组蛋白去乙酰化酶抑制剂促大鼠胚胎干细胞向神经元分化

目的探讨组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂丁酸钠（NaB）对大鼠胚胎干细胞（ESC）向神经元分化的影响。方法利用含bFGF、EGF的DMEM／F12培养基培养原代ESC;应用DAPI染色,荧光显微镜观察不同药物浓度NaB（0．2、1、2μmol／L）作用48h后对细胞凋亡的影响;免疫荧光检测NaB（1μmol／L）作用72h后和对照组（PBS）ESC双肾上皮质激素（DCX）和DAPI,计算DCX／DAPI的比值;免疫印迹检测不同浓度NaB（0．2、1、2μmol／L）作用48h后和对照组（PBS）ESC组蛋白H3、H4乙酰化水平。结果在1、2／μmol／LNaB组ESC出现明显凋亡,细胞形状不规则,核固缩,核内可见致密的颗粒荧光,视野下细胞碎片较多,且凋亡细胞百分比明显高于0．2μmol／LNaB组和对照组[（7．85±0．73）％、（18．42±2．04）％比（3．48±0．35）％、（2．16±0．32）％,均P〈0．05]。1μmol／LNaB组ESCDCX／DAPI比值高于对照组（38．51±4．33比14．81±1．77,P〈0．05）。随NaB药物浓度的增加,ESC蛋白H3、H4乙酰化程度较对照组增强,0．2±mol／L组处理后乙酰化组蛋白H3和H4表达变化不明显,1、2μmol／L时组蛋白H3和H4乙酰化程度明显增高（均P〈0．05）。结论HDAC抑制剂NaB可明显促使ESC向神经元分化。     

70 mer长寡核苷酸探针芯片制备、标记方法及杂交条件的优化

目的优化长片段寡核苷酸芯片制备、探针标记及杂交条件。方法通过直接标记方法优化芯片的点样浓度、点样后的固定方法。探索两种靶基因标记方法,并优化杂交液及各种杂交条件。结果采用70mer寡核苷酸探针,点样浓度在10μmol/L时就可获得满意的荧光强度。探针点样后37℃水合,然后在3600mJ条件下进行紫外交联固定效果最好。样品采用生物素间接标记较CY3直接标记信号强度强,成本相对低廉。优化出的杂交液成分:50%甲酰胺、5×SSC、0.5%SDS,杂交时间为8h,杂交温度为65℃。结论通过此试验优化了制备病原体长探针寡核苷酸芯片的制备方法,样品标记策略和杂交液及杂交温度,为下一步制备多种病原体的寡核苷酸芯片检测系统奠定了基础。     

氨氯地平对大鼠心室肌细胞动作电位及细胞内钙离子浓度的影响

目的探讨不同旋体氨氯地平（Aml）对Spraque—Dawley大鼠心室肌细胞动作电位（AP）及细胞内钙离子浓度的影响。方法采用酶消化法获得大鼠耐钙心室肌细胞，以全细胞膜片钳技术分别记录加入0．1、0．5、1、5和10μmol／L左旋、右旋和混旋Aml后大鼠心室肌细胞AP的变化。并用荧光探针Fura-2／AM测定细胞内钙离子浓度，比较1、5、10、50和100μmol／L左旋、右旋和混旋Aml对细胞内钙离子浓度的影响。结果①加入0．1、0．5、1、5和10μmol／L左旋、右旋和混旋Aml后，AP最大上升速率、AP幅度和超射无明显变化（P〉0．05）。②加入0．1、0．5、1、5和10μmol／L左旋后，50％的AP时程（APD50）分另0为（36．2±8．2）、（33．9±7．7）、（30．2±6．8）、（22．6±5．1）和（15．1±3．4）ms（P〈0．05）；加入混旋Aml后，APD。分别为（39．2±9．2）、（36．7±7．9）、（33．8±7．2）、（25．4±5．9）和（21．7±5．2）ms（P〈0．05）；加入右旋Aml后，APD50分别为（45．1±11．3）、（46．2±10．8）、（44．9±7．3）、（44．8±8．2）和（45．7±9．4）ms（P〉0．05）。③左旋Aml和混旋Aml可降低细胞内钙离子浓度，不同浓度右旋Aml对细胞内钙离子浓度无影响。结论左旋Aml和混旋Aml对L-型钙通道有阻滞作用，从而缩短APD，而右旋Aml对L-型钙离子通道无阻滞作用，因而对APD无影响。     

