Hoechst33342标记大鼠骨髓间充质干细胞及其在大鼠体内的迁移

目的 检测外源性的BMSCs是否可向骨缺损处迁移,Hoechest3342标记BMSCs,从而跟踪外源性BMSCs在体内的迁移,研究其归巢机制可行性.方法 贴壁筛选提取大鼠BMSCs,培养至第三代,用Hoechst33342标记后,尾静脉回植于颅骨缺损的大鼠体内,14d后处死大鼠,取颅骨,切片,荧光显微镜下观察细胞迁移情况.主要观察指标:光学显微镜下观察不同时期细胞形态和表面抗原检测;荧光显微镜下观察Hoechst33342标记后细胞形态,以及细胞增殖率;组织切片上Hoechst33342标记的阳性细胞.结果 筛选纯化的BMSCs呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主.CD45阴性,CD44、CD90均呈阳性表达;组织切片上可见Hoechst33342标记大鼠的BMSCs.结论 外源性的BMSCs可向骨缺损处迁移;Hoechst33342可以标记BMSCs,从而跟踪外源性BMSCs在体内的迁移,进而研究其归巢机制.     

PKH26与BrdU体外双重标记兔BMSCs在心肌补片中的实验研究

目的观察PKH26与BrdU体外双重标记兔BMSCs的生物学特性,并体外构建组织工程心肌补片。方法取6月龄新西兰大白兔分离培养BMSCs,并用细胞膜荧光染料PKH26和细胞核标记物BrdU对BMSCs进行标记,通过倒置相差显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪、MTT法观察细胞生长状态和荧光标记前后细胞生物学特性的变化;ALP、茜素红、油红O染色及骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白等免疫细胞化学技术检测,观察和评价标记前后BMSCs体外分化为成骨细胞和成脂细胞的能力。将标记细胞与小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)复合后共培养5～7d构建组织工程心肌补片,在倒置相差显微镜、荧光显微镜和扫描电镜下观察细胞在SIS上的生长情况,并做活体及石蜡包埋HE染色观察。结果标记后细胞生长状态良好,基本生长特性无明显改变;荧光显微镜下可见标记后细胞膜上红色荧光呈颗粒状分布;细胞表面干细胞标志性抗原表达与标记前无明显差异。标记后的BMSCs成骨诱导后,ALP、茜素红染色阳性,细胞表达骨钙素及Ⅰ型胶原蛋白;成脂诱导后,细胞胞浆内出现明显的脂滴。标记细胞与SIS共培养5～7d后,标记细胞生长状态良好,在材料上呈现出多层细胞结构。活体及石蜡包埋后HE染色可见细胞生长状态良好。结论兔BMSCs能被PKH26和BrdU稳定标记;标记的细胞在体外具有自我更新和多向分化的能力;标记的BMSCs与SIS体外复合培养可以构建组织工程心肌补片。     

静脉移植5-BrdU标记骨髓间充质干细胞参与创面愈合的作用研究

目的：探讨经尾静脉移植入体内的骨髓间充质干细胞（BMSCs）参与皮肤创面愈合的情况。方法：以SD大鼠为研究对象，分离、培养并鉴定大鼠BMSCs。制作大鼠全层皮肤缺损动物模型；经尾静脉注入经5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞，于不同时间点（3、7、14、21、28天）观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果：经流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90表达阳性；CD45表达呈阴性：经体外标记的5-溴脱氧尿嘧啶标记率〉90％；标记后的干细胞进行移植4周后，实验组大鼠创面局部及边缘可见BrdU标记的阳性细胞聚集，对照组中未发现明显的聚集现象。结论：5-BrdU完全能够满足移植细胞的标记需要。经尾静脉注射移植入体内的BMSCs可能参与皮肤创面愈合。     

5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞对大鼠创面愈合的作用研究

目的探讨以5-溴脱氧尿嘧啶（5-BrdU）标记的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在大鼠创面愈合中的作用。方法分离培养大鼠BMSCs并用流式细胞仪技术鉴定。在大鼠背部脊柱一侧制作全层皮肤缺损模型，实验组经尾静脉注入经5-BrdU标记的BMSCs，移植细胞数为2×10^7。对照组为5-BrdU标记的BMSC移植的正常大鼠。术后3d、7d、14d、21d、28d分批处死动物，观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90；CD45表达呈阴性。实验组：经5-BrdU体外标记的BMSCs进行细胞移植14d后，大鼠创面局部及边缘可见5-BrdU标记的阳性细胞聚集，免疫组化染色可见基底层、真皮层、新生血管周围有散在红棕色标记细胞；对照组中未发现明显的聚集现象；抗BrdU／FⅧ、BrdU／波形蛋白免疫双标技术检测结果显示：在创伤部位有部分BMSCs分化为血管内皮细胞和成纤维细胞参与创面愈合。大鼠正常皮肤中未见明显的BMSCs聚集和增殖分化情况。结论经尾静脉注射移植的BMSCs参与皮肤创面愈合。     

