双层含骨基质骨器官芯片的构建

目的构建双层含骨基质骨器官芯片并用于体外模拟成骨细胞和破骨细胞分化, 为抗骨质疏松药物开发提供新平台。方法使用WorkSoild软件制作双层双通道骨器官芯片设计图, 利用光刻技术制备浇注母版。以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为原料, 通过模具浇注制备芯片主体。以牛皮质骨片为间隔, 分隔培养室4个通道进出口采用储液柱封闭。芯片验证实验分为成骨、破骨诱导组和成骨、破骨对照组, 成骨、破骨诱导组将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1和小鼠巨噬细胞RAW264.7分别接种于芯片上, 成骨诱导14 d, 破骨诱导7 d。成骨、破骨对照组为不进行诱导的MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞。观察指标包括:(1)芯片外观及密封性:芯片制备完成后拍照观察外观并通过密封实验观察密封性能。(2)生物相容性:MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞接种于芯片培养3 d及培养1、3、5 d后, 分别采用钙黄绿素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶(AM/PI)染色和细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)实验观察细胞存活情况。(3)成骨分化情况:对成骨诱导组细胞进行碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色观察成骨细胞诱导情...     

阻断PI3K信号通路显著抑制成骨前体细胞MC3T3-E1的分化

目的：研究PI3K信号通路对成骨前体细胞MC3T3-E1分化的调控作用。方法：首先通过Western印迹试验检测到PI3K信号通路参与成骨细胞分化的调控。应用PI3K激酶的特异性抑制剂LY294002药物阻断PI3K信号通路的活化，通过碱性磷酸酶(ALP)和von Kossa染色观察成骨前体细胞MC3T3-E1分化的改变。结果：Western印迹试验显示，成骨细胞分化过程中PI3K信号通路明显活化。阻断该信号通路的活化显著抑制成骨细胞碱性磷酸酶的活性，同时降低成骨细胞体外形成骨结节结构的能力。结论：PI3K信号通路参与了成骨细胞分化的调控，而这种调控作用是成骨细胞分化所必需的。     

以纤维蛋白胶为载体的注射型骨修复材料对兔骨髓基质细胞增殖和分化的影响

目的 观察以纤维蛋白胶(FS)为载体的注射型骨修复材料对体外培养的兔骨髓基质细胞(MSCs)增殖和分化的影响.方法 取3天龄新西兰兔MSCs进行培养,实验分为5组,A组(实验组)培养液中加入含1μg/ml重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)和1μg/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的纤维蛋白胶,B组(对照1组)培养液中加入单纯的纤维蛋白胶,C组(对照2组)培养液中加入含lμg/ml bFGF的纤维蛋白胶,D组(对照3组)培养液中加入含1μg/ml rhBMP-2的纤维蛋白胶,E组为单纯对照组(培养液中不加入任何材料).采用细胞培养、组织化学及电镜观察等方法对各组细胞增殖情况、贴壁率、碱性磷酸酶(ALP)活性、Ⅰ型胶原表达、超微结构变化等进行研究.结果 各组材料的促增殖作用和对细胞贴壁率的影响由强到弱均依次为C组、A组、B组、D组、E组,差异有显著性(P＜0.05).各组细胞ALP活性及Ⅰ型胶原表达水平由强到弱均依次为A组、D组、B组、C组、E组,差异有显著性(P＜0.05).扫描电镜观察发现,以纤维蛋白胶为载体的注射型骨修复材料表面粗糙,有微孔存在,各组细胞与其融合生长.透射电镜观察发现:A组的绝大部分细胞呈成骨细胞表型,细胞增殖旺盛,分化好,胞质内有丰富的粗面内质网和线粒体,并明显扩张,内有蛋白样物质,细胞外基质丰富,细胞周围可见大量的胶原纤维;而各对照组或是细胞增殖活性高,但向成骨细胞表型分化差,或是向成骨细胞表型分化好,但细胞增殖活性较差,细胞外基质及胶原纤维少.结论 以纤维蛋白胶为载体的注射型骨修复材料(FS bFGF rhBMP-2)可显著促进MSCs的增殖及其向成骨细胞的分化.     