靶控输注麻醉方式对腹腔镜胆囊切除术患者应激反应的影响

目的探讨靶控输注丙泊酚联合瑞芬太尼麻醉方式对腹腔镜患者应激反应的影响。方法行腹腔镜手术患者90例分为：A组（40例）靶控输注丙泊酚（血浆靶浓度3μg／mL）联合瑞芬太尼（血浆靶浓度3ng／mL）;B组（26例）单纯靶控输注丙泊酚（血浆靶浓度3μg／mL）;C组（24例）静脉泵入丙泊酚0．2-0．6mg·kg^-1·h^-1。比较各组患者麻醉前（哟）、诱导成功后（T1）、气腹后30min（T2）、术毕时（33）、术后24h（T4）生命体征,包括心率（HR）、平均动脉压（MAP）、动脉血氧饱和度（SpO2）、呼气末二氧化碳分压（PET CO2）;反应机体应激反应指标包括血清皮质醇（COR）、白细胞介素-6（IL-6）、C反应蛋白（CRP）、血糖（GLU）。结果A组、B组患者HR、MAP、SpO2、PET CO2在麻醉过程中无显著改变（P〉0．05）。C组HR在麻醉后呈升高趋势,MAP呈下降趋势,SpO2在T1、T2时相均显著低于阳（P〈0．05）;PET CO2在麻醉后各时相较T0显著增高（P〈0．05）。A组HR、MAP在T1-T4各时相与C组相比有显著差异（P〈0．05）;SpO2在T1、T12均显著高于C组（P〈0．05）;PET CO2在T1-T3均显著低于C组（P〈0．05）。COR、IL-6、CRP、GLU在A组各时相均无显著差异,B组在T2、T3、T4各时相较T0显著增高（P〈0．05）;C组在T1-T4各时相较11D均显著增高（P〈0．05）;A组IL-6、CRP、GLU在T2、T3均分别低于B组和C组（P〈0．05）。A组术后苏醒时间显著低于B组和C组（P〈0．05）。A组术后出现恶心、呕吐比例（12．50％）显著低于B组（23．08％）和C组（33．33％）,P〈0．01。结论丙泊酚联合瑞芬太尼靶控输注麻醉能够维持腹腔镜胆囊切除术患者的血流动力学稳定,减少CO2气腹造成的损伤,减少机体的应激反应,术后苏醒快,并发症少,是腹腔镜胆囊切除术的安全可靠的麻醉方式。     

