人脐带间充质干细胞的生物学特性、分化及应用研究

间充质干细胞是一类存在于多种组织、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞。由于作为间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）经典来源的骨髓组织,可随老化而致干细胞含量及其增殖能力显著降低^[1],而且其标本需要通过骨髓穿刺来获取,是一个侵袭性、有创伤、易污染的过程。因此,寻找新的MSC来源有着重要意义。     

脂肪来源干细胞的多向分化性及其在组织工程中的应用

近期研究表明间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）可以从脂肪组织获得,这类细胞被称为脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）。ADSCs与骨髓来源MSC具有相似的多向分化性,并且存在容易获取、取材创伤小和细胞获得量大等优点,因此有望成为组织工程中另一种很有前景的种子细胞来源。本文介绍了ADSCs多向分化性的最新研究进展,以及在各种组织工程中的应用情况。     

HGF基因修饰增强间充质干细胞的免疫抑制作用

目的：探讨HGF基因在间充质干细胞（mesenehymal stem cell，MSC）中过表达对细胞生物学的影响，为扩充MSC临床应用范围提供依据。方法：用携带HGF基因的重组腺病毒感染人骨髓来源的间充质干细胞后。与对照细胞相比，进行以下项目的检测：FCM测定细胞表型；MTT法测定细胞增殖能力；ALP和钙定量以及组织化学染色检测细胞体外成骨和成脂肪能力；^3H—TdR掺入法测定MSC—HGF对混合淋巴细胞反应中效应细胞增殖活性的抑制作用。结果：HGF基因转染后MSC表型、体外增殖和分化能力无改变；混合淋巴细胞反应中，MSC—HGF对异基因抗原诱导的淋巴细胞增殖活性的抑制效应存在剂量依赖关系；MSC—HGF／MSC与效应细胞比例为1：80时，MSC组淋巴细胞增殖活性（cpm值）降低19．8％，MSC—HGF组降低68．3％，抑制率是MSC组的3．45倍。结论：HGF基因转染的人骨髓MSC仍维持固有的增殖和分化能力，而对体外细胞免疫反应具有更强的抑制效果，提示MSC—HGF在造血干细胞移植和器官移植中的潜在应用价值。     

人骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化

为建立分离纯化、大鼠扩增人骨髓间充质MSC，改进其冰冻保存的方法，并初步探索其体内向软骨细胞分化的最佳方法，以Percoll(1.073g/ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞，用含经筛选的10％的胎牛血清的低糖DMEM体外培养扩增骨髓干细胞（MSC），FCM鉴定细胞纯度，传代2次以后的细胞吸附于明胶海绵内，以TGF－β为主要刺激因子体外诱导1周，植入裸鼠皮下。在不同的时间取出组织块，甲苯胺蓝染色显示细胞外基质。结果发现，体外培养扩增的人间充质MSC表达CD166、CD29、CD44等表面抗原，不表达CD34、CD45、HLA－DR等抗原；MSC可以不经消化，直接在原培养瓶内冻存在－70℃低温冰箱，3个月后复苏的细胞生物学特性没有明显改变；体外诱导的细胞植入裸鼠皮下4周后即出现软骨细胞特有的结构。说明骨髓MSC具有独特的生物学特征，体外培养的MSC具有体内成软骨能力，应用MSC构建软骨组织具有一定的可行性。     

脐血间充质干细胞的培养及诱导分化的研究进展

骨髓是间充质干细胞的丰富来源,但是关于脐血及循环血中是否存在MSC,在研究初期一直存在争议。2000年,Erices等首次报导了从脐带血中分离培养出低密度类似骨髓MSCs的贴壁细胞,其表达SH1,SH2等间充质细胞标志抗原,并可分化成为成骨细胞和脂肪细胞,其免疫表形和功能特点与骨髓来源的MSC极为相似,同时发现早产儿脐血中间充质干细胞的含量要较足月儿丰富。有研究者证明,脐带血中含有间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）,并且具有多向分化潜能和很高的可塑性。     

miRNAs在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的观察miRNAs在人骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达情况。方法以从骨髓中分离培养的人骨髓MSC为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),经多聚腺苷酸化和5'连接子连接后进行反转录,扩增克隆到得到大约109bp的DNA片段,测序后经生物信息学分析确定miRNAs的表达情况。选取部分miRNAs和新发现miRNAs,合成相应探针,与从人骨髓MSC、人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和大鼠成骨肉瘤细胞系UMR-106中分离出的小片段RNA进行杂交验证(Northernblot)。结果成功从骨髓中分离培养出骨髓MSC,流式细胞仪检测93%以上的MSC表达CD44,但不表达CD34、CD45。从MSC中克隆测序得到194个克隆体,经生物信息学分析发现52个miRNAs(27种),其中包括26种已知的miRNAs和1种Nature杂志预测的miRNAs(PRE-DICTED-miR-202)。选取4条miRNAs(miR-495、miR-34a、miR-17-5p和PREDICTED-miR-202)进行Northernblot验证,发现它们均在MSC中表达。其中miR-34a和PREDICTED-miR-202只表达于MSC,miR-495在MSC和SOSP-9607中表达,miR-17-5p在3种细胞中均有表达。结论筛选出了在人骨髓MSC中表达的miRNAs,为miRNAs参与调控MSC的自我更新提供了依据,同时为miRNAs在干细胞中的潜在应用奠定了基础。     

