放射诱导HSV-TK基因肺癌靶向性表达的研究

目的:构建由Egr-1启动子驱动HSV-TK基因表达的重组质粒,通过放射诱导调控HSV-TK基因的肿瘤靶向表达,以提高肺癌基因治疗的选择性和有效性。方法:利用基因重组方法构建tgEgr-HyTK表达载体;脂质体介导转染肺癌A549、SHG44细胞系,给以不同剂量γ射线照射,观察照射前后各时相点肺癌细胞HSV-TK表达情况;以及不同浓度前药GCV作用下肺癌细胞相对存活率的变化。结果:γ射线可诱导HSV-TK基因在被转染肺癌细胞表达显著增强,呈剂量依赖性;照射后3h HSV-TK基因表达增强,于第8小时达峰值,第36小时恢复至照射前水平。经放射诱导后,tgEgr-HyTK转染肺癌细胞对GCV的敏感性明显升高(P<0.05);进一步发现,HSV-TK/GCV系统对放射线有较明显的增敏作用。放射和HSV-TK/GCV在肿瘤杀伤作用上存在明显协同效应。结论:利用Egr-1启动子调控HSV-TK基因的肿瘤靶向性表达,是一种高效、特异的肺癌基因治疗新策略。     

放射诱导HSV—TK基因肺癌靶向性表达的研究

目的：构建由Egr-1启动子驱动HSV－TK基因表达的重组质粒，通过放射诱导调控HSV－TK基因的肿瘤靶向表达，以提高肺癌基因治疗的选择性和有效性。方法：利用基因重组方法构建tgEgr-HyTK表达载体；脂质体介导转染肺癌A549，SHG44细胞系，给以不同剂量γ射线照射，观察照射前后各时相点肺癌细胞HSV－TK表达情况；以及不同浓度前药GCV作用下肺癌细胞相对存活率的变化。结果：γ射线可诱导HSV－TK基因在被染肺癌细胞表达显著增强，呈剂量依赖性；照射后3h HSV－TK基因表达增强，于第8小时达峰值，第36小时恢复至照射前水平。经放射诱导后，tgEgr-HyTK转染肺癌细胞对GCV的敏感性明显升高（P＜0．05）；进一步发现，HSV－TK／GCV系统对放射线有较明显的增敏作用。放射和HSV－TK／GCV在肿瘤杀伤作用上存在明显协同效应。结论：利用Egr-1启动子调控HSV－TK基因的肿瘤靶向性表达，是一种高效，特异的肺癌基因治疗新策略。     

辐射诱导Egr-1调控腺病毒介导Smad 7基因在体表达的实验研究

目的研究辐射诱导下Egr1基因启动子调控腺病毒介导的Smad7基因在C57BL小鼠肺内表达与放射剂量及放射后时相间的关系。方法将Egr1基因启动子的放射敏感元件和Smad7cDNA包装到复制缺陷型腺病毒内,制备成AD.EgrSmad7。小鼠气管内给AD.EgrSmad7,24h后单次全胸照射。324只小鼠随机分组进入实验,γ线8Gy照射后不同时间取肺组织测定Smad7蛋白含量,研究照射后Smad7基因肺内表达的时效关系。108只小鼠随机分组进入实验,以不同剂量照射后5h取肺组织测定Smad7蛋白含量,研究Smad7基因肺内表达与放射剂量的关系。采用Westernblot印迹法检测小鼠肺组织Smad7蛋白表达。结果γ线照射可明显诱导Egr1基因启动子调控腺病毒介导的Smad7基因在C57BL小鼠肺内表达,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。Smad7基因表达量与照射剂量和照射后间隔时间有关,单次照射0～12Gy间Smad7蛋白表达量随剂量升高而增加,15Gy时下降。照射后2～9hSmad7蛋白表达量最高(P<0.05),而后降低,15h降至接近正常水平。结论以腺病毒为载体,经射线诱导Egr1基因启动子能够调控Smad7基因体内表达,Smad7基因表达量与放射剂量及放射后间隔时间有关。     

