ERK1/2MAPK通路在Eca109细胞体外增殖和迁移中的作用及其机制

目的观察ERK1/2 MAPK通路在食管鳞状细胞癌(ESCC)Eca109细胞系增殖和迁移中的作用并探讨其作用机制。方法使用MAPK(ERK1/2)抑制剂U0126处理Eca109细胞;细胞计数检测细胞增殖;倒置显微镜下观察细胞形态;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ERK1/2 mRNA;Western blot检测总ERK1/2(t-ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2);MTT和细胞划痕实验检测细胞增殖和迁移能力;qRT-PCR检测MicroRNA-21(miR-21)。结果20μmol/L浓度的U0126可抑制Eca109细胞生长(P<0.05),破坏细胞正常形态,ERK1/2 MAPK通路的活化在蛋白质水平被抑制(P<0.05),Eca109细胞增殖和迁移明显减弱(P<0.05),显著下调miR-21的表达(P<0.05)。结论ERK1/2 MAPK信号通路抑制可减弱Eca109细胞增殖和迁移,其可能的作用机制之一与其抑制miR-21表达有关。     

ERK通路激动剂EGF及抑制剂U0126对HepG2肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)亚族细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路在HepG2肝癌细胞迁移和侵袭中的作用。方法体外培养人肝癌HepG2细胞,采用ERK通路激动剂和抑制剂:表皮生长因子(EGF)及U0126刺激48h,分别应用MTS法、划痕实验法及Transwell小室法检测EGF和U0126对HepG2细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力的影响,qPCR和Western blot法分别检测ERK mRNA和磷酸化ERK蛋白的表达变化。结果细胞增殖、迁移和侵袭实验结果均显示,激动剂EGF可显著提高HepG2肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力(P0.01),而U0126均对以上指标有抑制效应(P0.05)。qPCR和Western blot结果显示,EGF可上调ERK mRNA和磷酸化蛋白的表达(P0.01),而U0126对ERK mRNA无明显影响(P0.05),但可显著下调ERK磷酸化蛋白的表达(P0.01)。结论 ERK通路参与HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭过程,EGF和U0126对以上指标的影响可能与ERK mRNA的表达及蛋白磷酸化过程相关。     

PGRN基因沉默对人非小细胞肺癌A549细胞增殖及迁移的影响

目的:探讨小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)介导的颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN)基因沉默对非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其机制。方法:分别用q PCR和Western blot法检测A549细胞和正常人支气管上皮(HBE)细胞中PGRN的m RNA和蛋白表达水平。采用脂质体转染法将PGRNsi RNA转染A549细胞,采用q PCR和Western blot法验证PGRN表达的变化;应用MTT实验检测细胞活力;活细胞计数法和结晶紫染色实验检测细胞增殖能力;划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞迁移能力;并用Western blot法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平以及PGRN下游信号通路中细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和蛋白激酶B(Akt)的磷酸化水平。结果:PGRN在A549细胞中的m RNA和蛋白水平均明显高于HBE细胞(P0.05);转染PGRN-si RNA后A549细胞中PGRN的m RNA和蛋白水平均明显下调,细胞活力、增殖能力以及迁移能力均明显降低(P0.05)。沉默PGRN基因的表达,可下调PCNA、cyclin D1和Bcl-2的蛋白表达,而上调Bax的蛋白表达,且磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)和磷酸化的Akt(p-Akt)的蛋白水平明显降低(P0.05)。结论:PGRN基因沉默能明显抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖和迁移能力,PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路可能在该过程中发挥重要作用。     