不同浓度舒芬太尼联合丙泊酚靶控输注对麻醉深度的影响及相应EC50和脑BIS50的测定

目的观察不同浓度舒芬太尼联合内泊酚靶控输注（TCI）对脑电双频谱指数（BIS）的影响，测定意识丧失及体动反应消失时相应丙泊酚将就室浓度（EC50）和BIS50的值。方法择期全麻手术女性45例（ASAⅠ～Ⅱ级），病例来自广州医学院附属市一人民医院，随机分为A、B、C3组，每组15例，分别以舒夯太尼0、0．12、0．24μg／L作持续靶控输注，6rain后3组皆以0．6mg／L启动丙泊酚靶控，并按0．3mg／L递增丙泊酚。记录BIS基础值、舒芬太尼达效应室浓度后的BIS值、丙泊酚递增后的BIS和警觉镇静评估法（OAA／S）评分及挤压三角肌反应；丙泊酚效应室浓度为0．9、1．5、2．1mg／L时，挤压三角肌后BIS的增加量；丙泊酚注射痛情况；测定意识丧失及体动反应消失时相应的EC50、EC95、BIS50、BIS95结果B、C组BIS值在舒芬太尼输注前后变化差异无统计学意义（P〉0．05）。意识丧失时A、B、C组的内泊酚EC50／EC95分别为1．9／2．4、1．6／2．1、1．4／1．9mg／L；BIS50／BIS95分别为64／55、69／61、72／59。体动反应消失时A、B、C组的丙泊酚EC50／EC95分别为3．0／3．7、1．4／2．0、0．9／1．4mg／L；BIS50／BIS95分别为49／40、74／62、84／75。丙泊酚EC为0．9、1．5、2．1mg／L时，三角肌挤压刺激的BIS增加量，A组与B、C组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。丙泊酚注射痛发生率A组明显高于C组（P〈0．05）：结论舒芬太尼0．12μg／L、0．24μg／L靶控不会引起BIS值显著变化，而与丙泊酚联合使用时可降低意识丧失、体动反应消失时的丙泊酚EC50同时相应BIS50有所上升；且舒芬太尼可以明显降低刺激所导致的BIS增加量，减少丙泊酚注射痛现象。     

p38及PI3K在结核杆菌抗原再刺激诱导人γδT细胞凋亡信号转导中的作用

目的：建立结核杆菌抗原（Mtb-Ag）再刺激活化的人γδT细胞凋亡模型；应用信号分子阻断剂观察p38及PI3K信号传导途径在Mtb-Ag再刺激诱导γδT细胞凋亡中的作用。方法：用3种浓度Mtb-Ag分别再刺激培养15～25天的Mtb-Ag激活的人T细胞（MtbAT）24小时后，应用Annexin-V-FITC／PI染色流式细胞术（FCM）检测γδT细胞凋亡；用Mtb-Ag（10．0μg／ml）分别再刺激MtbAT3、6、12和24小时后，观察γδT细胞凋亡情况；预先用SB203580（p38途径抑制剂）及LY294002（PI3K途径抑制剂）分别处理MtbAT60分钟，观察Mtb-Ag（10．0μg／m1）再刺激3小时后γδT细胞凋亡情况。结果：与对照组相比，10．0和20．0μg／ml MtbAg均显著诱导γδT细胞凋亡（P〈0．01），凋亡细胞比例分别增加35．63％及38．83％，且此二种浓度MtbAg在诱导γδT细胞凋亡方面无显著性差异（P〉0．05）；与对照组相比，10．0μg/ml Mtb-Ag再刺激MtbAT3、6、12和24小时均可显著诱导γδT细胞凋亡（P〈0．01），凋亡细胞比例在44．21％～51．76％之间；且Mtb-Ag再刺激MtbAT3小时实验组与再刺激MtbAT 24小时实验组相比，在诱导γδT细胞凋亡方面无显著性差异（P〉0．05），后者的凋亡细胞比例仅比前者增加7．55％；Mtb-Ag再刺激诱导γδT细胞凋亡可被SB203580（80．0μmol／L）及LY294002（10．0μmol／L）抑制，凋亡抑制率分别为91．6％及43．1％。结论：采用Mtb-Ag（10．0μg／m1）再刺激活化的γδT细胞3小时的方法，可建立Mtb-Ag再刺激活化的人γδT细胞凋亡模型；信号分子阻断剂的实验证明，p38途径及PI3K途径均参与了Mtb-Ag再刺激已活化γδT细胞凋亡过程。     

APC基因甲基化定量检测芯片的建立

目的 建立抑癌基因APC（adenomatous polyposis coli，APC）启动子1A的甲基化定量芯片检测方法。方法选取一段420bp的APC基因启动子1A CpG密集序列作为靶序列，针对M0、M1、M2、M3、M4 5个CpG靶位点，设计一套检测甲基化与非甲基化的探针。采用脐带血DNA克隆体作为阴性、阳性质控品。结果甲基化阳性、阴性质控的芯片结果与测序吻合。每组探针中荧光强度由强至弱依次为，阳性质控（甲基化）：探针1〉2、3〉4；阴性质控（非甲基化）：探针3〉4、1〉2。5个位点的5条荧光强度标准曲线，尺。范围是0．93～0．99。M0、M1、M2、M3、M4 5个位点甲基化杂合型的检测范围分别为50．0％±3．6％、50．0％±6．9％、50．0％±3．5％、50．0％±8．5％、50．0％±7．3％。结论建立了APC基因启动子5个COG位点的甲基化定量检测芯片。     