化疗诱导Egr-1启动子调控的GM-CSF基因表达对荷瘤小鼠造血损伤的作用

背景与目的: 电离辐射可以通过产生活性氧激活Egr-1启动子高度保守序列CArG,Egr-EG为构建的上游含Egr-1调控序列CArG元件,启动TNF或GM-CSF的pCIneo表达载体,该机制可用于辐射所致的造血损伤或治疗肿瘤.化疗药物通常是通过产生活性氧和DNA损伤导致肿瘤细胞死亡,我们假设化疗药物可以产生活性氧.因此,化疗可以诱导Egr-1启动子调控下游造血因子基因表达,这种化疗诱导基因疗法针对化疗所致的造血损伤具有恰当的治疗效果.本文旨在探讨化疗诱导Egr-1启动子调控的造血因子基因表达对化疗后造血恢复的作用.方法: 将构建的携带有早期生长因子(Egr-1)启动子的GM-CSFcDNA和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)cDNA双顺反子真核表达载体导入基质细胞HFCL后,输入荷瘤(黑色素瘤)小鼠体内,对其实施5-FU化疗,观察外周血象动态改变、人基质细胞植入检测、外源基因eGFP、GM-CSFmRNA、蛋白表达以及对CFU-GM的增殖作用的检测.结果: 实验组与对照组相比外周血白细胞下降幅度明显减轻,恢复加快,而各组问CFU-GM差异无显著性.肿瘤抑制率与化疗相关,而与外源基因表达无关:5-FU处理后72 h实验组小鼠骨髓可见绿色荧光阳性的基质细胞,RT-PCR和Western印迹显示GM-CSF mRNA和GM-CSF蛋白表达增强.结论: 5-FU诱导的Egr-1启动子造血因子基因疗法对化疗后造血损伤具有促进造血恢复作用.     

放射诱导抑瘤素M靶向肿瘤表达治疗肺癌实验研究

目的利用放射敏感性调控序列诱导抑瘤素M(OSM)靶向肺癌表达，探索肺癌治疗新方法。方法利用基因重组构建放射可调控的OSM表达载体pEO，转染肺腺癌A549细胞，观察γ线照射后细胞OSM表达及其对细胞相对存活分数和存活曲线的影响。利用肺癌移植瘤观察不同处理的抑瘤效应。结果γ线可诱导OSM在pEO转染肺癌细胞表达显著上调，呈剂量依赖性。pEO转染肺癌细胞株对辐射敏感性增强，增殖活性显著受抑。6Gy照射联合pEO转染可显著抑制移植瘤生长，并可使30％的移植瘤完全消退。结论由辐射敏感性启动子驱动的OSM肿瘤靶向性表达，可望为肺癌治疗提供一条新途径。     

人Egr-1启动子调控的自杀基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞株中的放射诱导表达

[目的]构建由人Egr-1放射诱导性启动子调控的自杀基因靶向性真核表达载体,并转染人鼻咽癌细胞株CNE,比较射线诱导前后自杀基因在鼻咽癌细胞中的表达情况。[方法1根据Genebank数据库提供的人Egr—1启动子基因序列,设计-对引物克隆人Egr-1启动子,采用PCR、酶切、连接等分子生物学技术,构建pcDNA3．1（＋）-Egr-1-CD重组质粒表达载体,并利用脂质体转染方法转染人CNE细胞株,经G418筛选后获得阳性细胞克隆。RT—PCR分析鉴定0、5、10、15、20Gy放射剂量进行6MVX线照射对CD基因表达的影响。f结果1经PCR、酶切、测序等证实了pcDNA3．1（＋）-Egr．1．CD重组靶向性质粒表达载体构建成功,G418筛选所得到的CNE细胞阳性克隆经不同放射剂量的诱导后,RT—PCR结果显示体外放射线照射可显著提高CNE细胞中CDmRNA的表达水平,在10Gy及15Gy组CDmRNA的表达水平明显增高,尤以15Gy组CDmRNA的表达水平最高,在20Gy组CDmRNA的表达水平反而下降。[结论]pcDNA3．1（＋）-Egr-1-CD重组质粒表达载体构建成功,并成功转染人鼻咽癌细胞株．建立了基因表达与放射的剂量效应关系．为后续的临床应用研究奠定基础．     

