结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1884基因的克隆、表达及亲和层析纯化

目的　克隆表达结核分枝杆菌Rv1884基因 ,序列测定正确后进行融合表达、纯化。方法　采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1884编码基因 ,用限制性内切酶消化后插入到pGEM Teasy中 ,序列测定正确后 ,再亚克隆到融合表达载体 pPro EXHT中 ,转化大肠杆菌DH5α ,目的基因经IPTG诱导 ,由T7启动子调控表达了氨基端带 6个连续组氨酸残基的Rv1884蛋白 ,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。结果　获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1884蛋白基因 ,得到融合 6个组氨酸残基的Rv1884蛋白纯度大于 85 %。结论　构建了结核分枝杆菌Rv1884基因的重组表达载体 ,并获得了高纯度的融合表达蛋白 ,为以后的深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌LprG基因的克隆、表达

目的构建结核分枝杆菌LprG基因的融合表达载体,在大肠杆菌中进行表达,为研究其在结核病诊断中的作用奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出LprG基因,克隆到pEASY T1中,序列测定正确后,再亚克隆到融合表达载体PET28a(+)中,转化入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。结果获得结核分枝杆菌LprG蛋白,凝胶薄层扫描分析表达量在38%左右,主要以可溶性形式存在。结论获得了重组结核分枝杆菌LprG蛋白,为以后研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因的克隆、表达和纯化

目的对结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因克隆、并测序正确后进行融合蛋白表达、纯化。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv复苏因子Rv2450c基因,酶切,克隆至PGEM-TEasy质粒,测序确定插入片段的正确性,再克隆至表达载体pET30a中,并转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过IPTG诱导,表达氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白,并纯化。结果获得了结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因,构建了重组表达质粒,得到融合了6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白,纯度〉90%。结论应用基因重组表达技术表达结核杆菌复苏因子蛋白,可为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养及复苏基因的功能研究打下一个良好的基础。     

结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因的克隆、表达和纯化

目的对结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因克隆、并测序正确后进行融合蛋白表达、纯化。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv复苏因子Rv2450c基因，酶切，克隆至PGEM—TEasy质粒，测序确定插入片段的正确性．再克隆至表达载体pET30a中，并转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过IPTG诱导，表达氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白，并纯化。结果获得了结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因，构建了重组表达质粒，得到融合了6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白，纯度〉90％。结论应用基因重组表达技术表达结核杆菌复苏因子蛋白，可为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养及复苏基因的功能研究打下一个良好的基础．     

GFP-Rv2626c融合蛋白表达载体的构建及表达纯化

目的构建含Rv2626c基因的原核表达载体,获得GFP-Rv2626c融合蛋白,为今后开发鉴别结核感染的血清学诊断试剂打下基础。方法以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,经PCR法扩增得到Rv2626c基因DNA片段。将扩增片段克隆到pGM-T载体中测序,并进一步将Rv2626c亚克隆到pET28a-GFP中,构建原核重组表达载体pET28a-GFP-Rv2626c。将pET28a-GFP-Rv2626c转化E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导目的基因表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析和纯化该表达产物。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定,成功构建了重组质粒pET28a-GFP-Rv2626c。用IPTG诱导该质粒转化的E.coliBL21后,获得分子量约46kD的GFP-Rv2626c融合蛋白。经Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的GFP-Rv2626c融合蛋白。结论成功制备出重组GFP-Rv2626c融合蛋白,为开发鉴别结核感染的血清学诊断试剂打下了基础。     

结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达效率的研究

目的构建结核分枝杆菌（MTB）重组质粒pGEX-ESAT-6，分析ESAT-6抗原在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达效率。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因；将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）基因的高效原核表达载体pGEX-1λT，经酶切鉴定后以IPTG诱导表达ESAT-6／GST融合蛋白；SDS—PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。结果PCR扩增出288bp的ESAT-6基因；双酶切证实ESAT6基因成功插入pGEX-1λT中，构建了pGEX—ESAT-6穿梭表达载体。SDS—PAGE分析重组质粒pGEX-ESAT-6表达产物的分子质量单位为35ku，表达效率为20％，Western blot检测该蛋白能被活动性结核病人血清特异识别。结论结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6在大肠埃希菌中获得了高效融合表达，表达的ESAT-6重组蛋白具有抗原特异性。     