PKH26标记法在组织工程神经种子细胞体内示踪中的应用

目的 探讨PKH26标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)的效果及其应用于组织工程神经种子细胞体内示踪实验的可行性.方法 取Wistar大鼠股骨和胫骨的骨髓,用全骨髓贴壁的方法分离、培养BMSCs.用PKH26荧光染料进行标记,荧光显微镜下观察标记效果,流式细胞仪检测荧光标记率,MTT法测定细胞的活性,体外成脂和成骨诱导鉴定细胞的分化能力,并与未标记细胞进行比较;使用显微注射的方法将BMSCs植入去细胞神经支架内制备成组织工程神经,于体外培养3 d、5 d、7 d、14 d,行组织切片,观察BMSCs在支架内存活、迁移的情况.另外,将体外构建组织工程神经桥接Wistar大鼠坐骨神经15 mm的缺损,于术后1周、4周、6周、8周取出移植物,行组织切片观察植入的BMSCs在支架内的存活情况.结果 PKH26能有效地标记BMSCs,标记率达95%以上,标记后细胞活性及诱导成骨成脂分化能力与未标记细胞无明显差异.在体外培养的环境下,BMSCs能在去细胞神经支架里粘附生长,并沿着支架迁移;在体内外周围神经再生的微环境下,BMSCs可存活8周以上.结论 PKH26荧光染料标记法是一种有效的标记BMSCs的方法,可用于组织工程神经种子细胞体内示踪的研究.     

羊膜和结膜基质诱导胚胎干细胞分化为上皮样细胞的初步研究

目的观察小鼠胚胎干细胞在保存人羊膜及兔眼表结膜基质上分化的情况。方法36只新西兰兔随机分为3组，每组12只。A组：将表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的小鼠ES-GFP细胞用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记后行实验兔结膜下移植；B组：将小鼠ES—GFP细胞接种到人羊膜上共培养4d，用BrdU标记后移植到实验兔结膜缺损区；C组：采用保存羊膜移植到实验兔兔结膜缺损区。分别于移植后1、2、3、4，6和8周，摘取各组实验眼行荧光显微镜、组织学和免疫组织化学检查，荧光检测ES-GFP细胞在组织中的荧光表达，组织学检查移植到结膜基质的ES-GFP细胞的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况；免疫组织化学检测移植到结膜基质的带有BrdU标记的ES．GFP细胞CK3／CK12和CK13的表达。结果小鼠ES-GFP细胞接种到人羊膜后能在羊膜上贴附生长，与羊膜共培养4d后部分ES-GFP细胞分化为多角形上皮样细胞，免疫组化显示β1整合素阳性。将负载有ES—GFP细胞的羊膜移植到兔结膜缺损区，术后荧光显微镜可在结膜上皮层检测到绿色荧光带，免疫组织化学检测结膜上皮层CK13表达阳性，CK3／CK12表达阴性，在重建的结膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞，未见异常增殖细胞。结论采用保存人羊膜负载小鼠ES细胞行兔结膜移植，小鼠ES细胞能在兔结膜基质存活并增殖。     