PI3K和MAPK信号通路对A549细胞FOXO1蛋白表达及其亚细胞定位的调节

目的探讨非小细胞肺癌中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT和丝裂原活化蛋白激酶MAPK/ERK信号通路对Forkhead转录因子(Fox蛋白家族)FOXO1活性的影响及分子机制。方法体外培养人非小细胞肺癌系A549,分别选用PI3K/AKT信号通路特异性抑制剂LY294002和MAPK/ERK信号通路特异性抑制剂UO126及两种抑制剂联合处理细胞之后,MTT比色法检测其对细胞增殖的影响;Western blot检测蛋白FOXO1、p-FOXO1及信号下游蛋白Bim表达的变化;免疫荧光法检测FOXO1蛋白在A549细胞中亚细胞的定位的变化。结果与对照组相比,LY294002和UO126都能明显地抑制A549细胞的增殖,且具有时间依赖性。Western blot结果显示,FOXO1的蛋白水平未见显著性变化,而FOXO1的磷酸化水平明显下降,Bim的表达相应增加。免疫荧光结果显示,FOXO1在A549细胞中的核转位增多。LY294002和UO126联合处理A549细胞时,较药物单独作用效果明显增加。结论 PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路能调节FOXO1磷酸化水平,且具有协同作用,抑制其转录活性。FOXO1通过激活Bim蛋白,促进细胞凋亡,抑制细胞的增殖。     

鞘氨醇激酶1通过ERK1/2信号通路促进非小细胞肺癌细胞的侵袭和迁移

目的:探讨鞘氨醇激酶1(SphK1)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法:选取31例外科手术切除并经常规组织学检查确诊为NSCLC的肿瘤组织标本和配对癌旁肺组织标本,应用免疫组织化学染色和RT-qPCR检测SphK1的表达。将pcDNA3. 1-SphK1载体(SphK1组)、空白pcDNA3. 1载体对照(NC组)、SphK1 siRNA(siSphK1组)和对照siRNA(siNC组)分别转染人肺腺癌A549细胞,Western blot法检测SphK1、E-cadherin、fibronectin和p-ERK1/2的表达;利用Transwell实验评估过表达SphK1和抑制ERK1/2对A549细胞迁移和侵袭的影响。结果:SphK1在NSCLC组织中高表达,并与肿瘤分期相关。SphK1过表达可显著促进A549细胞的迁移和侵袭,提高p-ERK1/2和fibronectin蛋白水平,减少E-cadherin蛋白表达(P0. 05),而干扰SphK1则呈现相反的结果。ERK1/2抑制剂U0126可显著抑制SphK1过表达诱导的p-ERK1/2和fibronectin上调及E-cadherin下调,也抑制了SphK1过表达增强的A549细胞侵袭和迁移能力(P0. 05)。结论:SphK1可能通过ERK1/2通路降低E-cadherin蛋白水平、提高fibronectin蛋白水平,并促进NSCLC细胞的侵袭和迁移。     

CaSR在oxLDL诱导的A7r5细胞增殖及迁移中的作用

目的:探讨钙敏感受体(calcium-sensing receptor,Ca SR)在氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox LDL)诱导的大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5细胞)增殖及迁移中的作用及信号机制。方法:Brd U掺入法检测细胞增殖;伤口愈合实验及Transwell迁移分析检测细胞迁移情况;Western blot方法检测Ca SR、PCNA、ERK MAPK通路及PI3K/AKT通路的蛋白表达。结果:(1)小剂量(10 mg/L)ox LDL作用A7r5细胞24 h促进细胞的增殖和迁移;(2)ox LDL增加A7r5细胞的Ca SR表达;(3)Ca SR拮抗剂NPS2390抑制了ox LDL的作用,而激动剂Gd Cl_3进一步增强了ox LDL的作用;(4)ox LDL可促进p-AKT、pERK蛋白表达;(5)PI3K/AKT通路抑制剂LY294002、ERK MAPK通路抑制剂PD98059能够抑制ox LDL诱导的细胞增殖和迁移效应;(6)NPS2390抑制了ox LDL诱导的p-AKT和p-ERK蛋白表达,而Gd Cl_3作用相反。结论:(1)ox LDL诱导A7r5细胞增殖及迁移效应;(2)Ca SR参与ox LDL诱导的A7r5细胞增殖及迁移作用;(3)Ca SR通过活化PI3K/AKT通路及ERK MAPK信号通路参与ox LDL诱导的A7r5细胞增殖及迁移作用。     