低氧预处理的人脐带间充质干细胞对巨噬细胞极化的调节作用观察

目的 探讨低氧培养的人脐带间充质干细胞对巨噬细胞极化的影响.方法 采用组织块贴壁法获取人脐带来源的间充质干细胞(hUC-MSCs),分别将细胞置入常氧(氧浓度21％)和低氧(氧浓度5％)条件下培养,通过细胞成脂、成骨分化诱导观察其多向分化能力,Live/death染色检测细胞活性,ELISA法检测其细胞因子蛋白含量.利用Transwell将常氧和低氧培养的hUC-MSCs与脂多糖(IPS)刺激后的巨噬细胞(THP-1)共培养,免疫荧光检测THP-1的极化情况,ELISA检测THP-1分泌炎症因子以及抗炎因子的情况.结果 低氧条件下培养的hUC-MSCs具有成脂、成骨的多向分化潜能;Live/death染色结果显示常氧和低氧培养下的hUC MSCs均具有较高的细胞活性;低氧条件下培养的hUC-MSCs中前列腺素E2(PGE2)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达水平明显高于常氧培养的hUC-MSCs;低氧条件下培养的hUC-MSCs可促进THP-1向M2型巨噬细胞转化,同时炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的表达明显降低,而抗炎因子IL-10的表达明显增强.结论 低氧培养的hUC-MSCs可促使THP-1 向M2巨噬细胞转化,提高其抗炎能力.     

鸢尾素对炎症状态下小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 研究鸢尾素(irisin)对炎症状态下骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的保护作用。方法 分离、培养小鼠BMSCs并将其分为3组：对照组(Vehicle),牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导炎症组(LPS),Irisin干预组(LPS+irisin; Irisin)。CCK-8试剂盒检测细胞活力；成骨诱导培养后检测碱性磷酸酶(ALP)活性，qPCR检测成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runx2)、锌指结构转录因子(Osx)、ALP和骨钙素(OCN)的转录表达，Western blot检测成骨相关蛋白ALP和OCN的表达，茜素红染色半定量分析检测矿化水平。结果 与Vehicle组相比，LPS显著促进BMSCs增殖(P<0.05);LPS下调Runx2、Osx、ALP和OCN的转录水平，降低ALP和OCN蛋白表达(P<0.05),而irisin干预显著上调Runx2、Osx和ALP转录表达，提高ALP和OCN蛋白表达，并提高矿化水平(P<0.05)。结论 Irisin可促进炎症微环境中小鼠BMSCs成骨分化。     

间充质干细胞来源外泌体对视网膜光感受器细胞PI3K/AKT通路及Ang-1蛋白水平作用的研究

目的 探讨间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)下外泌体对视网膜光感受器细胞PI3K/AKT通路及Ang-1蛋白水平的影响。 方法 应用免疫印迹检测人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UCMSCs)外泌体表面标志蛋白CD63及CD90 ,应用流式细胞仪检测光损伤661W细胞凋亡,应用免疫荧光检测Ang-1,应用免疫印迹检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达。 结果 形态学及免疫印迹检测CD63、CD90表达结果证实h UCMSCs外泌体。线粒体膜电位检测结果以及细胞形态学鉴定661W细胞建立光损伤模型成功。流式细胞仪、免疫荧光检测结果显示,与正常组比较模型组细胞凋亡率及Ang-1阳性表达增加,在经过h UCMSCs干预后有所降低,且呈现出明显的浓度依赖性（P<0.05）。免疫印迹结果显示,与正常组比较,模型组PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表达降低,经过h UCMSCs干预后有所升高（P<0.05）,且高浓度组PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表达水平与激动剂组比较无差异（P>0.05）,模型组PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表达水平高于抑制剂组（P<0.05）。 结论 间充质干细胞下外泌体可能是通过激活PI3K/AKT通路,抑制了视网膜光感受器细胞的凋亡以及Ang-1的水平,从而对光损伤视网膜起保护作用。     

NO供体对大鼠成骨细胞增殖分化及BMP-2表达的影响

目的:研究NO对大鼠成骨细胞的增殖分化、碱性磷酸酶(ALP)活性及对BMP-2表达的影响。方法:体外分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞,加入不同浓度的NO供体(NOC-18),不同时间段采用噻唑蓝(MTT)比色法检测成骨细胞增殖,测定细胞ALP活性;应用免疫细胞化学法检测BMP-2的表达。结果:3个浓度组NO对成骨细胞均有显著的增殖作用,3组成骨细胞BMP-2表达均增加,其中以NOC-18 10μmol组对成骨细胞增殖的作用最强。结论:NO对大鼠成骨细胞增殖和分化有双重调节作用,适量低浓度的NO能够刺激成骨细胞增殖分化,增强细胞的骨形成作用,提高成骨细胞ALP活性;高浓度NO对成骨细胞的增殖分化作用弱,NO对成骨细胞的作用与调节和细胞BMP-2的表达有关。     

AdEasy1/Cbfα1诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的观察核心结合因子α1(Cbfα1)对兔骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化的诱导作用.方法体外分离培养兔骨髓MSCs,用AdEasy1/Cbfα1转染MSCs,在转染后3 d、1、2、3和4周时,组织化学和免疫组化等方法检测成骨标志碱性磷酸酶和骨钙素的表达.结果AdEasy1/ Cbfα1转染后的兔骨髓MSCs表现出与成骨细胞相似的形态,并且表达碱性磷酸酶和骨钙素.结论Cbfα1可诱导兔骨髓MSCs向成骨细胞分化.     

