ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮肤类似物的分化

 【目的】以ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞构建皮肤类似物,探讨其在皮下的分化潜能。【方法】Hoechst33342标记E14-ES细胞,经羊膜诱导4d后,形成表皮干细胞克隆,并以其作为种子细胞,取129胎鼠成纤维细胞与复合凝胶-明胶海绵复合,形成皮肤类似物,埋植于129小鼠皮下组织。术后2周、4周、6周、8周取材,做HE染色观察,β1整合素、CK15、CK19、CEA、CK18免疫组化荧光双标和免疫组化观察。【结果】术后2周和4周,植块内可见单层立方或柱状上皮构成的管状和泡状结构,6周和8周后,可见角化复层上皮、毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构,免疫双标结果显示,植入2周和4周,带有蓝色核标记的细胞形成的管状或泡状结构呈β1整合素、CK15、CK19、CEA和CK18阳性,6周和8周后,HE染色中汗腺样结构呈CEA、CK18阳性。【结论】ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构建的皮肤类似物,在同种小鼠皮下有分为角化复层上皮、汗腺样、毛囊样、皮脂腺样等结构的潜能。     

胚胎干细胞源性表皮干细胞在腹腔微环境中分化潜能的初步研究

【目的】探讨胚胎干细胞源性的表皮干细胞在腹腔微环境中的分化情况，为研究其在不同微环境中的分化稳定性和全能性及寻找新的皮肤工程种子细胞奠定基础。【方法】小鼠ES E14细胞与人羊膜共培养4～5d，定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆，它们呈B1整合素、CK15和CK19阳性，移植入裸鼠腹腔。对移植后细胞的分化情况进行形态学和CEA、CK10、CK18、CK19免疫组织化学观察。【结果】小鼠胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠腹腔内l～4周，细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构。种植5周后，除上述结构外，可见角化复层扁平上皮、毛囊样、汗腺样及皮脂腺样等结构。免疫组化表明汗腺样结构分别呈CEA和CK18阳性，而角化复层扁平上皮的基底层细胞分别呈CK19和CK10阳性。【结论】初步结果表明小鼠胚胎干细胞源性表皮样干细胞在腹腔微环境下同样具有分化为角化复层上皮、毛囊样、汗腺样和皮脂腺样结构的潜能。     

胚胎干细胞源性表皮干细胞在腹腔微环境中分化潜能的初步研究

【目的】 探讨胚胎干细胞源性的表皮干细胞在腹腔微环境中的分化情况,为研究其在不同微环境中的分化稳定性和全能性及寻找新的皮肤工程种子细胞奠定基础?【方法】 小鼠ES E14细胞与人羊膜共培养4～5 d,定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆,它们呈β1整合素?CK15和CK19阳性,移植入裸鼠腹腔?对移植后细胞的分化情况进行形态学和CEA?CK10?CK18?CK19免疫组织化学观察?【结果】 小鼠胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠腹腔内1～4周,细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构?种植5周后,除上述结构外,可见角化复层扁平上皮?毛囊样?汗腺样及皮脂腺样等结构?免疫组化表明汗腺样结构分别呈CEA和CK18阳性,而角化复层扁平上皮的基底层细胞分别呈CK19和CK10阳性?【结论】 初步结果表明小鼠胚胎干细胞源性表皮样干细胞在腹腔微环境下同样具有分化为角化复层上皮?毛囊样?汗腺样和皮脂腺样结构的潜能?     

ES细胞源性表皮干细胞分化潜能的研究

目的探讨人羊膜诱导的ES细胞源性表皮干细胞在肾被囊内的分化,研究其在不同微环境中的分化潜能和稳定性,为组织工程皮肤寻找新的种子细胞奠定基础。方法Hoechst33342标记129小鼠E14胚胎干细胞,与人羊膜共培养4d,定向诱导其分化为的表皮干细胞克隆,诱导后的细胞移植入129小鼠肾被囊内,术后4,6和8周取材。对移植后细胞的分化进行形态学和免疫荧光双标CK19及CK18检测。结果ES细胞源性表皮干细胞在小鼠肾被囊内4周,分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构,种植6周和8周,除上述结构外,可见角化复层上皮、汗腺样、皮脂腺样及毛囊样等结构。管泡状结构免疫荧光双标染色呈CK19及CK18阳性。结论ES细胞源性表皮干细胞在肾被囊内,仍具有分化为角化复层上皮、汗腺样、皮脂腺样及毛囊样结构的潜能。     