石蒜碱通过调控MAPK/ERK信号通路抑制人结肠腺癌LoVo细胞生长

目的:探讨石蒜碱(lycorine)对人结肠腺癌LoVo细胞活力、凋亡和迁移侵袭能力的影响及其作用机制。方法:不同浓度(1~8μmol/L) lycorine处理LoVo细胞,CCK-8法检测细胞活力;划痕愈合和Transwell小室实验检测迁移和侵袭能力;Hoechst染色及流式细胞术实验检测凋亡改变;萤光素酶报告基因系统检测MAPK/ERK信号通路活化情况;同时采用Western blot法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关标志物、凋亡相关蛋白及磷酸化ERK1/2蛋白水平的变化。结果:与空白对照组相比,lycorine处理组LoVo细胞的活力和迁移侵袭能力受到显著抑制(P<0.05),同时EMT相关标志物基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7, MMP-7)和N-cadherin表达下调,E-cadherin表达上调(P<0.05),而凋亡细胞数及cleaved caspase-3无显著差异(P>0.05)。此外,lycorine处理组Elk1/SRF转录活性降低,ERK1/2磷酸化水平降低(P<0.05)。结论:石蒜碱可通过调控MAPK/ERK信号通路及抑制EMT过程LoVo细胞的活力及迁移侵袭能力,从而在体外主要发挥生长抑制的抗肿瘤作用。     

miR-24对肺癌A549细胞化疗敏感性的影响

目的:探究微小RNA(miR)-24对肺癌细胞A549化疗敏感性的影响及可能的作用机制。方法:Real-time PCR实验检测肺腺癌细胞系A549及肺腺癌耐药细胞株A549/DDP中miR-24的表达情况。转染miR-24抑制序列(miR-24 inhibitor)下调A549/DDP细胞中的miR-24后,采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、细胞色素C(Cyt C)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)和P53的蛋白水平。双荧光素酶报告基因实验预测及验证miR-24可能的靶基因。结果:耐药细胞株A549/DDP中miR-24的表达水平明显高于A549细胞(P0.05)。miR-24 inhibitor可诱导肺腺癌耐药细胞株A549/DDP的凋亡,增加细胞对顺铂的敏感性;此外还可下调Bcl-2/Bax比值,同时上调P53、p-ERK、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3及Cyt C的蛋白水平。而应用ERK特异性抑制剂U0126可部分恢复miR-24 inhibitor转染的细胞活力。生物信息学分析显示p53是miR-24的可能作用靶点基因,在A549/DDP细胞中共转染miR-24 inhibitor和P53 siRNA可部分逆转miR-24 inhibitor对细胞活力的影响。结论:下调肺腺癌耐药细胞株A549/DDP中miR-24的表达可增加细胞对顺铂的敏感性,其机制可能与靶向p53基因同时激活ERK/P53信号通路后促进细胞经线粒体途径的凋亡有关。     

MicroRNA-145通过丝裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶通路调控肺癌A549细胞系转移及侵袭

目的 探讨microRNA-145(miR-145)对非小细胞肺癌A549细胞转移、侵袭及对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（PI3K/AKT）通路的作用。 方法 将非小细胞肺癌A549细胞分成miR-145模拟物（mimics）组和negative-mimics组（miR-NC）以及antago miR-145组（抑制剂组）和antago miR control 组（antago-NC）,采用Transwell迁移实验及基质胶侵袭实验等检测miR-145对人非小细胞肺癌A549迁移、侵袭能力的影响;Western blotting方法分析miR-145对MAPK和PI3K/AKT通路的影响。此外,采用细胞外调节蛋白激酶（ERK）及AKT的通路抑制剂分别作用于A549细胞系,检测A549细胞迁移、侵袭能力的改变。 结果 miR-145 mimics组穿过细胞数（90.67±10.33）明显少于miR-NC组（175.33±23.67）,miR-145 mimics组穿过基质胶的细胞数（153.33±22.33）少于miR-NC组 (77.33±13.67）,P<0.05;antago-NC组通过小室的细胞数量以及穿过基质胶的细胞数量明显少于antago miR-145组（P<0.05）,结果说明,miR-145具有抑制非小细胞肺癌A549细胞迁移、侵袭的能力;miR-145 mimics转染可分别抑制A549细胞中90%、78%以及73%的ERK1/2、AKT的ser-473位点和thr-308位点的磷酸化,antago miR-145转染可促进A549细胞中ERK1/2、AKT的ser-473位点和thr-308位点的磷酸化,增加115%、125%以及129%,而当抑制MAPK通路及PI3K/AKT通路的激活后,A549细胞的转移及侵袭能力下降。 结论 miR-145通过MAPK和PI3K/AKT通路调控肺癌A549细胞转移及侵袭。     