辐射诱导Egr-1调控腺病毒介导Smad 7基因对Lewis肺癌生物学行为影响的在体研究

目的研究射线诱导下Egr-1基因启动子调控腺病毒介导的Smad 7基因在C57BL/6J小鼠Lewis肺癌原发病灶内表达后，对原发灶及远处肺转移发生的影响。方法将Egr-1基因启动子的辐射敏感元件和Smad 7 cDNA包装到复制缺陷型腺病毒内，制备成AD．Egr-Smad 7。接种Lewis肺癌细胞于小鼠右后肢外侧，建立荷瘤小鼠模型，肿瘤直径达0．8～1．0cm时进行实验。小鼠被随机分人空白对照、生理盐水（NS）XCN、AD．Egr-Smad 7对照、单纯照射、NS＋照射、AD．Egr-Smad 7＋照射组（6只／组），分别进行如下研究：（1）隔日记录肿瘤长径及短径，观察肿瘤生长曲线、生长延迟时间及小鼠生存时间；（2）观察肿瘤照射2周时肺转移发生情况；（3）观察肿瘤生长至照射时4倍体积时肺转移发生情况。结果放射线诱导Egr-1基因启动子调控腺病毒介导的Smad7基因在C57BL小鼠Lewis肺癌原发病灶内表达后，有抑制原发肿瘤生长及延长小鼠生存时间的作用（P〈0．05），对肿瘤远处肺转移的发生无明显影响（P〉0．05）。结论放射线诱导AD．Egr-Smad7无促进小鼠Lewis肺癌肿瘤局部病灶发展及远处脏器转移的危险性，并且有抑制原发肿瘤生长及延长生存时间的作用。将AD．Egr-Smad7用于阻断TGF-β信号传导通路，靶向性基因治疗放射性肺纤维化具有一定的安全性。     

pEgr-MDA7重组质粒辐射诱导特性的检测

背景与目的：克隆人MDA7 cDNA基因,构建pEgr-MDA7重组质粒并检测其在人食管癌细胞系EC9706中经辐射诱导后mRNA水平。材料与方法：从人外周血mRNA中克隆人MDA7 cDNA基因,连接到Egr-1启动子的下游构建成pEgr- MDA7重组质粒,利用脂质体介导转染人EC9706细胞,用定量PCR方法检测不同剂量X射线照射后被转染细胞中MDA7的mRNA水平。结果：测序结果证实MDA7 cDNA基因序列正确,酶切鉴定证实pEgr-MDA7重组质粒构建正确。被pEgr- MDA7重组质粒转染的人食管癌EC9706细胞经不同剂量X射线照射后,MDA7基因mRNA水平均高于未照射组。结论：X射线可诱导pEgr- MDA7重组质粒在人EC9706细胞中表达增强。     

肝癌患者肝动脉灌注IL-2、TNF-α治疗前后机体免疫状态的研究

Ｅｇｒ－１（ｅａｒｌｙ－ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ－１）系一具有辐射诱导特性的转录因子。其调控序列被证实可通过与肿瘤杀伤基因相连接的方法而赋予后者以辐射诱导特性，因而被用于肿瘤的基因－放射治疗研究。为此，我们用ＣＰＲ方法从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠基因组ＮＤＡ扩增出－４４５ｂｐ长Ｅｇｒ－ｌ基因调控序列。序列分析证实，除－３９２位一个碱基（Ａ→Ｇ）相差外，其余均与文献报道一致，包括６个对辐射诱导特性起关键     

pEgr-TNFα基因联合放疗抑制食管癌细胞生长的实验研究

背景与目的研究pEgr-TNFα重组质粒在稳定转染的食管癌细胞中的辐射诱导表达,及其联合放射治疗抑制食管癌细胞生长的效果。材料与方法将脂质体包裹的pEgr-TNFα重组质粒,转染食管癌细胞系EC9706中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞;采用ELISA方法检测0.075Gy和2Gy剂量X射线诱导后TNFα的表达;观察该工种剂量X射线照射后,EC9706细胞的增长情况。结果pEgr-TNFα重组质粒转染EC9706细胞,并获得稳定转染的细胞;大剂量X射线照射和低剂量X射线照射均可诱导TNFα表达增强,为对照组的6~6.3倍(P<0.01);稳定转染的细胞经0.075Gy和2Gy X射线照射,8d后细胞数明显低于未转染细胞组(P<0.01)和稳定转染的假照射组(P<0.01)。结论体外pEgr-TNFα基因-放射联合治疗有明显的抑制食管癌细胞生长的作用。     

