characteristics of TDMP were investigated, and its effect on the odontogenic differentiation of dental pulp stem cells explored at gene and protein level; the therapeutic effect for pulp exposure in miniature swine was further verified. TDMP possessed better biocompatibility with neutral pH value, significantly promoted the proliferation of dental pulp stem cells, and enhanced the gene and protein expressions of alkaline phosphatase, bone sialoprotein, dentin sialoprotein etc., compared with CH. In vivo pulp capping using TDMP presented the formation of continuous reparative dentin bridge thicker and denser than CH group. Moreover, pulp tissues under TDMP capping sites showed relatively slight angiectasis than those induced by CH. TDMP could achieve both dentin regeneration and vital pulp conservation, and might serve as a feasible substitute for CH in dental pulp repair procedure. Copyright © 2017 John Wiley & Sons, Ltd.     

糖尿病大鼠表皮干细胞的分离培养及特性

背景:表皮干细胞作为皮肤组织特异性干细胞,在创面修复中发挥关键作用。但有关糖尿病皮肤来源的表皮干细胞体外分离培养及生物特性研究较少。目的:探索糖尿病大鼠表皮干细胞体外分离培养的方法及其生物特性,为糖尿病难愈创面的防治及机制研究提供实验依据。方法:SD大鼠随机分成糖尿病组和正常对照组。糖尿病组采用一次性腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型,正常对照组不作处理。分别取成模糖尿病和正常大鼠背部全层皮肤,采用酶消化联合Ⅳ型胶原黏附法分离培养大鼠表皮干细胞。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和细胞克隆形成,细胞计数绘制生长曲线,计算克隆形成率,免疫细胞化学染色和图像分析软件鉴定K19、β1-integrin阳性表达和测定阳性细胞的积分吸光度(IA)值。结果与结论:糖尿病组大鼠表皮干细胞原代贴壁数量较少,其克隆形成率明显低于正常对照组(P<0.01)。表皮干细胞的K19、β1-integrin均呈阳性表达,糖尿病组阳性细胞的IA值均低于正常对照组(P<0.01)。结果提示,运用酶消化联合Ⅳ型胶原黏附法可以实现糖尿病大鼠表皮干细胞的体外分离培养;糖尿病大鼠表皮干细胞体外增殖能力较正常皮肤增殖能力弱,这可能是导致糖尿病创面难愈合的重要因素之一。     

牙胚组织中可分离得到大量间充质干细胞

背景：已经有研究从牙髓、牙囊和牙周组织中分离得到间充质干细胞。牙胚是牙的前体,能否从中直接分离间充质干细胞,目前未知。目的：从人流产胎儿牙胚中分离间充质干细胞,检测其生物学特征。方法：无菌条件下挖出水囊流产胎儿牙床中的整个牙胚,剪碎后分别用胶原酶Ⅱ和胰酶消化,过滤除去颗粒物后,细胞悬液用培养液洗涤,培养、扩增得到贴壁细胞,进行细胞形态学观察、免疫表型测定和多向分化功能鉴定。结果与结论：经过3次传代后,从单个胎儿牙胚中即可获得超过107形态均匀的、梭形贴壁细胞,其表达CD105、CD73、CD90和CD44等表面标志,不表达CD34、CD45标志;在体外向成骨、成脂分化,在体内可以分化为软骨细胞。提示用贴壁法可从人胎儿牙胚中分离得到大量的间充质干细胞。     

骨组织工程中干细胞的研究与应用

背景：是否可以通过改进对已知的可以分化成骨的干细胞的培养方式或者寻找到新的干细胞,为骨组织工程找到更为合适的种子细胞.目的：从干细胞的分离培养、生物学特性及标志物等方面对各类干细胞的在骨组织工程中的应用进行综述.方法：以英文检索词为“bone tissue engineering,seed cel s,stem cel ,osteoblast differentiation”及中文检索词为“骨组织工程,种子细胞,干细胞,成骨分化”,由第一作者检索1995年至2012年PubMed 数据库及中国知网中文科技数据库,查阅近年种子细胞相关文献,最终保留50篇文献,从分离培养方法、基本特性及在骨组织工程中的应用3方面进行综述.结果与结论：文章分别对各类干细胞（包括：胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞和脐带血间充质干细胞、外周血来源的多潜能间充质干细胞、脂肪干细胞、子宫内膜基质干细胞、人羊膜基质细胞、牙髓干细胞）的分离方法、生物学特性、标志物等相关实验研究进行了探讨.目前用于分离纯化骨髓间充质干细胞的方法主要有4种：密度梯度离心法、全骨髓贴壁培养法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法.研究证实各类干细胞在特定条件下均有分化成骨的能力.