普鲁卡因抑制肺癌细胞生长和运动的机制研究

目的 探索普鲁卡因抑制ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化对肺癌细胞A549生长和运动的影响.方法 将对数生长期细胞分为对照组、普鲁卡因组、阳性对照组、ERK1/2组、p38 MAPK组、普鲁卡因+ERK1/2组和普鲁卡因+p38 MAPK组.检测各组细胞生长、侵袭和迁移;Western印迹检测Caspase-3、E-cadherin和N-cadherin表达、ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平.结果 与对照组比,普鲁卡因组和阳性对照组细胞克隆形成率、侵袭力和迁移力降低(P<0.05),Caspase-3和E-cadherin蛋白表达上升(P<0.05),N-cadherin蛋白表达、p38 MAPK和ERK1/2磷酸化水平下降(P<0.05),ERK1/2组和p38 MAPK组细胞克隆形成率和侵袭力升高(P<0.05);与ERK1/2组和p38 MAPK组相比,普鲁卡因+ERK1/2组和普鲁卡因+p38 MAPK组细胞克隆形成率和侵袭力下降(P<0.05).结论 普鲁卡因可以抑制ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化,抑制肺癌细胞A549的生长和运动能力.     

下调TCF3抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移能力

目的:探索下调T细胞因子3(TCF3)抑制非小细胞肺癌细胞增殖和迁移的分子机制。方法:运用Lipofectamine 2000转染法将siTCF3和阴性对照siRNA(NCsiRNA)转染非小细胞肺癌A549和H1299细胞;运用real-time PCR和Western blot分别测定TCF3的mRNA和蛋白水平;运用萤光素酶报告基因实验测定TCF3的转录活性;MTT、克隆形成实验、Transwell实验和Annexin V-FITC/PI染色联合流式细胞术分别测定细胞的活力、克隆形成能力、转移能力及细胞凋亡率;Western blot检测Wnt、c-Myc、基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-13、金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-1的蛋白表达水平。结果:与NCsiRNA转染组的细胞比较,siTCF3显著抑制A549细胞和H1299细胞中TCF3的mRNA和蛋白水平(P0.01)。TCF3转录活性和c-Myc蛋白表达水平明显低于NCsiRNA细胞(P0.05)。MTT实验结果显示,培养24 h、48 h、72 h和96 h的A549-siTCF3和H1299-siTCF3细胞活力均显著低于NCsiRNA细胞(P0.05)。与NCsiRNA细胞相比,siTCF3显著抑制A549细胞和H1299细胞的克隆形成能力(P0.01)。Transwell实验结果显示A549-siTCF3和H1299-siTCF3细胞迁移数显著低于A549-NCsiRNA和H1299-NCsiRNA组细胞(P0.05)。流式细胞术分析结果显示A549-siTCF3细胞和H1299-siTCF3细胞的凋亡率显著高于A549-NCsiRNA和H1299-NCsiRNA细胞(P0.01)。Western blot实验结果显示,下调TCF3表达能抑制Wnt蛋白的表达,MMP-9和MMP-13的蛋白表达明显降低,TIMP-1的蛋白表达增高。结论:siTCF3显著抑制A549细胞和H1299细胞的增殖和迁移能力,并诱导细胞凋亡,其分子机制可能通过下调Wnt通路活性以及调控MMP家族关键成员的表达而实现。     

三叶因子3在甲状腺乳头状癌TPC-1细胞上皮间质转化中的作用及机制

目的 探讨三叶因子3（TFF3）基因沉默对人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞迁移、侵袭、克隆形成能力以及对上皮间质转化（EMT）的影响及机制。 方法 免疫组织化学技术检测甲状腺乳头状癌组织芯片中Snail与TFF3的表达。划痕实验、侵袭实验和克隆形成实验分别检测TFF3基因对TPC-1细胞迁移、侵袭和克隆能力的影响;实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）、免疫印迹法和免疫细胞化学染色检测上皮间质转化标志物及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路相关蛋白的变化。 结果 31例甲状腺乳头状癌组织中,Snail蛋白于癌细胞胞质表达,31例癌旁组织阴性表达;Snail蛋白与TFF3表达呈正相关(r=0.8450,P<0.05)。TFF3基因沉默后,人TPC-1细胞的细胞迁移、侵袭和克隆形成能力均明显降低(P<0.01);TPC-1细胞上皮间质转化标志物及MAPK通路相关蛋白细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2和p-ERK1/2也显著降低(P<0.05)。 结论 沉默TFF3可能通过MAPK通路相关蛋白ERK1/2抑制上皮间质转化,降低TPC-1细胞迁移、侵袭和增殖能力。     

