小鼠卵母细胞体外成熟培养系统的建立与优化

目的 探讨激素刺激时间、体外培养时间对小鼠卵母细胞核成熟及不同激活方案对卵母细胞孤雌激活、胚胎发育能力的影响。方法 孕马血清促性腺激素（PMSG）超排处理,在体外培养的不同时间点检测卵母细胞核成熟率（每个处理至少重复3次,3只/重复,以下实验相同）。
分别采用乙醇结合6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）法和SrCl₂ 法激活卵母细胞,胚胎培养液选用CZB［胎牛血清（FBS）或牛血清清蛋白（BSA）］两种,确定最佳激活方案。对不同时间点成熟的卵母细胞进行激活,确定最佳激活卵龄。研究缩短PMSG刺激时间对卵母细胞发育的影响。结果 将
PMSG刺激时间从46h缩短至24h,卵母细胞获得最高核成熟率（97.6% vs 91.9%）的培养时间由14h延长至16h;缩短PMSG刺激时间,核成熟率不受影响,但能显著降低激活率（91.2% vs 37.1%）和囊胚率（20.9% vs 0.0%）。 两种方法体内成熟卵母细胞激活率均高于90%,但囊胚率差异
显著(P<0.05)。卵母细胞体外培养至24~26h时,激活率（89.5%）和囊胚率（21.9%）均达到最高点。结论 建立了一种小鼠卵母细胞体外成熟培养系统,即PMSG超排处理46h、卵母细胞培养24h,CZB（10mmol/L SrCl2）激活2.5h后采用CZB（0.5%BSA）进行胚胎培养。     

玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞孤雌发育的影响

目的 探讨玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞孤雌发育的影响.方法以小鼠MⅡ期卵母细胞为模型,将未经冷冻直接进行培养的卵母细胞设为对照组,将经玻璃化冻融后再进行培养的卵母细胞设为试验组,观察是否出现单原核或卵裂及囊胚形成情况.结果未经玻璃化冻融处理的卵母细胞有2.96%发生孤雌发育,而经玻璃化冻融处理的卵母细胞孤雌发育率达13.50%,两者存在明显差异.(P<0.05),但均未见囊胚形成.结论玻璃化冷冻可诱发卵母细胞发生孤雌发育,但这些孤雌发育的胚胎难以发育到囊胚阶段.     

小鼠孤雌胚胎及孤雌胚胎干细胞中印记基因的表达

小鼠孤雌胚胎体内发育最多不能超过10.5d,发育失败的主要原因是胚外组织发育缺陷和印记基因表达的异常。随着小鼠孤雌二倍体和单倍体胚胎干细胞的建系成功,不仅能作为研究印记基因的理想模型,还能够作为种子细胞应用于细胞治疗,拓宽了小鼠孤雌生殖的研究领域和再生医学应用范围。孤雌胚胎聚合作为一种简便易行的技术手段,能够显著提高孤雌胚胎干细胞的建系效率,还能促使异质胚胎间的印记基因相互补偿从而更加趋近于正常受精的胚胎干细胞。我们在文中主要阐释了小鼠孤雌胚胎、孤雌聚合胚胎、孤雌二倍体胚胎干细胞、孤雌单倍体胚胎、孤雌聚合胚胎干细胞中印记基因的表达。     

人工激活胚胎的性染色体分析和IGF-Ⅱ表达研究

目的 观察钙离子载体A23187联合嘌呤霉素激活胚胎的性染色体和胰岛素样生长因子-Ⅱ（insulin-like growth factor-Ⅱ，IGF-Ⅱ）表达。方法 收集体外成熟周期（in vitro maturation and intracytoplasmic sperm injection，IVM-ICSI）和卵母细胞单精子显微注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）中受精失败的卵母细胞95枚，采用钙离子载体A23187和嘌呤霉素激活。应用荧光原位杂交技术分析来源于2PN2PB胚胎的性染色体；免疫组化检测IGF-Ⅱ的表达，并与正常胚胎、孤雌胚胎相比较。结果 钙离子载体A23187联合嘌呤霉素能有效地激活ICSI后22h未受精卵母细胞，激活胚胎能发育到囊胚阶段。激活胚胎的性染色体为5枚XX，8枚XY。激活胚胎的IGF-Ⅱ表达与正常胚胎相近，明显较孤雌胚胎增强。结论 钙离子载体A23187联合嘌呤霉素是一种安全、有效的激活方式，有希望成为ICSI受精失败的有效补救措施。     