人胚胎干细胞源性表皮样干细胞分化潜能

【目的】探讨人胚胎干细胞源性表皮样干细胞的分化潜能，为研究其分化的调控机制及寻找新的人皮肤组织工程种子细胞奠定基础。【方法】将人胚胎干细胞与人羊膜共培养4d，定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆，用胰酶消化后移植裸鼠皮下20d、30d及50d。对移植后细胞的分化情况进行了形态学和免疫组织化学观察分析。【结果】人胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠皮下20～30d后，细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状或泡状结构，它们可分别呈CEA和CK18阳性。种植50d后，除上述结构外，可见角化复层扁平上皮、毛囊样、汗腺样及皮脂腺样等结构。【结论】研究结果提示人胚胎干细胞源性表皮样干细胞具有分化为角化复层扁平上皮及毛囊样、汗腺样和皮脂腺样等结构的潜能。     

ES细胞源性表皮干细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤

【目的】以胚胎干细胞（ES细胞）源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤，探讨其对皮肤缺损修复的作用。【方法】胎鼠皮肤成纤维细胞与胶原海绵构建类真皮，植入小鼠全层皮肤缺损创面。以生物膜为载体，把羊膜诱导后带有核标记的ES细胞源性表皮干细胞覆盖在类真皮上，术后1～8周连续取材，HE染色，B1整合素、CK15、CK19、CK10和CEA免疫荧光双标和免疫组化观察。【结果】植入后3周，创面完全长合。较厚新生皮完全覆盖创面，基底层细胞增生，形成许多大小不一的细胞柱伸向真皮层，新生表皮中可见核标记的细胞呈B1整合素、CK15、CK19阳性，真皮中的管腔样结构呈核荧光和β1整合素、CEA免疫组化双标阳性，4～8周新生表皮基底层细胞呈CK19、CK10阳性，新生表皮下可见毛囊样、皮脂腺样结构。【结论】ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建的组织工程皮肤可以修复缺损皮肤，在其下真皮层有分化为毛囊样、皮脂腺样和汗腺样的结构，但是是否来源于ES细胞源性表皮干细胞仍需进一步证实。     

人胚胎干细胞源性表皮样干细胞分化潜能

[目的]探讨人胚胎干细胞源性表皮样干细胞的分化潜能,为研究其分化的调控机制及寻找新的人皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将人胚胎干细胞与人羊膜共培养 4 d,定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆,用胰酶消化后移植裸鼠皮下 20 d、 30 d及 50 d.对移植后细胞的分化情况进行了形态学和免疫组织化学观察分析.[结果]人胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠皮下 20～ 30 d后,细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状或泡状结构,它们可分别呈 CEA和 CK18阳性.种植 50 d后,除上述结构外,可见角化复层扁平上皮、毛囊样、汗腺样及皮脂腺样等结构.[结论]研究结果提示人胚胎干细胞源性表皮样干细胞具有分化为角化复层扁平上皮及毛囊样、汗腺样和皮脂腺样等结构的潜能.     

ES细胞源性表皮干细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤

【目的】以胚胎干细胞(ES细胞)源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤,探讨其对皮肤缺损修复的作用。【方法】胎鼠皮肤成纤维细胞与胶原海绵构建类真皮,植入小鼠全层皮肤缺损创面,以生物膜为载体,把羊膜诱导后带有核标记的ES细胞源性表皮干细胞覆盖在类真皮上,术后1～8周连续取材,HE染色,β1整合素、CK15、CK19、CK10和CEA免疫荧光双标和免疫组化观察。【结果】植入后3周,创面完全长合,较厚新生皮完全覆盖创面,基底层细胞增生,形成许多大小不一的细胞柱伸向真皮层,新生表皮中可见核标记的细胞呈β1整合素、CK15、CK19阳性,真皮中的管腔样结构呈核荧光和β1整合素、CEA免疫组化双标阳性,4～8周新生表皮基底层细胞呈CK19、CK10阳性,新生表皮下可见毛囊样、皮脂腺样结构。【结论】ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建的组织工程皮肤可以修复缺损皮肤,在其下真皮层有分化为毛囊样、皮脂腺样和汗腺样的结构,但是是否来源于ES细胞源性表皮干细胞仍需进一步证实。     