低氧通过上调乙酰辅酶A羧化酶1促进肺腺癌A549细胞迁移

目的 探讨低氧通过乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）促进人肺腺癌A549细胞迁移的机制。 方法 低氧（5％ O2）处理肺腺癌A549细胞,应用Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,Western blotting检测ACC1表达及上皮-间质转化（EMT）相关蛋白的表达水平。 结果 与常氧（对照组）相比,低氧处理促进了A549细胞的迁移（P＜0.01）,低氧处理后ACC1表达上调（P＜0.01）,同时波形蛋白（vimentin）表达增加（P＜0.05）,E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达下降（P＜0.01）;敲除ACC1后与对照组相比,A549细胞的迁移能力减弱（P＜0.05）,vimentin表达下降（P＜0.05）,E-cadherin表达增加（P＜0.01）;敲除ACC1后A549细胞在常氧和5％ O2条件下迁移数目及vimentin、E-cadherin表达变化无统计学意义（P＞0.05）;补充亚油酸（LA）恢复低氧对A549细胞的促迁移作用（P＜005）。 结论 低氧通过上调ACC1的表达促进肺腺癌A549细胞迁移及EMT转化。     

p38 MAPK- Pim-3通路可能介导预处理对抗心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的： 研究MAPK通路在原癌基因Pim-3抗心肌急性缺氧复氧损伤中的作用。方法：采用原代培养新生大鼠的心肌细胞,随机分为4组：正常对照组（control）、缺氧复氧组(A/R)、缺氧预适应组(APC+A/R)、阻断剂组。在缺氧预处理前分别用终浓度为10 μmol/L SB203850(p38 MAPK阻断剂)、U0126（ERK1/2阻断剂）、SP600125（SAPK/JNK阻断剂）与细胞孵育30 min。实验结束后测定MAPKs通路中ERK1/2、JNK、p38 MAPK 磷酸化蛋白表达水平及Pim-3蛋白的表达水平,同时检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH) 活性、四唑盐（MTT）比色试验测定细胞存活率、TUNEL法检测细胞凋亡。结果： SB203850、U0126、SP600125能分别取消由APC或A/R所诱导ERK1/2、JNK、p38 MAPK的磷酸化水平的升高;由APC所诱导的Pim-3表达的升高在p38 MAPK通路被阻断后明显下调(P<0.01),并且心肌细胞LDH值升高,细胞存活率则下降,心肌细胞的凋亡指数升高。结论： p38 MAPK的激活可上调原癌基因Pim-3的表达,从而可能对心肌细胞起到保护作用。     

miR-140-3p通过靶向PD-L1抑制非小细胞肺癌A549细胞的活力、迁移和侵袭

目的:探究微小RNA-140-3p(mi R-140-3p)对程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的靶向关系以及对非小细胞肺癌A549细胞的活力、迁移和侵袭的影响。方法:使用RT-qPCR检测HLF-1、A549和H1299不同细胞株中mi R-140-3p的表达水平,选择差异最显著的A549细胞用作后续研究对象; Target Scan软件预测和双萤光素酶报告基因实验验证mi R-140-3p和PD-L1之间的靶向关系; RT-qPCR和Western blot检测转染mi R-140-3p模拟物和抑制剂对PD-L1表达水平的影响; MTT法检测mi R-140-3p和PD-L1对A549细胞活力的影响; Transwell实验检测mi R-140-3p和PD-L1对A549细胞迁移和侵袭的影响。结果:mi R-140-3p在人肺癌A549和H1299细胞的表达中显著下调(P 0. 05); mi R-140-3p高表达能够使PD-L1表达下调,对A549细胞的活力、迁移和侵袭具有抑制作用;转染pc DNA3. 0-PD-L1能够阻断mi R-140-3p对A549细胞活力、迁移和侵袭的抑制作用。结论:mi R-140-3p可通过靶向负调控PD-L1抑制A549细胞的活力、迁移和侵袭。