不同来源成骨细胞生物学特性的比较研究

目的　比较从同一胚胎来源的骨膜成骨细胞、颅骨成骨细胞和骨髓基质干细胞的分裂增殖能力和细胞的功能状态。　方法　从人5个月龄胚胎骨膜、颅骨和骨髓组织中分离培养出骨膜成骨细胞（periostealosteoblast,POB）、颅骨成骨细胞（cranialosteoblast,COB）和骨髓基质干细胞（marrowstromalcell,MSC）,用第6代细胞进行比较研究。观察细胞形态和超微结构;通过细胞生长曲线和     

不同来源的间充质干细胞生物学特性差异研究进展

各种来源的问充质干细胞（MSC）除满足国际细胞治疗协会（ISCT）规定的要求外,在表面标记物、增殖、分化、迁移、生物学功能方面有其差异性,骨髓MSC研究最早,最为透彻,但其增殖效率低,易被污染等劣势限制了其应用;脂肪、脐血、脐带、羊水、胎盘来源的MSC取材方便,传代能力强,免疫反应低,被污染的概率较小,无伦理学限制等优点逐渐被人们重视,且利用不同MSC的优劣势将其应用于不同的领域。笔者通过查阅国内外相关文献,从细胞表面标记物,增殖、分化、迁移能力,以及功能方面进行分析总结,初步探讨了各种来源的间充质干细胞的优缺点．为今后临床选取合适弹摁的种子细晌提供帮助。     

DiR标记的骨髓间充质干细胞植入物在兔膝关节软骨缺损修复中的荧光分子断层成像研究

正摘要目的评价近红外染料1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-四甲基吲哚三碳菁碘(Di R)对兔骨髓间充质干细胞的(MSC)标记效率;使用荧光分子断层扫描X线计算机断层扫描(FMT-XCT)检测兔模型中骨软骨缺损修复的骨髓间充质干细胞。方法从新西兰白兔分离骨髓间充质干细胞,用Di R(1.25~20μg/m L)标记。通过XTT和Caspase-3/-7检测评估细胞凋亡的活力和诱导情况。通过测定糖胺聚糖来评估软骨形成能力。标记细胞和未标记的对照(n=3)在软骨形成分     

人胚胎骨髓间充质干细胞在大鼠体内分化为肝细胞的研究

目的：观察人胚胎骨髓间充质干细胞(MSC)在受体大鼠体内的分化演变，研究人胚胎骨髓间充质干细胞在活体大鼠体内转化为人肝细胞的可行性。方法：将人胚胎MSC移植到肝损伤合并自身肝细胞再生抑制大鼠的脾脏。术后分时段取脾脏进行免疫组化染色，了解人白蛋白(ALB)、人角蛋白(CK8)、人CK18、人CK19的表达情况。结果：人胚胎MSC移植后10d大鼠脾脏的人CK8、人CK18、人CK19免疫组化染色可见阳性细胞；移植后15d大鼠脾脏组织内人ALB免疫组化染色可见阳性细胞。结论：人胚胎MSC能够在自身肝细胞再生抑制的肝损伤大鼠脾脏内分化为肝细胞。     

干细胞治疗终末期肝病的进展与挑战

干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞,具有无限自我更新能力,可以分化成特定组织,修复各种损伤.骨髓是成体干细胞的重要来源,主要含骨髓造血干细胞和间充质干细胞.目前利用干细胞治疗终末期肝病越来越受到关注.本文从体外、动物实验和临床研究三个方面总结了干细胞特别是成体干细胞治疗终末期肝病的研究进展,重点阐述各种来源干细胞在临床应用中取得的进展,探讨干细胞治疗终末期肝病的可能机制,提出目前研究存在的问题,展望未来的应用前景.     