体外构建的皮肤模型Inspectskin Ⅰ修复裸鼠全层皮肤缺损

【目的】探讨胚胎来源表皮干细胞构建的人工皮肤模型InspectskinⅠ修复全层皮肤缺损的作用,为构建含皮肤附属结构的检验用皮肤奠定基础。【方法】将人羊膜和BMP-4定向诱导小鼠胚胎细胞分化为表皮干细胞,采用筏式培养在体外与PHBV和成纤维细胞共培养构建组织工程皮肤,经短暂培养后移植于裸鼠皮肤缺损创面,对移植物进行形态学和免疫组织化学观察。【结果】移植物可封闭皮肤缺损,在其表面可形成复层表皮样结构,真皮部分可见大小不等的由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构、汗腺样结构和毛囊样结构。免疫组化和免疫双标结果表明新生表皮的基底层分别呈CK19和CK10阳性,腺管样结构分别呈CEA和CK18阳性。【结论】体外重建的人工皮肤能修复裸鼠全层皮肤缺损,胚胎来源表皮干细胞具有分化为复层扁平上皮、汗腺样结构和毛囊样结构的潜能。     

体外构建的皮肤模型InspectskinⅠ修复裸鼠全层皮肤缺损

【目的】 探讨胚胎来源表皮干细胞构建的人工皮肤模型InspectskinⅠ修复全层皮肤缺损的作用,为构建含皮肤附属结构的检验用皮肤奠定基础｡ 【方法】 将人羊膜和BMP-4定向诱导小鼠胚胎细胞分化为表皮干细胞,采用筏式培养在体外与PHBV和成纤维细胞共培养构建组织工程皮肤,经短暂培养后移植于裸鼠皮肤缺损创面,对移植物进行形态学和免疫组织化学观察｡ 【结果】 移植物可封闭皮肤缺损,在其表面可形成复层表皮样结构,真皮部分可见大小不等的由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构､汗腺样结构和毛囊样结构｡免疫组化和免疫双标结果表明新生表皮的基底层分别呈CK19和CK10阳性,腺管样结构分别呈CEA和CK18阳性｡ 【结论】 体外重建的人工皮肤能修复裸鼠全层皮肤缺损,胚胎来源表皮干细胞具有分化为复层扁平上皮､汗腺样结构和毛囊样结构的潜能｡     

人表皮干细胞体外诱导分化为汗腺样上皮细胞的研究

目的 探讨体外人表皮干细胞向汗腺样上皮分化的影响条件,并对诱导成的管腔样结构进行鉴定.方法 将人表皮干细胞接种到复方壳多糖真皮基质上和胶原凝胶中,加入不同浓度的表皮生长因子(EGF),体外垂直震荡培养,进行三维培养和定向诱导分化,采用HE染色、免疫荧光等手段观察表皮干细胞定向分化为汗腺样上皮的条件及形态、表型改变.结果 15～20 ng/mL的EGF可诱导组织工程真皮上的表皮干细胞向真皮内生长并可出现腺样结构.HE染色该结构,显示为单层细胞连接为环状,中间见明显的腔隙,细胞质嗜酸性.利用CK 19荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察到细胞团中央有管腔结构,同时此结构表达CK18、癌胚抗原(CEA).结论 体外培养的人表皮干细胞接种在组织工程真皮上,在一定浓度的EGF诱导条件下,能形成管腔样结构,该管腔样结构在形态学、组织学上与在体汗腺分泌部细胞相似.     