孤雌胚胎干细胞来源的诱导多能干细胞的建立及对印记基因表达的影响

目的 通过诱导多能干细胞（iPSCs）技术重编程孤雌胚胎干细胞,探讨iPSCs技术对孤雌胚胎干细胞的多能性及印记基因的影响。方法 从孤雌激活的囊胚中建立了孤雌胚胎干细胞;利用反转录病毒将多能性转录因子转入孤雌胚胎干细胞中,建立孤雌iPS细胞。 结果 建立的孤雌来源的iPS细胞体内外分化能力与孤雌胚胎干细胞的差别无显著性;Real-time PCR结果显示,孤雌iPS细胞母源印记基因的表达明显高于孤雌胚胎干细胞,父源印记基因表达下降,多能性基因表达升高。 结论 iPSCs技术能影响基因的表达,尤其是印记基因,印记使其更接近于正常受精来源的胚胎干细胞中印记基因水平。     

孤雌胚胎干细胞的基因组印迹

孤雌发育是卵母细胞在没有精子参与的情况下启动胚胎发育的现象,常见于植物和许多低等动物.哺乳动物成熟的卵母细胞在一定的理化条件刺激下可以被激活,开始胚胎发育,像正常的二倍体受精卵一样经历2-细胞、4-细胞、8-细胞、致密、囊胚,然后着床.但是孤雌胚胎在体内一般只能发育到妊娠9.5天(Surani, 1983),并且胚外组织发育异常,这是由于父源印迹基因的表达缺失造成的.     

新生小鼠脑内移植荧光标记的孤雌胚胎干细胞的研究

目的通过将孤雌胚胎干细胞(parthenogenetic embryonic stem cells,PgESCs)移植到新生鼠脑内,观察其增殖及向神经细胞方向分化的形态特点。方法分别向出生24h及72h小鼠脑内注射增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)标记的孤雌胚胎干细胞,并于移植3d和7d后进行取材、观察。结果与对照组相比,出生24h和72h后进行干细胞移植的新生鼠中,移植3d后,孤雌胚胎干细胞可以稳定的在小鼠脑内生长,形态和分布无明显变化;7d后能够分化为具有神经细胞样突起的细胞团。结论 PgESCs具有胚胎干细胞相似的体内分化潜能,为中枢神经系统疾病的细胞替代治疗奠定理论基础。     

不同光照制对小鼠超排卵的影响研究初报

目的 探讨不同光照制对小鼠卵母细胞成熟和激活的影响。方法 分别取四周和七周龄昆明种小鼠作短期持续光照，持续黑暗，反相光照1及24种光照制处理，观察小鼠超排卵母细胞数量。排极，存活率及乙醇孤雌激活率的变化。结果 4周龄，7周龄小鼠各实验组超排卵数目和乙醇孤雌激活率均显著低于对照组。反相光照1组（昼夜颠倒光照）卵母细胞存活率明显降低。但各实验组卵母细胞极体释放率与对照组相比均无显著性差异。结论 异常光照周期可影响小鼠卵母细胞的成熟和激活能力。     

Ca2+载体A23187对受精失败人类成熟卵母细胞的补救激活作用

目的:观察Ca²⁺载体A23187对受精失败人类成熟卵母细胞的补救激活及激活后的胚胎发育情况。方法:收集常规体外受精(IVF)及卵浆内单精子注射(ICSI)后24h仍无受精征象的成熟卵母细胞作为研究对象,5μmol/LCa²⁺载体A23187中处理5min,观察第二极体排出及原核形成情况,激活后卵母细胞在体外继续培养2d。结果:IVF组及ICSI组卵母细胞激活率分别为64.9%(24/37)和73.2%(30/41)。ICSI组受精失败卵母细胞激活后主要表现为二极体二原核(2PB+2PN)(80%,24/30),而IVF组仅有20%的被激活卵母细胞表现为2PB+2PN,两组间差异具极显著(P＜0.01)。31个2PN卵母细胞继续培养,25个发生分裂,11个发育到2-4细胞,8个发育到4-8细胞,6个发育到8-细胞以上阶段。结论:Ca²⁺载体A23187能够有效地激活ICSI后受精失败卵母细胞恢复受精并继续发育成胚胎。     

