RNA干扰抑制Nogo-A基因表达对PC12细胞多巴胺释放的影响

目的 研究Nogo-A基因沉默对PC12细胞多巴胺释放的影响.方法 构建靶向Nogo-A的短发夹样RNA(shRNA)真核表达载体,并经脂质体转染PC12细胞,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法检测对Nogo-A mRNA及蛋白的抑制效应.采用高效液相色谱仪(HPLC)检测转染前后多巴胺释放的变化.结果 将重组质粒转染到PC12细胞48h后,Nogo-A基因表达明显受抑、多巴胺释放量减少.结论 Nogo-A可能参与PC12细胞多巴胺的释放.     

siRNA和shRNA在syt基因沉默中的一致性

目的通过小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)和短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对PC12细胞中Synaptotagmin(syt)基因表达沉默效果的比较,确认siRNA在基因沉默中与shRNA的等效性.方法用T7 RNA聚合酶体外合成的针对syt Ⅰ与Ⅸ的siRNA和在H1.1载体上构建的shRNA表达质粒转染PC12细胞,用标记荧光蛋白和免疫荧光检测shRNA和siRNA的转染率,用Western印迹方法检测沉默效果.结果siRNA和shRNA在PC12细胞中沉默syt Ⅰ和Ⅸ的表达时,有一致的沉默效率.结论siRNA可作为基因沉默中快速筛选的工具,可在RNA干扰的应用中与shRNA 配合使用.     

STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用.方法:根据siRNA设计原则, 结合pSilencer2.1-U6-neo质粒特点, 针对STAT3基因设计并合成两条寡聚DNA片段, 退火后克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒, 脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞.RT-PCR和Western blot检测SiHa细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平;MTT法和流式细胞术(FCM)检测细胞的增殖和凋亡.结果:成功构建了STAT3基因shRNA真核表达载体, 转染人宫颈癌SiHa细胞.细胞STAT3蛋白及mRNA表达下降;同时SiHa细胞增殖能力下降, 细胞凋亡增加.结论:构建的STAT3基因shRNA真核表达载体能够通过下调STAT3基因表达, 抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖能力, 诱导细胞凋亡.     

RNA干扰MAGEA3对人肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人肝癌细胞中黑色素瘤相关抗原A3(MAGEA3) 的表达和对肝癌细胞凋亡的影响。 方法:构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，采用脂质体介导的方法将其转染到人肝癌细胞(mel-ed1)中，用Western印迹法、RT-PCR检测MAGEA3基因在肝癌细胞中的表达；通过原位末端标记TUNEL法、DNA片段化及Annexin V /PI双标记法检测，观察其对肝癌细胞凋亡的影响。 结果:成功构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的MEL-ED1细胞中MAGEA3基因表达显著抑制(90%)。与对照组比较, pSilencer-MAGEA3转染组肝癌细胞培养 48 h 后,DNA片段化检测出“DNA ladder”、TUNEL法显示细胞典型凋亡特征, Annexin V /PI双标检测转染组细胞凋亡率为21.41%±1.98%,明显高于pSilencer-neo 空载体转染组和未转染组(P<0.01)。 结论:MAGEA3小发夹RNA质粒载体可显著抑制MEL-ED1细胞中的MAGEA3基因的表达,促进肝癌细胞的凋亡, MAGEA3基因具有抑制凋亡的作用。该研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

RNAi介导Caspase-3基因及其抑制LPS诱导肾脏上皮细胞凋亡的研究

目的：探讨RNA干扰Caspase-3基因及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的作用效果。方法：构建针对大鼠Caspase-3基因编码区的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体质粒pRNAT—U6．1-Caspase-3shRNA，用电穿孔法转染RK3E细胞，经G418筛选后，形成稳定的表达Caspase-3shRNA的细胞系。实验分为3组：①正常对照组：未转染的RK3E细胞；②阴性对照组：转染空载体pRNAT-U6．1的RK3E细胞系；③实验组：转染Caspase-3shRNA的RK3E细胞系。经脂多糖（LPS）孵育12小时后，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，RT-PCR检测mRNA的表达，以及各组Caspase-8蛋白的活性。结果：与正常对照组和阴性对照组相比，实验组的细胞凋亡率显著降低（P〈0．01），Caspase-3的mRNA水平和蛋白活性显著降低（P〈0．01）。结论：针对Caspase-3的特异性短发夹RNA可以明显引起靶基因的沉默，进而抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的发生。     