不同浓度5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记山羊骨髓基质干细胞的体外研究

目的 利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记山羊骨髓基质干细胞(BMSCs),检测其最佳标记浓度、时间及细胞毒性,探讨作为山羊BMSCs标记及示踪方法的可行性.方法 抽取10个月龄健康中国青山千骨髓.贴壁培养并鉴定.以浓度分别为5、10、15和20 μmol/L的BrdU标记第4代细胞,分别记为A、B、C、D组;末用BrdU标记的细胞作为卒白对照组(E组).分别标记12、24、48和72 h后,免疫荧光法检测各组标记阳性率,锥虫蓝拒染法检测标记后细胞存活率.结果 原代及传代培养的山羊BMSCs态主要为梭彤,经诱导后能向成骨细胞和软骨细胞分化.标记后,荧光显微镜下胞核呈绿色荧光.随着标记时间和浓度的增加,各实验组标记阳性率逐渐增高,于15 μmol/L孵育48 h后,其标记率可达剑(93.32±3.25)%,与15 μmol/L孵育72 h和20 μmol/L孵育48,72 h筹异无统计学意义(P>0.05),与其他各绀各时间点筹异有统计学意义(P<0.05);各时间点空白对照组标记阳性率均为均为0.锥虫蓝拒染实验示各组细胞存活率均在90%以上,差异无统计学意义(P>0.05).结论 BrdU浓度为15μmol/L,标记时间为48 h时,对山羊BMSCs可得纠最佳的标记效果,且安全性较高.     

多肽修饰的聚己内酯-左旋聚乳酸与犬骨髓基质干细胞生物相容性的研究

目的 探讨精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的聚己内酯-左旋聚乳酸共聚物(PCL-b-PLLA)与犬骨髓基质干细胞(BMSCs)的生物相容性.方法 应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养犬BMSCs,观察细胞形态及超微结构,流式细胞仪鉴定其表面标记物.将第3代犬BMSCs接种于RGD纳米胶束修饰的PCL-b-PLLA膜L培养,作为实验组,对照组为BMSCs与未修饰的PCL-b-PLLA膜复合培养,3 d后Hoechst 33342荧光染色、倒置显微镜及扣描电镜观察细胞形态,MTT法检测细胞毒性.分别于2、4、6 h细胞计数仪计数检测黏附的细胞数,计算黏附率.结果 原代及传代培养的BMSCs呈梭形外观,具有较强的增殖能力.BMSCs超微结构显示其胞体较小,细胞核/浆比例大,胞浆少,染色质较疏松.细胞表而扰原CD29、CD44表达阳性,CD34表达阴性.Hoechst 33342荧光染色示实验组细胞核形态正常,核质均染,细胞数较对照组明显增多,未见明显凋亡及坏死细胞.扫描电镜示实验组较对照组细胞数量多,延展好,伪足相互接触紧密.两组材料对细胞均无毒性作用.随时间延长两组材料上细胞黏附率逐渐增高,各时间段实验组细胞黏附率显著高于对照组(P＜0.01).结论 RGD修饰的PCL-b-PLLA不仅与犬BMSCs具有良好的生物相容性,而且可显著促进BMSCs黏附、生长,是一种较为理想的组织工程支架材料.     

体内构建组织工程骨的示踪观察：CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性研究

目的探索组织工程骨体内成骨时,CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性,为种子细胞的体内转归研究提供标记方法。方法分离比格犬BMSCs,成骨诱导至第2代,用荧光染料CM-DiI进行细胞标记。荧光倒置显微镜观察标记后的细胞形态,MTT比色法测定标记前后BMSCs的增殖状况,检测标记前后Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、骨形态发生蛋白（BMP-2）、骨钙素（BGLAP）和骨黏连蛋白（SPARC）的表达。最后,CM-DiI荧光标记后的BMSCs与β-TCP复合共培养后植入比格犬背部皮下,8周后取材,荧光显微镜下观察BMSCs体内转归,HE染色观察异位成骨情况。结果CM-DiI标记后早期细胞呈现红色荧光,48 h后荧光增强,72 h内荧光强度无明显减弱。BMSCs在CM-DiI标记前后细胞形态基本一致,两组间细胞的增殖率无明显差别;标记后RT-PCR检测Col-Ⅰ、BMP-2、BGLAP、SPARC表达,显示标记后的BMSCs亦可向成骨方向分化。扫描电镜检测到标记后细胞在β-TCP上增殖良好,细胞基质分泌丰富。细胞-支架复合物植入比格犬皮下,8周后荧光显微镜观察到标记细胞仍存在,且HE染色可见支架孔隙中有类骨基质沉积。结论CM-DiI对BMSCs的生长增殖、成骨分化无明显影响,对体内组织工程骨中BMSCs的示踪时间可长达8周,可用作体内细胞的长效示踪剂。     