食管癌细胞来源的外泌体对肿瘤细胞迁移及侵袭能力的影响及机制研究

目的 探讨食管癌KYSE410细胞来源的外泌体对肿瘤细胞迁移及侵袭能力的影响及其机制.方法 超速离心法分离食管癌KYSE410细胞培养上清中的外泌体;采用透射电镜及Western blotting观察所获得的外泌体的形态及其标志物;共聚焦显微镜观察KYSE410、KYSE510和YES2细胞摄取荧光染料标记的KYSE410外泌体;采用Transwell小室实验分析3种食管癌细胞的迁移及侵袭能力以及KYSE410外泌体对3种食管癌细胞迁移及侵袭能力的影响;Western blotting检测Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信号通路相关蛋白的变化.结果 透射电镜下观察KYSE410外泌体具有膜结构,直径分布在30～100nm;3种食管癌细胞的迁移及侵袭能力从大到小依次为KYSE410、KYSE510、YES2;KYSE410外泌体能够促进KYSE410、KYSE510、YES2细胞迁移及侵袭能力并增强3种食管癌细胞中β-catenin和p-Akt的表达.结论 来源于高迁移及侵袭能力的食管癌KYSE410细胞的外泌体能够促进自身和低迁移及侵袭能力的食管癌KYSE510、YES2细胞的迁移和侵袭,并且可能通过激活Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信号通路发挥上述作用.     

RNF185的克隆及过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

目的克隆RNF185全长基因,构建真核表达载体,检测其蛋白表达和亚细胞定位,并探讨RNF185过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法 TRIzol法提取人胚肾HEK293T细胞的总RNA,经RT-PCR反应扩增出RNF185基因,并通过酶切连接将其构建到真核表达载体pCMV-Myc和pEGFP-N1上,阳性克隆经PCR及酶切鉴定后测序。测序正确后抽提质粒作为模板扩增N端截短体,构建其真核表达载体。转染MC3T3-E1检测其蛋白表达及亚细胞定位情况。采用碱性磷酸酶染色法分析RNF185过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。结果①完成了RNF185的分子克隆,构建的真核表达载体pCMV-Myc-RNF185测序正确,所获得的序列与GenBank中收录的序列完全一致,N端截短体测序正确;②成功转染至MC3T3-E1细胞,蛋白相对分子质量大小与预期一致,全长形式定位于质膜;③RNF185及其N端截短体过表达均可抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。结论 RNF185过表达可抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。     

复合新型骨基质材料体内外成骨能力的组织工程研究

为评价一种新型无机－有机复合骨基质材料（new bone-martrix material,NBM)的体内外成骨能力，取骨髓基质干细胞来源的成骨细胞与材料进行体外复合培养，复合体再行肌内植入，通过相差显微镜，扫描电镜以及组织学观察体内外成骨情况。结果发现，体外培养时成骨细胞与材料可发生良好的粘附、增殖、并分泌大量细胞外基质成分，而细胞－材料复合体肌内植入后4周可见大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，8周仍未见新生骨组织生成。作者认为NBM的这种体内外成骨能力的差异可能与NBM具有免疫原性，引起宿主免疫反应，从而丧失体内成骨环境有关。     

骨源性外泌体微小RNA对骨代谢的影响研究进展

外泌体能够参与各种体内的细胞活动,与细胞间的通讯有关。研究显示骨骼相关细胞产生的外泌体,其中含有的微小RNA能够在调节骨代谢的过程中发挥重要的作用,作者就骨源性外泌体微小RNA在骨代谢中作用的研究进展进行综述。     

富勒醇对基于悬滴培养的脂肪间充质干细胞成骨分化的影响

目的 探讨富勒醇对基于悬滴培养的大鼠脂肪间充质干细胞(rADSCs)向成骨细胞分化的影响.方法 将rADSCs通过悬滴培养3d形成大鼠脂肪间充质干细胞球,将细胞球用胰酶消化分散成单细胞,对获得的单细胞进行二维贴壁培养24h,然后更换为成骨诱导培养基培养,其中未添加富勒醇组为对照组,添加1.0μmol/L富勒醇组为实验组,诱导分化14d及21d后利用茜素红染色和实时定量PCR检测脂肪干细胞球来源的单细胞向成骨细胞分化的能力.结果 悬滴培养3d的rADSCs可形成大小均一的微球结构,经胰酶消化分散可获得细胞球来源的单细胞.与对照组相比,在成骨诱导培养基中添加1.0μmol/L富勒醇可使所获单细胞形成更多的矿化的钙结节,且相关成骨基因Runx2、OCN、Col I的表达增强.结论 富勒醇可以显著增强基于悬滴培养获得的rADSCs的成骨分化,有助于提高其成骨诱导的效率.     