高性价比寡核苷酸基因表达谱芯片的制备方法

目的探讨探针长度对寡核苷酸(Oligo)基因芯片杂交信号的影响。方法以大肠杆菌基因表达信息作为实验模型,根据已有大肠杆菌全基因组芯片数据选择覆盖高、中、低杂交信号强度的20个大肠杆菌基因,针对该20个基因分别设计59-mer和70-mer长度Oligo探针,并将2种探针点制在同一张芯片中,同时设阳性对照探针和阴性对照点样液。提取大肠杆菌RNA,经过反转录、扩增、荧光标记后与芯片进行杂交反应,采用激光共聚焦扫描仪扫描芯片,利用数据分析软件提取探针的杂交信号值并进行显著性分析。结果大肠杆菌28SrRNA和18SrRNA条带清晰,无降解带出现,质量合格。芯片杂交结果显示59-mer和70-mer长度探针的杂交效率和杂交信号差异无统计学意义(P=0.9810),阳性对照探针出现阳性杂交信号,阴性对照点样液未检测到杂交信号,符合质控要求。结论59-mer长度探针可用来制备Oligo基因芯片,这不仅降低了基因芯片制作成本,而且将推动基因芯片技术更为普及的应用。     

米非司酮对人羊膜上皮细胞水通道蛋白8表达的影响

目的观察米非司酮对人羊膜上皮细胞水通道蛋白8（AQP8）表达的影响,探讨药物调控羊膜上皮细胞AQP8表达的可行性。方法将体外培养的人羊膜上皮WISH细胞分为不同浓度米非司酮作用48h组和单一浓度米非司酮作用不同时间组,前者培养基中分别加入终浓度为0．1、1、5、10、15μmol／L的米非司酮,培养48h;后者培养基中加入终浓度为10μmol／L的米非司酮,分别培养6、12、24、36、48h,同时2组均设加入含0．01％二甲基亚砜（DMSO）完全培养液的对照组。采用免疫荧光细胞化学方法检测10μmol／L米非司酮作用48h后细胞AQP8蛋白的分布;RT-PCR和蛋白质印迹技术分别检测不同浓度米非司酮作用组和米非司酮作用不同时间组各组细胞AQP8mRNA和蛋白的表达水平。结果免疫荧光细胞化学检测显示,米非司酮作用后WISH细胞细胞质内及细胞膜上AQP8蛋白黄绿色荧光信号较对照组均明显减弱。在不同浓度米非司酮作用组中,除0．1μmol／L组外,其余各组细胞的AQP8mRNA和蛋白表达水平分别与对照组相比均明显减弱（均p〈0．01）,而0．1、1、5、10μmol／L组细胞的AQP8mRNA表达水平和1、5、10μmol／L组细胞的AQP8蛋白表达水平分别与15pmol／L组比较,差异均有统计学意义（均P〈0．05）。在米非司酮作用不同时间组中,除6h组外,其余各组细胞的AQP8mRNA和蛋白表达水平分别与对照组相比均明显减弱（均P〈0．01）,而6、12、24、36h组细胞的AQP8mRNA和蛋白表达水平分别与48h组比较,差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论米非司酮对人羊膜上皮细胞AQP8mRNA和蛋白的表达具有抑制作用。     