荧光微球体外标记大鼠BMSCs的初步研究

目的通过检测荧光微球655(quantum dot655,QD655)标记SD大鼠BMSCs的体外细胞毒性、细胞增殖、细胞贴附性以及标记率,探讨QD655标记BMSCs及其示踪的可行性。方法收集2周龄健康SD大鼠股骨和胫骨骨髓,贴壁培养BMSCs。取第3代BMSCs采用QD655标记作为实验组,以未标记BMSCs作为对照组,采用锥虫蓝拒染法检测细胞存活率,MTT法观察QD655对细胞增殖性的影响;取实验组BMSCs向成骨诱导分化培养2周,采用茜素红、ALP染色定性鉴定细胞成骨分化能力,实时荧光定量PCR鉴定标记对细胞成骨分化的影响;分别在标记后即刻、1、2、4、6周采用荧光显微镜动态检测实验组BMSCs阳性标记率;扫描电镜观察实验组细胞在胶原/生物活性玻璃复合材料上的贴附性。结果实验组与对照组细胞存活率均90%,比较差异无统计学意义(P0.05);培养1、3、5、7、9d,两组细胞增殖率比较差异均无统计学意义(P0.05)。实验组BMSCs经成骨诱导分化2周后,茜素红及ALP染色均呈阳性,实时荧光定量PCR检测实验组BMSCs的骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原、ALP、BMP-2 mRNA较对照组成倍数高表达。实验组BMSCs标记后即刻阳性标记率达96.50%±1.59%,随着标记时间延长标记率下降,标记后1、2、4、6周标记率分别为93.30%±1.51%、72.40%±2.90%、40.10%±3.60%、10.00%±1.70%,对照组各时间点阳性标记率均为0。扫描电镜观察示实验组标记后细胞和材料贴附良好。结论 QD655对大鼠BMSCs标记时间长,标记率及安全性高,是一种良好标记物。     

间充质干细胞在大鼠异种肝移植肝组织中的迁徙、定居及组织修复作用

目的 观察间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）在大鼠异种肝移植肝组织中的迁徙、定居及组织修复作用.方法 分离培养、体外扩增豚鼠骨髓MSC,经4,6-联脒-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）标记后用荧光显微镜进行体外示踪观察.制作豚鼠对Wistar大鼠的肝移植模型,DAPI标记的MSC经股静脉植入Wistar大鼠,用荧光显微镜观察术后12 h、24 h MSC在移植肝的迁徙及定居情况;采用苏木素-伊红（HE）染色观察移植肝组织的损伤情况.结果 DAPI标记MSC的标记率达100 %,标记后MSC生长和增殖特性未受影响.MSC经股静脉注入后,12 h即出现在移植肝,24 h分布于移植肝血管及周围组织.显微镜下观察,空白对照组术后24 h的肝小叶中央静脉和肝血窦淤血明显,肝细胞可见严重空泡状变性,坏死灶较多,肝组织中有较多中性粒细胞的聚集、浸润;MSC组肝小叶、中央静脉、汇管区结构清晰,炎症细胞浸润较轻.结论 MSC可以迁徙并定居于大鼠异种移植肝中,对移植肝组织损伤有修复作用.     

骨髓源性多巴胺前体细胞移植治疗帕金森病模型鼠

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化为多巴胺(DA)能前体细胞后移植治疗帕金森病(PD)模型鼠的疗效及作用机制.方法 将纯化的BMSCs诱导为DA前体细胞,免疫荧光染色和流式细胞仪检测TH阳性细胞的表达及百分比.将PD大鼠模型随机分为3组,分别注入诱导、未诱导的BMSCs和生理盐水于模型鼠右侧纹状体区.干预后观察行为学的变化,免疫荧光鉴定以及高效液相色谱检测腑内DA含量的变化.结果 诱导后可见TH阳性细胞,且比例可达10.3%.移植治疗6周后诱导组旋转次数变化多于未诱导组(P<0.05)和生理盐水组(P<0.01);诱导组可见BrdU/TH、BrdU/NSE双标阳性的细胞,未诱导组只见BrdU/GFAP双标细胞;BMSCs诱导组DA脑内含量明显高于未诱导组和生理盐水组(P<0.05),而后两组差异无统计学意义(P>0.05).结论 BMSCs诱导为DA前体细胞移植治疗PD模型的疗效总体好于未诱导的BMSCs组和生理盐水组.     