利用亮甲酚蓝染色筛选优质猪卵母细胞

目的 利用亮甲酚蓝(BCB)染色提高猪体外胚胎培养体系的效率.方法 对猪卵丘卵母细胞复合体(COCs)进行BCB染色,观察染色后猪卵母细胞成熟率和早期胚胎发育能力并进行分析. 结果 着色组(BCB+)猪卵母细胞达到减数分裂Ⅱ(MⅡ)期的比率(91.6%)显著高于未着色组(BCB-)(64.0%)和对照组猪卵母细胞(77.5%)(P<0.05);BCB+孤雌猪胚胎的囊胚率(34.9%)显著高于BCB-(9.5%)和对照组(23.1%)(P<0.05);BCB+核移植猪胚胎的囊胚率(23.0%)显著高于BCB-(5.0%)和对照组(14.1%)(P<0.05).结论 BCB染色是一种有效筛选具有较强发育能力猪卵母细胞的方法.     

辅助生殖技术中未受精卵母细胞经人工激活剂作用的激活效果观察

目的观察辅助生殖技术中未受精成熟卵母细胞经钙离子载体A23187联合6-甲基嘌呤(6-DMAP)处理后的激活效果,以及激活后的胚胎发育情况。方法收集常规体外受精(IVF)及卵浆内单精子注射(ICSI)后48h仍未受精的成熟卵母细胞,经5μmol/L钙离子载体A23187处理5min,然后在2mmol/L6-DMAP中处理3h,观察原核形成情况;将激活后的卵母细胞继续体外培养3～5d,观察胚胎发育情况。结果 IVF及ICSI后未受精卵母细胞共36个,激活29个,激活率80.5%,1PN形成率31.0%,2PN形成率51.7%,多原核形成率17.2%;继续培养,卵裂率为48.3%(14/29)。15个2PN中有10个发生卵裂,2个发育至2-4细胞阶段,5个发育至5-8细胞阶段,3个发育至8细胞阶段,最终获得2个桑葚胚。结论辅助生殖技术中未受精卵母细胞可在体外被钙离子载体A23187联合6-DMAP激活,并继续发育形成胚胎。     

卵母细胞形态学特性对卵胞浆内单精子注射技术结局的影响

目的 分析和研究胞浆内单精子注射技术中卵母细胞形态学特性对其结局的影响。方法 此次研究对象一共200例,分成试验组和对照组,每组各100例。对照组采用卵母细胞注射。试验组采用卵母细胞胞浆内单精子注射。测量和统计这两组中,胚胎的发育情况以及胚胎成型后出现的结果等。结果 由研究结果显示,试验组严重畸精症患者采用经卵母细胞胞浆内单精子注射后,由胚胎的发育情况比较可知,胚胎的卵裂率、优质胚胎率、囊胚形成率、胚胎种植率等情况明显高于对照组,存在差别,P0.05。对照组严重畸精症患者采用卵母细胞注射后,胚胎成型结果比较可知,对照组出现流产率高达31%、妊娠率仅有39%,差别可见,P0.05。结论 根据研究结果,胞浆内单精子注射技术中卵母细胞形态学特性对其后胚胎质量的影响极大,在一定程度上增加了精子的着床率,降低了流产率。改善了严重畸精症患者的生育状况,减少了患者痛苦,提高了患者的生活质量。     

诱导人孤雌胚胎干细胞分化为胰岛样细胞团

背景:随着人类孤雌胚胎干细胞系的成功建立,对该细胞的进一步分化功能研究成为新的研究热点。目的:研究体外培养的人类孤雌胚胎干细胞诱导分化为胰岛样细胞团的潜能。方法:自主建系孤雌来源人胚胎干细胞和正常来源人胚胎干细胞各1株,运用基于胰腺体内发育规律的改良5阶段诱导法诱导人孤雌胚胎干细胞为胰岛样细胞团,加入不同生长因子及诱导试剂对人胚胎干细胞分5阶段序贯培养。结果与结论:终末分化细胞光镜下呈团状聚集,RT-PCR、免疫荧光染色检测分化细胞表达胰岛细胞特征性的基因与蛋白。胰岛素释放实验提示获得的细胞具有胰岛样生化功能。由人类孤雌胚胎干细胞来源的胰岛样细胞团具备胰岛的基本特征,是未来治疗1型糖尿病的可用材料。     