肝癌干细胞分泌外泌体对肝癌恶性生物学行为调控研究

目的探讨肝癌干细胞通过分泌外泌体对肝癌恶性生物学行为进行调控的潜在可能性。方法利用免疫磁珠分选技术,对HepG2肝癌细胞中的干性细胞亚群进行分选,富集CD133+肝癌细胞,将其分为对照组与实验组。分别应用CD133-HepG2细胞培养上清液、CD133+HepG2细胞培养上清液与正常培养基按照相同比例配置,培养肝癌HepG2细胞系。比较两组的细胞增殖、细胞侵袭能力。提取上清液中外泌体进一步分析其作为诱导作用介质的可能性。结果成功分离得到CD133+HepG2肝癌细胞,经Western-Blot及Real-time PCR鉴定结果显示,CD133蛋白显著高表达,CD133基因显著扩增,肝癌干细胞被显著富集。实验组应用含有CD133+HepG2肝癌细胞上清液培养肝癌细胞系HepG2,其细胞增殖、侵袭能力均显著增强(P<0.05)。本研究成功在CD133+HepG2肝癌细胞上清液中提取出外泌体。结论外泌体作为细胞间信息通讯的重要载体,参与了肝癌细胞信号传递过程,而肝癌干细胞所分泌的外泌体因其携带干性相关调控信号,其对周围肝癌细胞的发生、发展起到正向调控作用,促进肝癌细胞的恶性增殖能力。     

模拟失重对大鼠承重骨骨髓基质细胞数及体外成骨能力的影响

目的 研究模拟失重条件对大鼠后肢承重骨成骨细胞数及体外成骨能力的影响。方法 选用20只SD大鼠，随机配对分为鼠尾悬吊组和对照组，每组10只，鼠尾悬吊28d。将股骨骨髓基质细胞进行原代和传代细胞培养，细胞计数法和噻唑蓝法绘制生长曲线，进行碱性磷酸酶(ALP)活性及体外矿化小结形成量的检测。结果 悬吊组培养系的股骨基质细胞数明显减少，约是对照组细胞数的50％。悬吊组和对照组细胞生长曲线和倍增时间相似。原代培养中悬吊组ALP活性和小结形成量同对照组相比较显著下降；传代培养中细胞接种密度相同，悬吊组ALP活性和小结形成数较对照组明显降低。结论 去负荷对骨髓基质细胞数有抑制作用。骨髓成骨祖细胞减少，导致分化的成骨细胞数减少，成骨能力减弱。     

人脐带间充质干细胞来源的外泌体促进小鼠成骨前体细胞增殖与分化

 

目的 提取人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSCs)来源的外泌体(hucMSC-exo),观察其对小鼠成骨前体细胞(mouse osteoblast progenitor cells, mOPCs)的作用。方法 体外分离培养hucMSCs,超速离心法收集外泌体;采用CCK8试剂盒检测不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs增殖的影响,碱性磷酸酶活性检测以及茜素红染色观察不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs矿化的影响。结果 成功提取hucMSCs,呈现旋涡状贴壁式生长,形态呈长梭形,具有多向诱导分化潜能。HucMSCs来源的外泌体呈圆形、椭圆形,大小在80 nm左右最多,阳性表达CD9,CD63。CCK8法结果显示5、10 μg/ml的hucMSC-exo可以显著地促进mOPCs在体外的增殖(P<0.05),碱性磷酸酶和茜素红染色结果发现5、10 μg/ml的hucMSC-exo组可以明显提高mOPCs碱性磷酸酶活性及钙化结节的形成,且10 μg/ml的外泌体浓度作用强于5 μg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 成功提取了hucMSCs及hucMSC-exo,hucMSC-exo可以以浓度依赖的方式促进mOPCs的增殖与成骨分化。

     