骨髓间充质干细胞体外培养和成骨诱导

目的：观察骨髓问充质干细胞（MSC）体外培养及诱导成骨分化的特征。方法：采用密度梯度离心和体外扩增培养人骨髓MSC,并进行成骨诱导。应用茜素红染色法和钙钴法分别进行成骨诱导的MSC钙化结节检测和碱性磷酸酶（ALP）检测。结果：MSC成骨细胞诱导培养第l～3天的细胞增殖旺盛,3～5d即融合成单层。随着诱导培养时间的延长,细胞逐渐堆积并矿盐沉积,形成矿化结节。培养14d和21d后,矿化结节形成率分别为（70．5±3．5）％和（87．5±3．5）%,ALP染色阳性率分别为（41．5±1．5）％和（85．2±1．7）％。结论：在体外培养条件下,骨髓MSC可诱导分化为具有含矿化结节及ALP阳性特征的骨样细胞。     

shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统中的长期高效表达

目的构建在小鼠造血干细胞中高效表达的shRNA重组慢病毒载体并研究其在小鼠造血系统中的长期稳定表达。方法将p-CMV和重组并鉴定正确的p-SFFV慢病毒载体与辅助病毒载体PAX2和PMD2G混合后,采用磷酸钙方法共转染293T包装细胞,获得具有感染能力的成熟慢病毒感染经流式细胞仪分选并体外培养的小鼠骨髓造血干细胞,分析其表达效率后,选取感染效率较高的p-SFFV慢病毒载体感染小鼠骨髓造血干细胞,并通过骨髓移植技术输入放射线照射后的小鼠体内。在移植后4周和9周分别获取小鼠外周血样本,移植后16周获取小鼠骨髓样本,分析供体细胞在小鼠体内的表达。结果成功重组了p-SFFV慢病毒载体并在小鼠骨髓造血干细胞中高效表达（感染效率72.4%）;骨髓移植实验表明,携带外源性shRNA的慢病毒载体可在小鼠造血系统内长期稳定表达（感染效率92%）。结论shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统中可长期稳定表达。     

骨髓间充质干细胞治疗肢体缺血的研究进展

治疗性血管新生（therapeutic neovascularization）主要是利用促血管生长因子如（VEGF、FGF）或干细胞通过血管再生（angiogenesis）的方法在组织缺血区域生长新生血管，改善血供。研究证实，骨髓间充质干细胞（MSC）可诱导定向分化为血管内皮细胞和肌细胞，分泌各种血管生长因子。由于MSC有取材方便、可体外大量培养增殖、低免疫原性等优点，有望成为治疗性血管新生的主要种子细胞来源。     

间充质干细胞治疗慢性创面的现状与展望

随着间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)研究的不断深入,部分专家学者发现,MSC在慢性创面治疗领域具有巨大潜力,遂笔者通过收集大量研究数据,查阅国内外相关文献,总结了MSC在慢性创面治疗中的研究进展,分析了MSC在表皮再生、神经肌肉再生以及免疫调控等方面发挥的作用,以期为间充质干细胞在慢性创面治疗中的进一步研究提供思路与帮助。     

神经生长因子修饰的间充质干细胞促进兔下颌骨牵张成骨时下牙槽神经损伤修复的实验研究

目的探讨慢病毒介导的人神经生长因子β(h NGFβ)在兔下颌骨牵张成骨模型中促进下牙槽神经损伤修复的作用。方法分离兔下颌骨中的骨髓间充质干细胞(MSC)并通过重组的慢病毒将h NGFβ基因插入到其基因序列中。对20只新西兰白兔进行下颌骨牵张成骨,并在手术时向骨牵张缝隙下牙槽神经周围植入经h NGFβ基因重组质粒转染的MSC或对照MSC(每组10只)。经过牵张,在固定期第14天处死动物并获取下牙槽神经样本进行神经组织学分析和神经组织形态定量分析。结果下牙槽神经组织分析显示,移植h NGFβ基因修饰MSC组与对照组相比较,有更多的再生神经纤维和更少的神经变性。神经组织形态定量分析显示,与对照组相比,移植h NGFβ基因修饰MSC组的有髓纤维密度显著增多,提示移植h NGFβ基因修饰MSC能够显著地加快兔下颌骨牵张成骨过程中的下牙槽神经的修复。结论慢病毒介导h NGFβ基因修饰MSC将有希望为临床减少牵张成骨造成的下牙槽神经损伤提供一种有效的基因治疗方法。     

成人骨髓源性神经干细胞诱导分化实验研究

为探讨成人骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性 ,无菌条件下行骨穿 ,梯度密度离心分离获取成人骨髓源细胞 ,以“CYTOKINE·神经干细胞培养液”培养 ,确定神经干细胞的最佳体外生存环境。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖情况 ;以NESTIN、NSE及GFAP免疫细胞化学方法分别鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。细胞培养所涉及的细胞因子主要有GDNF(2 0ng/ml)、LIF(10ng/ml)和RA(0 5 μg/ml)等。结果发现 ,成人骨髓源细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的神经干细胞 ,后者形成细胞球 (或称“神经球”) ,该细胞球表达特殊的神经干细胞NESTIN抗原 ;若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养 ,单个的细胞又很快形成新的神经球。神经干细胞球进一步分化 ,可见到有的细胞胞体增大并出芽 ,逐渐发育成为较成熟的长突起细胞 ,长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系 ,表达NSE或GFAP抗原。说明成年人骨髓在一定条件诱导下可以生成神经干细胞 ;用人骨髓组织诱导神经干细胞作为种子细胞具有可行性和有效性     