Diff-Quik染色法评估精子形态与体外受精胚胎质量的关系

目的探讨Diff-Quik染色法评估精子形态与体外受精胚胎质量的关系。方法在76个IVF周期中,采用Diff-Quik染色后评估精子畸形率,并分析其与IVF受精率、卵裂率、优质胚胎率之间的关系。结果Diff-Quik染色后精子畸形率与卵母细胞受精率呈负相关(P0.05),与卵裂率、优质胚胎率之间关系不显著(P0.05)。结论Diff-Quik染色后精子畸形率越高,受精率越低,但精子形态与胚胎早期卵裂速度及胚胎形态间无明显相关。     

卵胞浆内单精子显微注射受精失败的原因及对策

背景：卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)已经成为治疗男性因素不育的首选方法,且具有很高的成功率,但卵胞浆内单精子显微注射周期的受精失败发生率仍有1%-3%。 目的：简要综述有关卵胞浆内单精子显微注射受精失败的相关因素及其对策。 方法：检索万方数据库、中国知网及PubMed1994年1月至2015年6月与卵胞浆内单精子注射相关研究的文献。阅读文题和摘要,依据纳入排除标准对其中的60篇进行分析探讨。 结果与结论：目前,研究发现卵母细胞激活失败与卵子异常、精子缺陷、患者年龄、显微操作技术及实验室环境等因素密切相关。辅助卵母细胞激活是解决卵胞浆内单精子显微注射后激活失败的关键技术。了解卵胞浆内单精子显微注射受精失败的相关因素后对其采取相应的对策,可以提高卵胞浆内单精子显微注射受精率及改善胚胎发育潜能。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程      

整合蛋白β1在人类卵母细胞和早期胚胎上分布的研究

目的　研究人类卵母细胞体外成熟和体外受精前后 ,以及体外受精后胚胎早期发育的不同阶段 ,整合蛋白 β1的分布规律。 　方法　利用激光共聚焦显微镜和荧光标记的整合蛋白 β1抗体。 　结果　在成熟人类卵母细胞、体外受精的合子以及 2细胞阶段胚胎中 ,整合蛋白 β1的分布不同于在小鼠胚胎中的分布 ,不是分布在细胞质膜的表面 ,而是集中分布在细胞核的附近 ,细胞质膜的表面分布很少。在体外培养的 4细胞和 8细胞胚胎中 ,整合蛋白 β1均匀分布在卵裂球中。发育至桑椹胚阶段 ,整合蛋白 β1的分布开始出现极性 ,到囊胚阶段 ,整合蛋白 β1的分布集中于滋养外胚层处。　结论　整合蛋白分子被普遍认为是卵母细胞上的精子受体 ,但本研究提示 ,人类精子和卵母细胞的结合 ,整合蛋白 β1的影响可能不大。而整合蛋白β1可能与雌雄原核融合、胚胎卵裂以及胚胎着床有关     

卵母细胞滑面内质网聚集体对胚胎发育及妊娠结局的影响

目的探讨卵母细胞滑面内质网聚集体(SERC)对早期胚胎发育、妊娠情况的影响及其原因分析。方法回顾性性分析荆州市中心医院生殖中心于2012年1月至2013年12月行卵胞浆内单精子注射(ICSI)治疗共238周期,其中MII期卵母细胞存在SERC周期28周期(研究组),不存在SERC周期共210周期(对照组)。比较两组患者年龄、HCG日E2、FSH、P、LH水平、子宫内膜厚度、Gn总量、Gn天数、受精率、种植率、临床妊娠率、流产率等的差异。同时比较研究组中SERC+与SERC-卵母细胞的受精率、可利用胚胎率、优质胚胎率。结果两组患者在在年龄、病程、平均治疗周期数、内分泌基础水平、Gn首剂量、子宫内膜厚度、受精率、可利用胚胎率、种植率、临床妊娠率等方面无明显差异性(P0.05);而与对照组相比,研究组在Gn总量及天数、HCG日E2水平、流产率等明显升高(P0.05),优质胚胎率明显降低(P0.05)。研究组中SERC+卵母细胞的优质胚胎率明显低于SERC-卵母细胞(P0.05)。结论 ICSI周期卵母细胞SERC不利于体外胚胎发育及妊娠结局,而SERC现象可能与Gn长时间、大剂量刺激及HCG日高水平E2效应有关。     