体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺细胞分化的研究

目的:探讨体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺上皮分化可行性及条件,为汗腺组织工程探索新的种子细胞提供来源。方法:体外分离培养、扩增并鉴定人汗腺细胞。将胚胎干细胞培养于人羊膜表面诱导其向表皮干细胞转化后,与人汗腺细胞直接共同培养,诱导其分化为汗腺细胞。采用倒置显微镜进行形态学观察,并用免疫细胞化学染色方法检测诱导分化结果。结果:体外培养的人汗腺细胞CK19、CEA阳性表达。培养于人羊膜表面的胚胎干细胞β1整合素呈强阳性表达,符合表皮干细胞的表面抗原标志。经与人汗腺细胞共培养2周后,有部分胚胎干细胞来源的表皮干细胞表达CEA,表明通过汗腺细胞分泌的细胞因子、细胞间直接接触等可能的作用途径,使其表型向汗腺细胞表型转化。结论:胚胎干细胞来源表皮干细胞可能成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。     

Hoechst 33342标记恒河猴皮肤干细胞向结膜上皮细胞分化

 [目的]探讨皮肤干细胞诱导分化为结膜上皮细胞,为组织工程结膜探索一种新型的种子细胞,为严重眼表疾病的治疗奠定基础。[方法]在体外培养纯化鉴定恒河猴皮肤干细胞,并用Hoechst 33342标记,标记后的皮肤干细胞与结膜上皮细胞进行Transwell非接触共培养10d,然后对诱导后的细胞用细胞免疫化学以及流式细胞术检测结膜上皮细胞的特异性表面标志,包括角蛋白4和粘蛋白4,同时检测细胞的Hoechst 33342表达情况。[结果]纯化后的皮肤干细胞比例接近90%。Hoechst 33342标记后的皮肤干细胞胞核显示蓝色荧光。在与结膜上皮细胞共培养10d后,皮肤干细胞显示结膜上皮细胞的标志粘蛋白4和角蛋白4阳性,流式细胞术检测阳性细胞比例分别为49.9%和95.6%,同时细胞还显示胞核的Hoechst 33342表达。[结论]灵长类动物恒河猴的皮肤干细胞,在体外的适宜条件下,可诱导分化为有结膜上皮细胞特征的细胞。     

Morphological and distribution characteristics of sweat glands in hypertrophic scar and their possible effects on sweat gland regeneration

Background In hypertrophic scar tissue, no sweet gland and hair follicle exist usually because of the dermal and epidermal damage in extensive thermal skin injury, thus imparing regulation of body temperature. This study was designed to reveal the morphological and distributional characteristics of the sweat glands in normal skin and hypertrophic sear obtained from children and adults, and to study the possible interfering effects of the sear on regeneration of the sweat gland after burn injury.Methods Biopsies of hypertrophic sear were taken from four children (4 - 10 years) and four adults (35 -51 years). Normal, uninjured full-thickness skin adjacent to the sear of each patient was used as control. Keratin 19 (K19) was used as the marker for epidermal stem cells and secretory portion of the sweat glands, and keratin 14 (K14) for the tube portion, respectively. Immunohistochemical and histological evaluations were performed.Results Histological and immunohistoehemical staining of skin tissue sections from both the children and adults showed K19 positive cells in the basement membrane of epidermis of normal skin. These cells were seen only single layer and arranged regularly. The secretory or duet portion of the eccrine sweat glands was situated inthe dermis and epidermal layer. However, in the sear tissue, K19 positive cells were scant in the basal layer,and the anatomic location of the secretory portion of sweat glands changed. They were located between the border of the sear and reticular layer of the dermis. These secretory portions of sweat glands were expanded and were organized irregularly. But a few K14 positive cells were scattered in the sear tissues in cyclic form.Conclusions There are some residual sweat glands in sear tissues, in which the regeneration process of active sweat glands is present. Possibly the sweat glands could regenerate from adult epidermal stem cells or residual sweat glands in the wound bed after burn injury.     