沉默Apaf-1 基因对氧糖剥夺/ 复氧复糖PC12 细胞线粒体凋亡通路的影响

目的:探讨RNA干扰沉默Apaf-1基因对氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路的影响。方法:PC12细胞随机分为3组:正常组(Control)、模型组(Model)、Apaf-1基因沉默组(Apaf-1-siRNA)。正常组于CO2培养箱内正常培养,其余2组给予氧糖剥夺2 h、复氧复糖24 h处理,Apaf-1-siRNA组于造模前将化学合成的siRNA通过脂质体转染于PC12细胞靶向沉默Apaf-1基因。用荧光标记的siRNA检测Apaf-1转染效率,Western blot检测转染后PC12细胞Apaf-1蛋白表达,CCK-8检测细胞存活率,TUNEL染色检测细胞凋亡指数,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光染色检测Bax/Bcl-2比值,Western blot检测线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达。结果:Apaf-1-siRNA可有效沉默PC12细胞Apaf-1蛋白表达(P<0.05)。与Control组相比,Model组细胞存活率明显降低(P<0.05),细胞凋亡指数和凋亡率显著升高(P<0.05),Bax/Bcl-2比值升高(P<0.05),线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达显著升高(P<0.05);与Model组相比,Apaf-1-siRNA组细胞存活率显著升高(P<0.05),细胞凋亡指数和凋亡率显著降低(P<0.05),Bax/Bcl-2比值降低(P<0.05),Apaf-1、caspase-9、caspase-3蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论:靶向沉默Apaf-1基因可有效降低氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达,抑制细胞凋亡,提高细胞存活率。     

Survivin特异小干扰RNA表达载体构建及对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的测定Survivin特异小干扰RNA(siRNA)表达载体对肺腺癌细胞A549 Survivin基因表达的抑制及对增殖和凋亡的影响。方法构建Survivin特异性小干扰RNA表达载体,转染A549细胞,筛选出稳定表达的细胞株。用荧光实时定量反转录聚合酶链反应法、Western blot和免疫组化法检测Survivin基因mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果经测序鉴定证实成功构建Survivin-siRNA表达载体。Survivin基因mRNA表达量下降76.4%,Western blot显示蛋白表达下降84.5%,免疫组化法也显示Survivin蛋白表达下降。MTT法测定细胞增殖较对照组减慢(P<0.01),细胞凋亡率较对照组增加8.95%(P<0.01)。结论Survivin特异siRNA表达载体下调Survivin基因表达,抑制A549细胞的增殖,促进凋亡。     

短发夹状RNA基因沉默补体受体C5aR及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡

目的:探讨短发夹状RNA基因沉默补体受体C5aR及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的作用效果。方法:构建针对大鼠补体受体C5aR基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-C5aR shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定的表达C5aR shRNA的细胞系。实验分为3组,①正常对照组:未转染的RK3E细胞;②阴性对照组:转染空载体pRNAT-U6.1的RK3E细胞系;③实验组:转染C5aR shRNA的RK3E细胞系。经脂多糖(LPS)孵育12小时后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR检测mRNA的表达,γ计数仪测定125I标记的C5a与RK3E的结合情况。结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P0.01),C5aR mRNA水平显著降低(P0.01),125I标记的C5a与RK3E结合活性显著下降。结论:针对C5aR的特异性短发夹RNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的发生。     