人孤雌胚胎干细胞与正常胚胎干细胞分化能力的比较

目的 比较人类孤雌胚胎干细胞(pESCs)系与正常胚胎干细胞(nESCs)系的分化能力,探讨pESCs是否和nESCs一样具有多向分化潜能.方法 将pESCs和nESCs分别注射到重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内形成畸胎瘤,瘤体组织切片和HE染色后进行组织学分析;将pESCs和nESCs体外悬浮培养形成拟胚体(EB),利用RT-PCR检测3个胚层主要器官以及滋养层细胞发育关键基因的表达;将pESCs和nESCs定向诱导分化为滋养层细胞,通过流式细胞仪测定人绒毛膜促性腺激素-β(hCG-β)阳性细胞比例以及通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行hCG-β的定量分析.结果 在体内生长和体外培养过程中,pESCs和nESCs均能够向3个胚层的细胞类型分化.在SCID小鼠体内可形成畸胎瘤,有神经上皮、软骨、腺上皮等3个胚层的衍生物产生;pESCs和nESCs来源的EB在体外自发分化5~21d后,均检测到3个胚层主要器官以及滋养层细胞发育关键基因的表达;pESCs定向分化为滋养细胞后,可以检测到hCG-β的表达,但其阳性细胞比例和分泌量均低于nESCs.结论 pESCs具有向3个胚层以及滋养层细胞分化的能力,但是向滋养层细胞分化的能力仍低于nESCs.     

人成熟卵母细胞玻璃化冷冻技术的临床应用

目的探讨玻璃化冷冻技术应用于人成熟卵母细胞冷冻保存的临床效果。方法使用开放式载体cryotop进行人成熟卵母细胞的玻璃化冻存,对10例患者的冷冻卵子复苏后进行卵母细胞浆内单精子（ICSI）注射后行胚胎移植,观察复苏卵母细胞受精、卵裂、胚胎发育及临床妊娠情况。结果 10例患者共86枚玻璃化冻存的成熟卵母细胞复苏后77枚存活,69枚正常受精,获得65枚胚胎,共移植17枚胚胎,3例患者获临床妊娠,其中2例双胎妊娠。结论玻璃化冷冻技术是有效地保存人成熟卵母细胞的方法,有一定的临床应用价值。     

体外成熟卵母细胞受精方式及发育能力的影响因素

目的 探讨体外成熟卵母细胞的受精方式及影响其胚胎发育的因素.方法 收集本院2008年7月至12月因男性因素需进行卵母细胞胞浆内单精子注射术(ICSI)助孕的135对夫妇未成熟的卵母细胞(DO)354枚,置入P1培养体系中观察培养20～24、26～30、36～40 h后的成熟情况.去除了退化的成熟卵母细胞,随机分为常规体外受精(IVF)和ICSI组,比较2组的正常受精率、卵裂率、第3天优质胚胎率及各组优质胚胎和非优质胚胎的患者年龄、不孕年限、促排时间及卵母细胞体外成熟时间.结果 卵母细胞体外成熟率为82.5%(292/354),IVF组正常受精率56.5%(70/124)低于ICSI组69.9%(107/153)(P<0.05).两组卵裂率和优质胚胎率差异无统计学意义(P>0.05).2组组内优质胚胎的患者年龄、体外成熟时间均小于非优质胚胎(P<0.05);不孕年限及促排时间差异无统计学意义(P>0.05).结论 ICSI能够提高体外成熟卵母细胞的受精率.体外成熟卵母细胞具有常规受精的能力,第3天胚胎质量与ICSI相似.患者年龄和卵母细胞体外成熟时间是体外成熟卵母细胞发育能力的主要影响因素.