骨延长区假性生长板及其成骨方式的组织学观察

目的:了解骨延长区假性生长板及其成骨方式的组织学特点。方法:新西兰白兔造成左胫骨中段骨延长模型。定期取材,石蜡包埋,纵向切片,HE及饱和苦味酸天狼星红染色,普通光镜及偏光显微镜观察。结果:骨延长区假性生长板内见大量的成纤维样间充质细胞,这些间充质细胞不断地分化为成纤维细胞、成骨细胞和成软骨细胞,而后形成新骨组织。结论:骨延长区假性生长板由成纤维样间充质细胞构成,其成骨方式有:(1)膜内成骨;(2)软骨内成骨;(3)纤维内成骨3种方式。     

人骨形态发生蛋白-2基因转染脂肪源性间充质干细胞的成骨研究

目的 探讨人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因修饰的人脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）的成骨能力及基因转染对ADSCs成骨分化的生物学调控。方法 流式细胞技术鉴定从人脂肪组织中提取的细胞为间充质来源的干细胞。将ADSCs转染hBMP＋2基因，免疫沉淀＋Western blotting法和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测hBMP-2表达，确定hBMP-2表达量及表达稳定性，碱性磷酸酶（ALP）染色、ALP定量测定、钙结节染色及RT—PCR分析hBMP-2基因转染对ADSCs向成骨细胞转化的调控，并将转基因细胞注入裸鼠股部肌内，通过X线及组织学检查观察体内成骨情况。结果 流式细胞术证实从脂肪中提取的细胞为间充质来源的干细胞。转基因后免疫沉淀＋Western blotting法和ELISA法显示转染hBMP-2的ADSCs具有较高且稳定的hBMP-2的表达，转染21d后表达量无明显降低。ALP染色、ALP定量测定、钙结节染色及RT—PCR发现转基因ADSCs向成骨细胞方向发生分化。裸鼠肌内注射转基因细胞后2周即显示有异位骨形成，4周明显增多，对照组无骨组织形成。结论 转染hBMP-2基因的ADSCs在持续稳定高表达目的蛋白的同时，自身向成骨细胞发生分化，并在裸鼠体内形成异位骨。因此，ADSCs有望作为新的基因工程种子细胞。     

热打击单核细胞外泌体高迁移率族蛋白B1对内皮细胞炎症的作用

目的 观察热打击单核细胞外泌体高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对内皮细胞炎症的作用。方法 制备中暑大鼠模型，将大鼠分为对照组(n=6)与中暑组(n=6)，分离单核细胞提取外泌体并进行鉴定；对外泌体蛋白进行质谱分析并采用注释数据库进行功能描述；采用Western blotting及酶联免疫吸附法(ELISA)分别验证中暑大鼠及患者单核细胞来源外泌体HMGB1的表达变化；将脐静脉内皮细胞(HUVECs)分为对照组、中暑组以及中暑+丙酮酸乙酯(ethylpyruvate,EP)组，分别添加来自对照组、中暑组大鼠外周血单核细胞上清中提取的外泌体及EP，采用RT-qPCR及Western blotting检测内皮细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)及白细胞介素-1β(IL-1β)的表达水平；采用ELISA检测健康志愿者及中暑患者外泌体NLRP3及IL-1β的表达水平。结果 与对照组比较，中暑组大鼠单核细胞来源外泌体数量(×10⁴/单核细胞)明显增多(11.24±2.66vs.1.52±0.21,P<0.001)。蛋白质组学分析表明中暑组外泌体HMGB1...     

Runx2特异性siRNA筛选和功能鉴定

目的:筛选Runx2特异性siRNA,优化反应条件,抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化,探讨异位骨化基因治疗的新思路。方法:使用Ambion公司提供的网上工具,设计5条针对小鼠Runx2的mRNA的模板,用体外转录合成法合成5条siRNA;采用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质两个水平,在培养的MC3T3-E1成骨前体细胞中筛选有明显抑制作用的siRNA,并优化反应条件。将筛选出的siRNA转染成骨细胞,在不同时间点检测成骨细胞相关基因I型胶原、骨桥蛋白、骨钙蛋白、骨涎蛋白mRNA的表达,采用碱性磷酸酶活性分析检测碱性磷酸酶活性的变化。结果:在合成的5条siRNA中,siRNA1657-1677对Runx2的抑制效果最明显,最佳反应条件是:浓度80nM、脂质体/siRNA为1∶1、转染时间为72小时。采用RNAi技术抑制Runx2的表达可以抑制成骨相关基因如I型胶原、碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙蛋白等的表达,阻止成骨细胞分化。结论:Runx2特异性siRNA可以抑制成骨细胞分化,可用于异位骨化基因治疗的实验研究。