Qtracker体外标记兔成骨诱导分化后细胞的初步研究

目的 探讨Qtracker体外标记兔成骨诱导分化后细胞的特点及可行性.方法 抽取3个月龄健康新西兰大白兔骨髓,贴壁培养骨髓基质干细胞(BMSCs),传至第3代后向成骨细胞诱导,并做鉴定.Qtracker分别以1、2、4、8、16和32 nmol/10~6细胞的浓度标记成骨诱导分化后细胞,分别记为A、B、C、D、E、F组;未标记的细胞作为空白对照组(G组).分别利用荧光显微镜计数和流式细胞术两种方法枪测标记阳性率,台盼蓝拒染法检测标记后细胞存活率,甲基噻唑基四唑(MTT)法观察Qtracker染料对细胞增殖的影响.结果 兔BMSCs经诱导后能向成骨细胞诱导分化.经Qtracker标记后,荧光显微镜下胞浆呈绿色荧光.随着标记浓度的增加,A、B、C、D、E、F组细胞标记阳性率逐渐增高,于8 nmol/10~6细胞的浓度标记时,在荧光显微镜下计数,标记率可达到(93.58±2.08)%;通过流式细胞仪检测,其标记率为(95.24±1.31)%,经两种方法测定,D、E、F组间标记率差异均无统计学意义(P>0.05),且与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.05);G组各时间点标记阳性率均为0.以不同浓度标记后各组细胞存活率均在96%以上,且各组之间差异无统计学意义(P>0.05).标记Qtracker后对细胞的增殖无影响(P>0.05).结论 Qtracker可用于兔成骨诱导分化后细胞的体外标记,在浓度为8 nmol/10~6细胞下可得到最佳的标记率,且其对成骨诱导分化后细胞的增殖无明显影响.     

自体移植的大鼠骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处的存活及分化

目的观察自体移植的骨髓间充质干细胞(BMSC)在脊髓损伤(SCI)处的存活及向神经细胞分化情况。方法将36只雄性SD大鼠随机分为PBS注射组(PBS组)和BMSC自体移植组(BMSC组)。BMSC组大鼠在术前均进行自体BMSC分离培养。2组大鼠均采用改良Allen撞击装置制备T9水平的SCI模型,PBS组于损伤处注射PBS,BMSC组注射第4代自体BMSC。于移植后2、3、5周采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分法进行运动功能评分;移植后2、3、5周取损伤部位脊髓,采用Hoechst33342染色法观察移植细胞存活情况,同时行免疫荧光化学染色检测自体移植的BMSC中微管相关蛋白2(MAP-2)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果移植后2、3、5周,BMSC组大鼠BBB评分均高于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。移植后2、3、5周,BMSC组大鼠损伤处脊髓有不同数量Hoechst33342标记细胞存活,其中2周时细胞存活较多,5周时细胞存活较少;移植后2、3周,未检测到移植细胞表达MAP-2及GFAP,5周时检测到部分移植细胞表达MAP-2和GFAP。结论SCI后立即进行移植的自体BMSC可在损伤处存活,部分存活细胞可向神经元和星形胶质细胞方向分化,促进大鼠后肢运动功能的恢复。     

EGFP和CM-Dil示踪骨髓间充质干细胞构建组织工程骨的体内研究

目的:应用增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)和CM-Dil标记技术,观察组织工程骨在体内形成过程中种子细胞的变化和转归.方法:分别用EGFP慢病毒表达和CM-Dil染料的方法标记比格犬骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs),MTT法检测标记细胞的体外增殖能力.BMSCs接种珊瑚支架体外成骨诱导7天后,将未标记组、EGFP组和CM-Dil组分别植入裸鼠背部皮下,空白支架作为阴性对照.术后4、8、12周取材,HE染色观察成骨情况,EGFP组采用GFP免疫组化、CM-Dil组冰冻切片荧光显微镜下示踪BMSCs在体内的变化.结果:两种标记技术能高效标记BMSCs,标记前后细胞的体外增殖无显著性差异(P>0.05).细胞-支架复合物植入体内12周后有新生骨形成,标记细胞数量随时间延长而逐渐减少,12周后仍显示有部分标记细胞存活.结论:EGFP和CM-Dil可用于示踪组织工程种子细胞,通过示踪说明BMSCs在体内组织工程骨成骨过程中发挥了重要作用.     