二丁酰环磷酰苷和氨茶碱对PC12细胞缺氧葡萄糖剥夺保护作用初探

目的探讨二丁酰环磷酰苷（db—cAMP）和氨茶碱分别作用以及联合用药对缺氧葡萄糖剥夺（oxygen—glueose deprivation,OGD）条件下大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞活性和凋亡的影响。方法采用OGD方法建立体外培养的PC12细胞缺氧缺血模型。将PC12细胞分为正常对照组和OGD组,OGD组又分为未用药组,氨茶碱组,db—cAMP组和联合用药组（氨茶碱和db—cAMP）。用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法观察不同药物和不同加药时间（0h,1h,2h,4h,8h,16h）对OGD后PC12细胞活性影响;用Hoechst33342荧光染料测定细胞凋亡。结果经OGD4h后,OGD组与正常组相比细胞活性降低和凋亡率增加（P〈0．05）,db—cAMP 1×10^-4μmol／L组与未用药组相比细胞活性增高,凋亡率减低（P〈0．05）;氨茶碱5×10^-2μg／L组与未用药组相比细胞活性和凋亡率无明显差别（P〉0．05）;3×10^-2μg／L氨茶碱和1×10^-5μmol／L的db—cAMP联合用药组与未用药组相比细胞活性增高,凋亡率减低（P〈0．05）;联合用药组与1×10^-4μmol／L的db—cAMP组相比细胞活性和凋亡率无明显差异（P〉0．05）;OGD损伤后4h内加药组较未用药组细胞活性明显增加（P〈0．05）,8h以后加药组与1h和2h加药组相比活性明显降低（P〈0．05）。结论提示db—cAMP对缺氧缺血损伤有保护作用,氨茶碱和db—cAMP两药联合使用有协同作用,OGD损伤后4h内给药可提高细胞活性,其中1—2h内给药效果最好。     

基因芯片技术在关节软骨研究中的应用进展

基因芯片通常指DNA芯片,其基本原理是将指大量寡核苷酸分子嗣定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过芯片扫描检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片能对微量样品中的核苷酸序列进行检测和分析,其高通量、快速、并行化采集生物信息的特点均优于其他传统基因检测技术,故已广泛应用于医学各领域研究。将近年来基因芯片技术在关节软骨生物学特性、形成及发育、损伤与修复、退变及再生等领域的应用进行综述：     

Genotyping on a thermal gradient DNA chip

Silicon-based chips with discrete, independently temperature-controlled islands have been developed for use in DNA microarray hybridization studies. Each island, containing a heater made of a diffusion layer and a temperature sensor based on a p-n junction, is created on a silicon dioxide/nitride surface by anisotropic etching. Different reactive groups are subsequently added to the surface of the islands, and allele-specific oligonucleotide probes are attached to discrete spots on the chip. Hybridization is performed with Cy5-tagged single-stranded targets derived by PCR from genomic DNA. Results are assessed by measuring fluorescence of bound dye-tagged targets after hybridization and washing. Temperatures at each island can be set at different values to obtain optimal distinction between perfect matches and mismatches. This approach facilitates definition of optimal temperatures for probe/target annealing and for distinction between perfectly matched versus mismatched solution-phase targets. The thermal gradient DNA chips were then tested for genotyping, and the results for four different loci in two genes are presented. Unambiguous typing was achieved for clinically relevant loci within the factor VII and hemochromatosis genes.     

6种中药单体对人孕烷X受体介导细胞色素酶P450 3A4转录的调节作用

目的研究6种中药单体野黄芩苷、丹皮酚、芍药苷、甘草苷、黄芪甲苷以及黄芩素是否可以通过诱导孕烷X受体（PXR）介导细胞色素酶P4503A4（CYP3A4）转录表达。方法采用脂质体瞬时转染的方法,将人PXR表达质粒、CYP3A4报告质粒以及内参质粒转入LS174T细胞中,建立报告基因体系,与不同浓度及不同给药时间的中药单体共同孵育,检测细胞中荧光素酶的活性。结果黄芩素（20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L）分别诱导PXR介导CYP3A4表达（1.49±0.23）倍（P〈0.05）、（2.45±0.56）倍（P〈0.01）和（5.27±0.40）倍（P〈0.01）,野黄芩苷、丹皮酚、芍药苷、甘草苷和黄芪甲苷在实验的浓度范围内不能明显诱导LS174T细胞中PXR介导CYP3A4表达。在不同给药时间实验中,20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L的黄芩素在12～48h能诱导PXR介导CYP3A4表达,诱导能力随时间的延长而呈增强的趋势,各浓度的最大诱导倍数均在48h出现。结论黄芩素在LS174T细胞系中可以通过诱导PXR介导CYP3A4转录表达,而野黄芩苷、丹皮酚、芍药苷、甘草苷或黄芪甲苷无此作用。     