成年鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养条件及定向分化为心肌样细胞的可行性。方法通过取成年SD大鼠股骨干骨髓,进行体外培养和传代,用10μmol/L 5-氮杂胞苷(5-aza)分别对原代、一代和三代MSC进行体外定向诱导,用免疫组化方法分析检测分化后细胞的心肌特异性抗原(肌丝蛋白、肌钙蛋白)并通过RT-PCR鉴定心肌细胞特异因子基因(ANP、GATA-4)的表达。结果原代、一代MSC在体外经5-aza诱导4周后,细胞形态无明显变化,而经5-aza诱导4周后的三代MSC形态变大,呈杆形、球形,诱导细胞相互连接,连接细胞出现肌管样结构。免疫组化检测经10μmol/L 5-aza诱导4周的原代、一代MSC未见肌丝蛋白、肌钙蛋白T阳性细胞,而诱导三代MSC肌丝蛋白阳性比例近20%,肌钙蛋白阳性比例约8%。RT-PCR显示诱导三代MSC 4周后有ANP和GATA-4心肌细胞特异基因表达。结论MSC能够在体外经5-aza诱导分化为心肌样细胞,具有向心肌细胞转化的潜力,是自体心肌细胞移植的一种良好供体。     

共培养系统下骨髓间充质干细胞分化为颌下腺腺泡细胞的实验研究

目的 研究使用共培养系统将骨髓间充质于细胞分化为有分泌功能的颌下腺腺泡细胞的可行性.方法 分离成年SD大鼠骨髓间充质干细胞于体外培养、纯化和鉴定,同时分离新生SD大鼠的颌下腺细胞于体外培养、纯化和鉴定,取颌下腺腺泡细胞第二代和间充质干细胞第一代置于共培养系统诱导干细胞定向分化.使用免疫细胞化学法分析骨髓间充质干细胞是否表达淀粉酶抗体.结果 纯化后的颌下腺腺泡细胞呈铺路石样形态,原代至第5代培养基及细胞内均可检测到淀粉酶表达;体外培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,呈束状、漩涡状排列,可成功诱导成脂肪细胞,油红-O染色显示含有脂滴;共培养后的骨髓间充质干细胞表达淀粉酶抗体,约30%的骨髓间充质干细胞在共培养1周后转化为腺泡细胞,约50%的骨髓间充质干细胞在共培养2周后转化为腺泡细胞.结论 成功构建大鼠颌下腺腺泡细胞和骨髓间充质干细胞的体外培养体系,并证明大鼠骨髓间充质干细胞具有转化为腺泡细胞的能力,因此骨髓间充质干细胞将有望应用于涎腺组织工程.     

兔骨髓间质干细胞的体外生物学特性及超微结构研究

目的 对兔骨髓问质干细胞进行体外分离培养并观察其生物学特性.方法 无菌条件下抽取健康幼年新西兰兔胫骨骨髓2ml,经密度梯度离心后获取骨髓间质十细胞,接种至100ml玻璃培养瓶中进行体外培养,观察其细胞形态、贴壁率和超微结构,流式细胞仪检测细胞表面标记物及细胞生长周期,并进行成骨诱导反向证明,对细胞体外的生物学行为进行研究.结果 兔骨髓间质干细胞在体外培养2h后开始贴壁,20h后细胞基本贴壁完全,15d左右细胞融合达90%以上.透射电镜观察显示分离培养的兔骨髓问质干细胞表面可见许多微绒毛,主要分布于胞体一侧,胞核不规则,有切迹,细胞器丰富,具有典型未分化细胞特点;流式细胞仪检测显示分离培养的兔骨髓间质干细胞表面标记物CD44、CD90表达呈阳性,CD4S表达呈阴性,且绝大多数(约占细胞总数的97%)细胞的生长周期处于G1或G2期;成骨性诱导3周后,骨髓间质干细胞逐渐形成小的钙盐结晶体,细胞碱性磷酸酶染色阳性,VonKossa染色显示细胞聚集处存在大量钙盐,呈黑色沉积.结论 密度梯度离心法获取的兔骨髓问质干细胞纯度较高,生长稳定,传代多次后仍保持干细胞特性,因取材及体外扩增较简单易行,适合作为组织工程椎间盘髓核退变缺损修复的种子细胞来源.