促红细胞生成素动员骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤

目的 观察促红细胞生成素(EPO)动员骨髓间充质干细胞(BMSCs)对脊髓损伤局部起的修复作用,并探讨其机制.方法 将30只SD大鼠随机分成假手术组、生理盐水组及EPO治疗组,各组均经尾静脉注射Hoechst33342标记的BMSCs,移植后1、3、7、14、21、28 d采用BBB法进行大鼠后肢运动功能评分观察大鼠神经功能恢复情况,应用免疫荧光检测比较各组BMSCs动员到脊髓损伤处的数目,Western blot检测损伤局部BMSCs表达脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的水平.结果　从第3天起,EPO治疗组BBB评分分别为(5.29±0.69)、(8.18±0.38)、(13.32±0.77)、(15.25±1.83)、(18.71±1.54),明显高于生理盐水组,移植的BMSCs计数分别为(90.12±7.68)、(116.26±13.54)、(186.32±20.35)、(211.64±31.83)、(298.71±21.54),数目明显增加(P＜0.05),其BDNF和NGF的表达也明显增强(P＜0.05).结论 EPO能够动员BMSCs向脊髓损伤部位迁移并通过促进BMSCs表达BDNF和NGF来促进神经功能的恢复.

Abstract：

Objective To obsevre the effect of erythropoietin (EPO) treatment on the mobility of bone marrow mesenchymal stem cell (BMSCs) to the sites of injured spinal cord and explore the molecular mechanism. Methods Thirty SD rats were randomly divided into sham-operation group, saline group and EPO treatment group. BMSCs labeled with Hoechst33342 were transplanted by tail vein. Functional outcome measurements were evaluated by the Basso, Beattie and Bresnahan (BBB) score at 1st, 3rd, 7th,14th, 21st and 28th day. The immigrating number of BMSCs was measured by immunofluorescent staining.The expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and nerve growth factor (NGF) in BMSCs was detected by Western blotting. Results From the 3rd day on, the BBB scores in EPO treatment group were (5.29±0.69), (8.18±0.38), (13.32±0.77), (15.25 ±1.83), (18.71 ±1.54) respectively, which were obviously higher than in saline group. The number of BMSCs was (90. 12 ±7. 68), (116. 26 ± 13. 54),( 186. 32 ± 20. 35 ), (211.64 ± 31.83 ) and (298.71 ± 21.54) respectively, which was significantly increased in EPO treatment group (P ＜ 0. 05 ). The protein levels of BDNF and NGF expressed by BMSCs were increased significantly (P ＜ 0. 05) in EPO treatment group as compared with sham-operation group.Conclusion EPO treatment after spinal cord injury may help BMSCs migrate to the injury site and accelerate recovery of neural function by up-regulating the expression of BDNF and NGF.     

Distinct functions for Ras GTPases in the control of proliferation and apoptosis in mouse and human mesangial cells

In previous work, we have demonstrated that Ras GTPases regulate proliferation in a range of human renal cells. The present work compares human and mouse mesangial cell (HMC and MMC) responses to specific knockdown of Ras genes with antisense oligonucleotides (AS-oligos), and examines the role of the p21 (cip1) and p27 (kip1) cyclin-dependent kinase inhibitors in these responses in mouse cells. HMC and MMC were lipofectin transfected with ras-targeted AS-oligo at 200-400 nM for 18 h followed by growth of cells in 20% serum for 18-72 h. Cell proliferation was assessed with an MTS assay and bromodeoxyuridine (BrdU) uptake. Apoptosis was quantified using nuclear stain with Hoechst 33342 dye. In MMC, Ha-ras AS-oligo caused an increase in apoptosis from <2% to 10-15% of cells after 18 h in serum (P<0.01). Control, Ki-ras and N-ras AS-oligos had minimal effects on apoptosis. BrdU uptake studies showed that BrdU+ve MMC were increased by 20-40% (P<0.05) after Ha-ras AS-oligo at 24 h; other ras AS-oligos were inactive. HMC number was reduced by 40-80% (P<0.01) at 48-72 h by both Ha-ras and Ki-ras AS-oligos. These actions were associated with reductions in BrdU+ve cells. In HMC, the ras AS-oligos did not induce apoptosis. p21(-,-) MMC showed exaggerated apoptotic responses to Ha-Ras AS-oligo. In mouse cells, Ha-Ras expression appears necessary to prevent apoptotic cell death; Ras expression does not appear necessary for cells to progress through the cell cycle. In human cells, Ras does not appear necessary to prevent apoptosis but Ha-Ras and Ki-Ras appear to be required for cell cycle progression.