基因芯片在宫颈癌、卵巢癌和乳腺癌相关基因表达研究中的运用

目的 应用基因微矩阵芯片筛查妇科恶性肿瘤相关基因表达。方法 分别提取癌组织和正常对照组织mRNA，分别用Cv3—dCTP和Cy5—dCTP经反转录荧光标记cDNA，获得两组探针，将探针混合后与基因芯片H40s(基因点数为4096点，上海联合基因公司提供)杂交，经严格洗片后用GenePix4000B扫描仪进行扫描，获得荧光信号图像，GenePixPro3．0图像处理软件对图像进行处理，获得两种组织中差异表达的基因信息。结果 在子宫颈癌组织中差异表达的基因24．61％(1008／4096)，其中表达降低(下调趋势)占11．28％(462／4096)；表达增高(上调趋势)占13．32％(546／4096)。在卵巢癌组织中差异表达的基因24．02％(984／4096)，其中表达降低(下调趋势)占12．67％(519／4096)，表达增高(上调趋势)占11．35％(465／4096)；在乳腺癌组织中差异表达的基因占9．67％(396／4096)，其中表达降低(下调趋势)占4．59％(188／4096)，表达增高(上调趋势)的5．08％(208／4096)。在3种癌组织中同时出现表达差异的基因有1．37％。结论 子宫颈癌、卵巢癌和乳腺癌有多种基因表达失衡。     

经尿道前列腺电切术后老年患者自控-靶控舒芬太尼镇痛的安全性和有效性

目的 研究经尿道前列腺电切(TURP)术后老年患者应用自控-靶控舒芬太尼镇痛的安全性和有效性。方法 选择择期行TURP老年患者60例，随机分成4组。Ⅰ组：自控-靶控镇痛(PCATCI)模式，设置舒芬太尼初始血浆靶浓度(Cp) 0.06μg/L，最低有效Cp 0.04μg/L。Ⅱ组：PCA-TCI模式，设置舒芬太尼初始Cp 0.08 μg/L，最低有效Cp 0.05μg/L。Ⅲ组：PCA-TCI模式，设置舒芬太尼初始Cp 0.10 μg/L，最低有效Cp 0.05μg/L。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组药液配置相同：舒芬太尼（sufentanil）Ⅰ mg/L。Ⅳ组（对照）：吗啡硬膜外自控镇痛(PCEA)，药液0.06％吗啡+0.2％罗哌卡因，用负荷剂量+持续输注+PCA(LCp)模式。4组患者术后均待腰麻感觉阻滞平面下降至T10后开启镇痛装置，监测其启动前及启动后各时点的视觉模拟评分(VAS)、Ramsay镇静评分、术后运动恢复时间（改良Bromage评分）、舒芬太尼Cp、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、心率(HR)、脉搏血氧饱和度(SpO2)、呼吸频率(RR)和患者对该镇痛装置的综合满意度；记录按压次数(D1)与实际进入次数(D2)、肛门排气时间、不良反应及24h用药总量。结果4组患者均获得满意的镇痛效果。在相同时间点的Ramsay镇静评分4组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；在相同时间点的VAS评分和D1，D2值在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组组间比较差异无统计学意义(P＞0.05),Ⅰ组1、2、4h时点VAS评分较高(P＜0.05)。所有患者24h内均有肛门排气，Ⅰ组为(16.5±3.9)h,Ⅱ组为( 16.2±3.8)h,Ⅲ组为(16.8±4.1)h，均较IV组的(19.1±2.5)h时间缩短(P＜0.05)。Ⅰ、Ⅱ组用药量相似[(36.7±5.1)μg和(37.8±4.7)μg,P＞0.05]，Ⅲ组用药量[(42.3±5.6) μg]比Ⅰ、Ⅱ组高(P＜0.05)。各组不良反应发生率相似(P＞0.05)。结论 舒芬太尼PCA-TCI用于老年患者TURP术后镇痛安全有效。其设置舒芬太尼初始Cp为0.08μg/L，最低有效Cp为0.05 μg,/L时，VAS评分较低，用药量较少，且有利于患者循环功能的稳定。     