结核分枝杆菌HSP65与IL-2融合蛋白的表达和纯化

目的获得融合表达的结核分枝杆菌热休克蛋白65与人白细胞介素2的重组蛋白,为进一步研究其对结核疫苗的作用奠定基础。方法用PCR的方法分别从H37Rv DNA和质粒pGEM-Teasy-IL-2中扩增目的基因片段hsp65和IL-2,将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序,将测序正确的目的基因片段分别经EcoRI和ClaI,ClaI和HindⅢ双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EX HTa,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,经IPTG诱导后进行融合表达,并通过镍柱对融合蛋白进行纯化。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE和Western-blot分析,在Mr 78000处有特异性的蛋白表达条带。用镍柱进行亲和层析纯化后得到了高纯度的HSP65-IL-2融合蛋白。结论成功的构建了结核分枝杆菌HSP65与人IL-2的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,有望为结核的预防提供有效的疫苗。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒，获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增目的基因片段；通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c，经序列测定证实正确，双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT，转化入大肠杆菌DH5α中，再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白；用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因，构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c，转化入大肠杆菌DH5α中，经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析，在80kD处出现新生蛋白带，凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23．7％。该融合蛋白以包涵体的形式存在，用Ni^2＋-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物，为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能，以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

Whole-genome analysis reveals molecular innovations and evolutionary transitions in chromalveolate species

The chromalveolates form a highly diverse and fascinating assemblage of organisms, ranging from obligatory parasites such as Plasmodium to free-living ciliates and algae such as kelps, diatoms, and dinoflagellates. Many of the species in this monophyletic grouping are of major medical, ecological, and economical importance. Nevertheless, their genome evolution is much less well studied than that of higher plants, animals, or fungi. In the current study, we have analyzed and compared 12 chromalveolate species for which whole-sequence information is available and provide a detailed picture on gene loss and gene gain in the different lineages. As expected, many gene loss and gain events can be directly correlated with the lifestyle and specific adaptations of the organisms studied. For instance, in the obligate intracellular Apicomplexa we observed massive loss of genes that play a role in general basic processes such as amino acid, carbohydrate, and lipid metabolism, reflecting the transition of a free-living to an obligate intracellular lifestyle. In contrast, many gene families show species-specific expansions, such as those in the plant pathogen oomycete Phytophthora that are involved in degrading the plant cell wall polysaccharides to facilitate the pathogen invasion process. In general, chromalveolates show a tremendous difference in genome structure and evolution and in the number of genes they have lost or gained either through duplication or horizontal gene transfer.     

血管紧张素Ⅰ转化酶基因多态和2型糖尿病肾病相关性研究

血管紧张素Ⅰ转化酶（ＡＣＥ）基因多态和２型糖尿病肾病（ＤＮ）的关系。方法用ＰＣＲ技术检测１０２例中国汉族２型糖尿病患者ＡＣＥ基因Ｉ／Ｄ多态基因型。结果ＤＮ组（ｎ＝３６）和无ＤＮ组（ｎ＝４９）相比,Ｄ型等位基因和ＤＤ基因型糖频率升高（分别为５９．７％ｖｓ３８．８％,Ｘ＾２＝７．３０,３３．３％ｖｓ１２．２％,Ｘ＾２＝５．５３）,有显著性差异（Ｐ〈０．０５）,病程≤５年合并ＤＮ组（ｎ＝１１）与病程〉５     

Ohno's dilemma: evolution of new genes under continuous selection

New genes with novel functions arise by duplication and divergence, but the process poses a problem. After duplication, an extra gene copy must rise to sufficiently high frequency in the population and remain free of common inactivating lesions long enough to acquire the rare mutations that provide a new selectable function. Maintaining a duplicated gene by selection for the original function would restrict the freedom to diverge. (We refer to this problem as Ohno's dilemma). A model is described by which selection continuously favors both maintenance of the duplicate copy and divergence of that copy from the parent gene. Before duplication, the original gene has a trace side activity (the innovation) in addition to its original function. When an altered ecological niche makes the minor innovation valuable, selection favors increases in its level (the amplification), which is most frequently conferred by increased dosage of the parent gene. Selection for the amplified minor function maintains the extra copies and raises the frequency of the amplification in the population. The same selection favors mutational improvement of any of the extra copies, which are not constrained to maintain their original function (the divergence). The rate of mutations (per genome) that improve the new function is increased by the multiplicity of target copies within a genome. Improvement of some copies relaxes selection on others and allows their loss by mutation (becoming pseudogenes). Ultimately one of the extra copies is able to provide all of the new activity.     