沉默癌胚抗原相关细胞黏附分子1基因抑制SHG44人胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡

目的采用RNA干扰技术(RNAi)沉默癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)基因的表达,观察沉默效果及沉默CEACAM1表达后对SHG44人胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并化学合成针对CEACAM1的3对小干扰RNA(siRNA),脂质体法瞬时转染SHG44细胞。流式细胞术(FCM)检测转染效率,采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测siRNA转染前后SHG44细胞中CEACAM1 mRNA的表达,Western blot法检测CEACAM1蛋白的表达。CCK-8法检测SHG44细胞细胞增殖活性,annexin V-FITC/PI染色结合FCM检测SHG44细胞凋亡,Western blot法检测cleaved caspase-3和裂解型多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(cleaved PARP)的变化。结果 CEACAM1 siRNA转染效率达85%。与空白对照组和阴性对照组比较,qRT-PCR及Western blot结果显示,3组特异性siRNA转染48 h后,在mRNA和蛋白水平上CEACAM1的表达均降低,以CEACAM1-siRNA3效果最明显。siRNA组SHG44细胞的增殖能力较正常对照组明显下降,凋亡细胞比例增加。沉默CEACAM1表达可以上调cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达。结论沉默CEACAM1基因表达可有效抑制SHG44胶质瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡。     

Fibulin-3表达对恶性胸膜间皮瘤细胞的影响

目的:研究纤蛋白3(fibulin-3)基因过表达/沉默对人恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma,MPM)细胞系SMC-1的影响,为MPM的治疗寻找新的方法。方法:分别构建fibulin-3过表达和短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体,并将SMC-1细胞分别转染空白对照载体(control)、过表达载体(Exp)、过表达对照载体(Exp-NC)、干扰载体(shRNA1、shRNA2、shRNA3和shRNA4)和干扰对照载体(shRNA-NC)。应用流式细胞术检测细胞周期及凋亡,real-time PCR法和Western blot法检测过表达/干扰前后fibulin-3的表达情况。结果:SMC-1细胞转染相应载体后,流式细胞术结果显示,与control组相比,fibulin-3+Exp组的G_2期细胞数量增加(P0.05),shRNA2组的G_2期数量减少(P0.05);凋亡检测结果显示,与control组相比,Exp组的细胞凋亡率下降(P0.05),而shRNA2组的细胞凋亡率上升(P0.05)。分子水平检测结果显示,与control组相比,Exp组fibulin-3和间皮素(mesothelin)的mRNA和蛋白表达水平上调(P0.05),各shRNA组fibulin-3和mesothelin的mRNA和蛋白表达水平下调(P0.05)。结论:本实验构建了fibulin-3基因的过表达及沉默载体,证实转染Exp和shRNA能有效改变fibulin-3的表达水平及SMC-1细胞的生长,为以fibulin-3为靶点的RNA沉默手段应用于临床MPM的治疗提供了实验依据。     

Suppression of p53-activated gene,PAG608, attenuates methamphetamine-induced neurotoxicity

The p53-activated gene 608 (PAG608) is a proapoptotic gene activated and regulated by p53 expression in oxidative stress-induced apoptosis of neuronal cells. In this study, we determined the role of PAG608 in methamphetamine-induced neurotoxicity. Treatment of mouse dopaminergic CATH.a cells with 2 mM methamphetamine increased PAG608 expression at 3 h followed by increase in phosphorylated p53 expression. Transient transfection of PAG608 antisense cDNA or RNA interference using PAG608 small interfering RNA significantly attenuated the dose-dependent decrease in cell viability of CATH.a cells by methamphetamine (1–4 mM) exposure. In monoaminergic neuronal B65 cells, which contain serotonin rather than dopamine, methamphetamine-induced cell death was also significantly but partially protected by transient transfection of PAG608 antisense cDNA. Furthermore, cell death of PC12 cells produced by methamphetamine (1–5 mM) was almost completely prevented by stable expression of PAG608 antisense cDNA, compared with significant reduction of cell viability in control PC12 cells. Our results showed that suppression of PAG608 using transient and stable transfection with PAG608 antisense cDNA or small interfering RNA attenuates methamphetamine-induced death of various monoaminergic neuronal cells, suggesting that methamphetamine neurotoxicity in monoaminergic cells is related, at least in part, to induction of PAG608 expression.     