Hybridization analysis of chrysanthemum stunt viroid with complementary DNA and the quantitation of viroid RNA sequences in extracts of infected plants

In order to develop a method for the quantitation of viroids in extracts of infected plants by hybridization analysis with labeled complementary DNA (cDNA), the kinetics of hybridization of chrysanthemum stunt viroid (CSV) with [32P]cDNA were investigated. Two buffer systems were used, each with a total cation concentration of 0.19 M, with one containing no formamide (Buffer A) and the other 40% (v/v) formamide (Buffer B). Initial experiments with Buffer A at 60 degrees showed that the rate of hybridization of [32P]cDNA was slowest with the circular form of CSV, fastest with nuclease S(1)-treated CSV, while linear CSV gave an intermediate rate. This variation in rate was considered to reflect the variation in residual secondary structure of the three forms of CSV under the conditions used. By contrast, the three forms of CSV hybridized with [32P]cDNA at essentially the same rate in Buffer B at 50 degrees , conditions under which no viroid secondary structure remained. A linear relationship was observed between the temperature of hybridization and the log R (0)t (1 2 ) of cDNA:RNA hybrids formed in both buffer systems; the rate of hybridization decreased 50-fold as the hybridization temperature was decreased from 10 to 25 degrees below the T(m) of the hybrids. No such relationship was found when similar experiments were carried out using chrysanthemum 7 S RNA and the satellite RNA of cucumber mosaic virus. The optimal hybridization conditions of Buffer B at 50 degrees were chosen to quantitate the levels of CSV in CSV-infected chrysanthemums and Gynura aurantiaca; from the concentrations found in partially purified nucleic acid extracts of these plants, it was calculated that CSV sequences were present at 1.65 and 0.095 mg/kg of plant material, respectively.     

Detection of Pseudomonas pseudomallei by PCR and hybridization.

A molecular method for the detection of Pseudomonas pseudomallei was developed on the basis of the differences in the 23S rRNA sequences of related species of the genus Pseudomonas. An 18-base oligonucleotide probe, designed following partial sequencing of 23s ribosomal DNA (rDNA), was used for the identification and detection of P. pseudomallei either by hybridization or by direct PCR. Optimal detection was obtained by hybridization of the probe with PCR-amplified rDNA rather than with total genomic DNA or colony blots. One nanogram of template DNA amplified in a PCR mixture containing 14% glycerol could be detected in slot blots hybridized with the digoxigenin-labelled probe and the lumigen PPD detection system. Amplified rDNA sequences from 41 P. pseudomallei strains of various origins hybridized with the probe. The probe also hybridized with three Pseudomonas mallei reference strains under conditions of high stringency but failed to hybridize with amplified rDNA sequences from other closely related Pseudomonas spp. PCR with a conserved primer and the 18-base oligonucleotide probe (direct PCR) specifically amplified P. pseudomallei and P. mallei. By using these methods, approximately 10(4) P. pseudomallei cells per ml could be detected in artificially inoculated blood samples and in blood dried on filter paper following Chelex extraction. The detection limit in blood was increased to 10(2) cells per ml by concentration of bacteria from 0.5 ml of blood or by a 24-h blood culture enrichment prior to PCR. Approximately 10(3) cells per ml were detected in seeded sputum samples. The detection times by direct PCR and indirect PCR and then probe hybridization were approximately 5 h and 24 h, respectively. These results indicate that amplification of conserved rDNA sequences by PCR directly or by hybridization with a probe to PCR fragments offers promise for the detection of P. pseudomallei and P. mallei.     