人骨髓间充质干细胞诱导分化为汗腺细胞的实验研究

目的：研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在体外诱导分化为人汗腺细胞（hSGCs）。方法：体外分别分离培养hMSCs和hSGCs,原代培养hSGCs融合后,收集细胞,制备汗腺细胞匀浆,用含10%汗腺细胞匀浆的汗腺培养基来诱导培养hMSCs。1周后,检测诱导培养的hMSCs的抗原表达。结果：培养的hSGCs表达CK19和CEA;hMSCs表达CD44、105,不表达CK19、CD34和CEA。诱导培养1周,免疫细胞化学染色示诱导培养组少量细胞表达CEA和CK19,而对照组未见CEA和CK19阳性细胞;流式细胞仪检测CEA在诱导培养组的阳性表达率约为（6.2±1.2）%,对照组（0.9%±0.0）%（P〈0.05）。结论：在无完整汗腺细胞存在的情况下,hMSCs在体外也可诱导分化为hSGCs。     

胃癌BGC-823肿瘤细胞系SP表型初步分析

目的〓〖HTK〗观察人胃癌BGC-823肿瘤细胞系中是否含有SP细胞及SP细胞的形态特点，并验证该表型细胞与干细胞标志物(ABCG2)的关系。〖HTW〗方法〓〖HTK〗取贴壁生长的BGC-823细胞，经Hoechst33342染色，于荧光显微镜下观察细胞染色情况，并观察拒染或浅染的SP细胞的形态特点，计算其百分比；之后对细胞爬片进行Hoechst33342染色和ABCG2的免疫荧光染色，于荧光显微镜下观察Hoechst33342染色强度和ABCG2的表达情况。〖HTW〗结果〓〖HTK〗荧光显微镜下可见BGC-823细胞系中存在SP细胞，且该类细胞体积较小，约占细胞总数的1.8%；免疫荧光染色可见爬片细胞中ABCG2+细胞即为SP表型细胞。〖HTW〗结论〓〖HTK〗人胃癌BGC-823细胞系中存有SP细胞，且该表型细胞表达干细胞标志物ABCG2。     

支架荷载的骨髓间充质干细胞的分化实验研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架上向表皮干细胞分化的可行性。方法体外诱导改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠骨髓间充质干细胞向表皮干细胞分化,免疫组织化学法检测表皮干细胞标志物CK19和整合素β1的表达。结果诱导液作用2周后,免疫组织化学法检测到改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠BMSCs中大量阳性双表达CK19和整合素β1。结论改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠BMSCs仍具有向表皮干细胞分化的潜能,此支架具备作为组织工程皮肤支架材料的条件。     

Ultraviolet B light-induced apoptosis in human keratinocytes enriched with epidermal stem cells and normal keratinocytes

Background  The stem-cell compartment is the primary target for the accumulation of oncogenic mutations. Overexposure to solar ultraviolet radiation is responsible for the development and progression of >90% of skin cancers. Ultraviolet B (UVB) light-induced keratinocyte apoptosis is a strong preventive mechanism against carcinogenesis. The aim of this study was to isolate keratinocytes enriched with putative human epidermal stem cells and to investigate their apoptotic induction by UVB.

Methods  Keratinocytes enriched with putative human epidermal stem cells were isolated by adherence to collagen IV and the expressions of β1-integrin and p63 were investigated. Keratinocytes enriched with putative human epidermal stem cells and normal keratinocytes were irradiated with UVB at 0–80 mJ/cm². The apoptotic response was investigated with phase-contrast microscopy, Hoechst 33342 staining, flow cytometry of annexin V/PI, and procaspase-3 Western blotting.

Results  Keratinocyte enriched with stem cells expressed high levels of p63 protein and β1-integrin and low level of pan-keratin (C11). In comparison to non-irradiated cells, significant apoptosis of keratinocyte enriched with stem cells was found with 40 and 80 mJ/cm² UVB. However, significant apoptosis of normal keratinocytes was only found for 80 mJ/cm² UVB.

Conclusions  Human epidermal stem cells can undergo apoptosis in response to UVB radiation and are more susceptible than other keratinocytes. The method could be used in vitro studies of human epidermal stem cells.

     

小鼠子宫内膜干细胞的研究进展

子宫内膜干细胞是一种成体干细胞,可通过不对称分裂对子宫内膜进行修复。现有许多学者致力于子宫内膜干细胞的研究,标记滞留细胞技术和Hoechst 33342-SP法是常用的子宫内膜干细胞研究的方法,这些方法在用于人和小鼠子宫内膜干细胞的研究中各有其局限性。人子宫内膜干细胞研究受多种因素的限制,而小鼠成为一个重要的替代模型。现就小鼠子宫内膜干细胞的研究现状进行论述,并对其今后的研究前景进行展望。