沉默Smo基因对人宫颈癌HeLa细胞活力及凋亡的影响

目的:使用RNA干扰技术沉默Smoothened(Smo)基因,探讨其对宫颈癌He La细胞活力和凋亡的影响。方法:采用Smo shRNA转染宫颈癌He La细胞;采用RT-PCR和Western blot技术检测各组He La细胞Smo和转录因子Gli1的mRNA和蛋白表达;采用MTT比色法测定沉默Smo后细胞生长的情况;流式细胞术检测Smo shRNA对细胞周期和凋亡的影响。结果:与对照组比较,Smo shRNA转染细胞72 h后,Smo和Gli1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P0.05)。Smo基因沉默后,He La细胞的活力明显降低,细胞明显阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率显著升高。结论:沉默Smo基因可有效抑制人宫颈癌He La细胞生长,并诱导其凋亡。     

siRNA特异性抑制卵巢癌细胞葡萄糖调节蛋白78表达及其意义的研究

目的研究利用小分子干扰技术（RNAi）,构建Grp78靶向RNA干扰质粒载体,观察其对人类卵巢癌细胞SKOV3Grp78基因表达的抑制作用。初步探讨RNA干扰技术抑制Grp78的表达作为卵巢癌基因治疗的可行性。方法从GeneBank中选取人类卵巢癌细胞Grp78基因序列,采用siRNA Target Designer-Version 1.51设计软件设计Grp78基因发卡寡核苷酸,序列符合siRNA表达载体psiSTRIKETMU6的要求并与psiSTRIKETM质粒载体连接,采用脂质体转染法将含有特异性小分子干扰Grp78 mRNA的重组载体psiSTRIKETM/Grp78导入卵巢癌细胞系SKOV3中,分别在转染前、转染后24h、48h和72h通过RT-PCR和Western blot检测Grp78 mRNA及蛋白水平的表达情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡。四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞经梯度浓度紫杉醇处理后的细胞存活率。结果成功构建RNA干扰质粒载体,靶向Grp78 RNA干扰质粒载体命名为psiSTRIKETM/Grp78。将上述质粒转染到卵巢癌细胞后,观察到psiSTRIKETM/Grp78能够有效的抑制Grp78 mRNA及蛋白表达。转染psiSTRIKETM/Grp78基因后的卵巢癌细胞增殖受到抑制,出现凋亡征象,且对化疗药物的敏感性增加。结论构建的RNA干扰真核表达载体psiSTRIKETM/Grp78能明显抑制Grp78 mRNA及蛋白的表达,增加卵巢癌细胞的化疗敏感性。RNAi技术抑制Grp78表达为卵巢癌的基因治疗开辟了新的思路。     

RNA干扰Notch1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默Notch1基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并合成靶向Notch1基因的小分子干扰RNA质粒,在转染试剂Sofast介导下转染人乳腺癌细胞株MCF-7,用RT-PCR和Western blot法检测转染前、后Notch1基因的表达,挑选干扰效率最强的一组表达载体;cck8比色法检测分析各组细胞的存活率;流式细胞术检测细胞凋亡比例;Western blot法检测转染各组MCF-7细胞Notch1、NF-κB及Caspase-3蛋白表达。结果 Notch1-shRNA能有效封闭Notch1基因的表达,Notch1基因和蛋白表达水平明显降低(P<0.05);Notch1-shRNA能明显抑制细胞增殖(P<0.05);转染48h后细胞凋亡比例增加(P<0.01)。NF-κB蛋白水平表达降低,Caspase-3蛋白表达水平增高。结论利用RNA干扰技术沉默Notch1基因的表达可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,促进MCF-7细胞凋亡,其机制可能通过NF-κB信号通路调节相关凋亡蛋白的表达,进而影响细胞的凋亡和增殖,靶向Notch1的RNA干扰技术在乳腺癌的基因治疗中具有一定的研究价值。     

慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达

目的研究慢病毒介导的RNA干扰对PC12细胞的转染效率和对MyD88基因的抑制效率。方法构建针对大鼠MyD88基因3个靶点的ShRNA慢病毒载体,PC12细胞按照不同的转染条件分为正常组(DMEM完全培养液)、DMEM加入polybrene组、EN.iS(Enhance infection solution)组、EN.iS加入polybrene组。荧光显微镜下观察不同组的转染效率,采用Real-timePCR和Western blot检测不同的靶点对MyD88的不同沉默效率。结果病8毒滴度为1×10TU/ml,MOI为100时,PC12细胞在EN.iS组的转染效率最高,转染试剂polybrene对转染效率无明显影响,沉默效率最高的靶点是5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'。结论慢病毒介导的RNA干扰是一种高效的基因沉默手段,可以对PC12细胞中MyD88的功能进行长期的研究。     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.