胃癌组织中Survivin、PTEN、P53基因的表达及意义

目的　探讨凋亡抑制基因 Survivin和抑癌基因 PTEN、P53在胃癌组织中的表达及其与胃癌发生发展、临床病理特征之间的关系。方法　应用免疫组织化学链霉亲和素方法 (SABC) ,检测 Survivin、PTEN和 P53基因在 6 5例胃癌、2 6例不典型增生胃黏膜、10例浅表性胃炎和 30例正常胃黏膜组织中的表达。结果　胃癌组织中Survivin、PTEN、突变型 P53基因的阳性表达率分别为 70 %、4 8%、6 5 % ,不典型增生胃黏膜中分别为 4 2 %、85 %、31% ,Survivin和突变型 P53基因在正常胃黏膜和浅表性胃炎组织中不表达 ,PTEN基因在正常胃黏膜和浅表性胃炎组织中全部呈阳性表达。胃癌组织中 PTEN基因的表达与正常胃黏膜组织中的表达差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ,胃癌组织、不典型增生胃黏膜以及正常胃黏膜中 Survivin和突变型 P53基因的表达差异均有显著性 (P<0 .0 5 )。随临床分期增加、胃癌分化程度降低、浸润深度加深、淋巴结的转移 ,突变型 P53基因的阳性表达率逐渐上升 (P<0 .0 5 ) ,PTEN基因的阳性表达率逐渐降低 (P<0 .0 5 )。在胃癌组织中 Survivin与突变型 P53基因的表达呈正相关 (P<0 .0 5 ) ,与 PTEN基因的表达呈负相关 (P<0 .0 5 ) ,PTEN基因与突变型 P53基因的表达呈负相关 (P<0 .0 5 )。结论　 Survivin、PTEN和 P53     

运动性横纹肌溶解高反应者ACE／CK—MM基因多态性分析

目的探讨中国汉族运动性横纹肌溶解（ERB）高反应者（HR）ACE基因I／D多态性及肌酸肌酶（CK）-MM基因限制性酶切片段多态性的分布特点。方法采用PCR及限制性酶切多态性分析技术,对12例中国汉族ERBHR的ACE、CK-MM基因多态性进行检测、分析。结果本组12例ERBHR的ACE基因频率I为54％、D为46％,D等位基因频率较汉族正常人群高,但无统计学意义（P=0．146）;汉族正常人群与高加索正常人群相比,P〈0．01。本组ERBHR的CK-MM基因频率A为71％、G为29％,G等位基因频率较汉族正常人群高,但无统计学意义（P=0．078）;汉族正常人群与高索ERBHR的该基因频率高度一致（P=0．992）。结论汉族ERBHR人群ACED、CK-MMG等位基因频率均稍高于汉族正常人群。     

嗜肺军团菌htpA基因的克隆及其原核表达

目的克隆并检测嗜肺军团菌htpA基因在原核系统中表达情况,为进一步研究HtpA蛋白的免疫性能作必要的准备。方法采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得军团菌热休克蛋白A基因htpA,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGhtpA,重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后,转化宿主菌大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了291bp完整的htpA基因,构建了原核表达重组质粒pGhtpA,并检测到约36kDa的GST-htpA融合蛋白质表达条带。结论成功克隆了嗜肺军团菌htpA基因并使HtpA蛋白在原核表达系统中得到了有效的表达,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

共表达HIV-1的gag-gp120与IL-2的pGPIL-2诱导小鼠产生细胞毒性T细胞的研究

目的 研究HIV-1CN融合基因与IL-2基因共表达基因质粒pGPIL-2诱导产生细胞毒性T细胞（CTL）。方法 脂质体介导共表达中国流行株HIV-1gag-gp120基因与IL-2基因的基因疫苗质粒pGPIL-2转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光法鉴定其表达。取pGPIL-2免疫鼠脾细胞,检测pGPIL-2诱导的细胞毒性T细胞杀伤活性。结果 杀伤实验结果证明,经基因免疫获得的 CTL效应细胞,可杀伤 HIV-1CN 融合基因转染的靶细胞。结论 pGPIL-2可有效地诱导 CTL的产生,该研究结果为进一步设计中国流行株HIV-1基因疫苗提供了重要实验依据。