小鼠Egr-1基因调控序列的克隆及其辐射诱导特性的鉴定

共刺激信号是激发有效的细胞免疫应答所必需的.B7分子家族及CD28/CTLA-4等刺激分子在共刺激信号的传递过程中起着重要的作用.T细胞表面CD28与APC细胞表面B7分子结合似乎提供了T细胞激活所需的主要共刺激信号.T细胞表面有多种膜表面分子,这是T细胞识别抗原,与其它免疫细胞相互作用,接受信号刺激等的物质基础,也是鉴别和分离T细胞和T细胞亚群的重要依据.由于共刺激信号的产生和传导,介导靶细胞凋亡可人为调节免疫应答使之增强或抑制.本研究将分析McAb诱导PBLs细胞膜分子表达及肝癌细胞凋亡的相关性.这可能为肿瘤免疫治疗提供新的线索.1 材料与方法1.1 淋巴细胞的分离培养正常人外周血(PBLs)100ml(广州血液中心),2     

c-myc调节人端粒酶逆转录酶(htert)启动子活性的体外研究

目的：探讨OSM对黑色素瘤体内生长的抑制作用及其在基因－放射治疗中的应用。方法：用重组的人OSM基因表达质粒（pO)和辐射诱导性OSM表达质粒（pEO)转染小鼠B16黑色素瘤细胞,筛选OSM表达细胞（pO-17和pEO-1),皮下接种C57BL／6小鼠,观察和比较相同生长期同瘤体重量及给予^60Coγ－线局部照射后肿瘤抑制率的变化。结果：在未照射实验中,pO-17和pEO-1细胞接种20d后的瘤体重量较对照组明显降低;在照射实验中,pEO-1细胞照射后7d后瘤体重量的下降最为显著,肿瘤抑制率由未照射时的33.8%提高至48.1%。结论：转基因分泌的OSM可对瘤细胞的体内生长产生抑制;射线可通过Egr-1R 增强OSM表达的途径加剧肿瘤抑制,即基因与射线的双重抑瘤效果。     

Radiation-inducible caspase-8 gene therapy for malignant brain tumors

PURPOSE: Patients with malignant gliomas have a poor prognosis. To explore a novel and more effective approach for the treatment of patients with malignant gliomas, we designed a strategy that combines caspase-8 (CSP8) gene therapy and radiation treatment (RT). In addition, the specificity of the combined therapy was investigated to decrease the unpleasant effects experienced by the surrounding normal tissue. METHODS AND MATERIALS: We constructed the plasmid pEGR-green fluorescence protein that included the radiation-inducible early growth response gene-1 (Egr-1) promoter and evaluated its characteristics. The pEGR-CSP8 was constructed and included the Egr-1 promoter and CSP8 complementary DNA. Assays that evaluated the apoptosis inducibility and cytotoxicity caused by CSP8 gene therapy combined with RT were performed using U251 and U87 glioma cells. The pEGR-CSP8 was transfected into the subcutaneous U251 glioma cells of nude mice by means of in vivo electroporation. The in vivo effects of CSP8 gene therapy combined with RT were evaluated. RESULTS: The Egr-1 promoter yielded a better response with fractionated RT than with single-dose RT. In the assay of apoptosis inducibility and cytotoxicity, pEGR-CSP8 showed response for RT. The pEGR-CSP8 combined with RT is capable of inducing cell death effectively. In mice treated with pEGR-CSP8 and RT, apoptotic cells were detected in pathologic sections, and a significant difference was observed in tumor volumes. CONCLUSIONS: Our results indicate that radiation-inducible gene therapy may have great potential because this can be spatially or temporally controlled by exogenous RT and is safe and specific.     

Resveratrol is an effective inducer of CArG-driven TNF-alpha gene therapy

We report the anticarcinogenic, anti-aging polyphenol resveratrol activates the radio- and chemo-inducible cancer gene therapy vector Ad.Egr.TNF, a replication-deficient adenovirus that expresses human tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) under control of the Egr-1 promoter. Like ionizing radiation or chemotherapeutic agents previously shown to activate Ad.Egr.TNF, resveratrol also induces Egr-1 expression from its chromosomal locus with a possible role for Egr-1 promoter CC(A+T)richGG sequences in the expression of TNF-alpha. Resveratrol induction of TNF-alpha in Ad.Egr.TNF-infected tumor xenografts demonstrated antitumor response in human and rat tumor models comparable to that of radio- or chemotherapy-induced TNF-alpha. Although sirtuins are known targets of resveratrol, in vitro inhibition of SIRT1 activity did not abrogate resveratrol induction of Egr-1 expression. This suggests that SIRT1 is not essential to mediate resveratrol induction of Egr-1. Nevertheless, control of transgene expression via resveratrol activation of Egr-1 may extend use of Ad.Egr.TNF to patients intolerant of radiation or cytotoxic therapy and offer a novel tool for development of other inducible gene therapies.     

LCRG1基因5′端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚,本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列,寻找与其表达有关的调控序列。方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3basic载体中。与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,测序正确;pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3basic的35倍。结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp),该片段具有启动子活性。