Characterization of human rotavirus strains with G12 and P[9] detected in Japan

Two G12 human rotavirus strains, CP727 and CP1030, were isolated from the respective diarrheic stools of an infant and an adult in Japan. VP7 gene sequences of strains CP727 and CP1030 showed high identity with that of the G12 prototype strain L26, and with those of G12 strains reported recently from Thailand, the United States, and India. VP4 gene sequences of strains CP727 and CP1030 showed the highest identity with those of P[9] rotaviruses. In Northern blot hybridization, strains CP727 and CP1030 were found to be closely related to strain AU-1 (G3P[9]); nine RNA segments hybridized to each other. Moreover, all segments each of the two Japanese G12 strains hybridized to those of the Thai G12 strain T152. These results suggest that Japanese G12 strains detected in this study are reassortants between a L26-like strain and a strain in the AU-1 genogroup. A similar reassortant was found in the Thai G12 strain T152.     

舒芬太尼自控-靶控镇痛对腰麻患者呼吸功能和镇静程度的影响

目的 研究舒芬太尼自控.靶控(PCA-TCI)镇痛对腰麻患者呼吸功能和镇静程度的影响,以评价舒芬太尼PCA-TCI的安全性. 方法 选择择期下肢手术患者60例[美国麻醉学家学会(ASA)分级Ⅰ～Ⅱ级],年龄20～59岁,体重50～80 kg,随机分成3组:Ⅰ组为舒芬太尼设定靶控血浆浓度0.1μg/L,Ⅱ组为0.15μg/L,Ⅲ组为0.2 μg/L,每组20例.腰麻平面固定第10胸椎(T10)水平后,连接PCA-TCI系统输注药物.观察PCA-TCI启动前(T0)、启动后5(T1)、10(T2)、15(T3)、20(T4)、25(T5)、30(T6)、35(T7)、40(T8)、45 min(T9)各时点PCA-TCI程序预算的舒芬太尼血浆浓度(C'p)、脉搏氧饱和度(SpO2)、呼吸频率(RR)、潮气量(VT)、呼气末二氧化碳分压(PETCO2)、第1秒呼气率(FEV1%)、吸入-呼出氧浓度差(O2I-E)、顺应性环(PV环)、心率(HR)、平均动脉压(MAP)等呼吸力学和循环参数及脑电双频指数(BIS)和警觉.镇静评分(OAA/S). 结果 舒芬太尼PCA-TCI启动后,与T0比较,3组患者呼吸功能的各项指标均有不同程度的变化,其中VT增减的幅度为-10.0%～11.3%,但与T0时比较差异无统计学意义(P>0.05).Ⅰ组患者在T4和T7时RR均降低18.2%(P<0.05),而Ⅱ组则分别降低17.4%和16.0%(P<0.05),Ⅲ组患者在T7和T8时RR降低21.7%和23.1%(P<0.05).Ⅰ组和Ⅱ组FEV1%有所降低,但与T0比较,差异无统计学意义(P>0.05),而Ⅲ组则在T7和T8时分别下降15.8%和18.5%(P<0.05).Ⅰ组、Ⅱ组患者PETCO2较T0时略有升高(P>0.05),而Ⅲ组在T7和T8时分别升高17.9%和18.6%(P<0.05).Ⅲ组患者T3～T9时,BIS降低7.2%～9.8%,OAA/S评分均大于3,与T0时比较,差异有统计学意义(P<0.05),而Ⅰ组、Ⅱ组BIS与OAA/S评分无明显变化(P>0.05). 结论 舒芬太尼PCA-TCI血浆靶浓度为0.1～0.15μg/L时对患者无明显呼吸抑制,其血浆浓度达0.21μg/L时有轻度镇静作用,且10%的患者有呼吸抑制现象.舒芬太尼PCA-TCI安全有效的临床推荐血浆靶浓度为0.1～0.15μg/L.