从噬茵体7肽库中筛选畦巴因特异性结合的短肽

以哇巴因为靶分子,从噬菌体7肽库中筛选与哇巴因特异性结合的短肽.经过3轮淘筛并通过ELISA法鉴定,获得14个阳性克隆,通过对噬菌体ssDNA电泳鉴定和序列分析筛选得到3种短肽:肽A、B和C的筛选一致率分别为64.3%(9/14),28.6%(4/14)和7.14%(1/14).Genbank中蛋白质同源性分析显示,肽A、B、C均不与钠泵蛋白同源.放射性配基受体结合法检测结果表明,合成的肽A能够与哇巴因结合.哇巴因特异性结合短肽的获得将为阻遏内源性哇巴因与钠泵的结合、防治高血压奠定基础.     

应用噬菌体肽库筛选NMDA受体抗原表位

目的利用噬菌体展示随机肽库技术,进行NMDAR1抗原表位研究.方法以R1JHL单克隆抗体作为筛选分子,生物淘洗噬菌体展示随机12肽文库.经过4轮的筛淘,ELISA结合实验鉴定阳性克隆,提取阳性克隆噬菌体单链DNA进行序列分析.结果对阳性噬菌体进行递呈肽氨基酸序列分析,获得一阳性克隆序列HYNLSSDRKVRL,与R1JHL单克隆抗体识别序列相比,两者存在一致性序列DRK.结论 DRK可能为NMDA受体抗原表位.     

与Aβ42结合的噬菌体展示多肽的淘选

阿兹海默症（Alzheimer’s disease, AD）,即老年痴呆,是一种十分常见的神经系统退行性疾病,β-淀粉样蛋白（Aβ）在细胞外异常聚集、沉积是其致病机制之一。目的：筛选与Aβ42集合的噬菌体多肽。方法：本实验以Aβ42寡聚体为靶蛋白,对随机环形噬菌体七肽库进行筛选,对于筛选的结果用酶联免疫吸附试验进行验证。结果：得到200株噬菌体克隆,全部为阳性并且部分与Aβ42的结合力极强。结论：通过对随机环形噬菌体七肽库筛选可得到与靶蛋白（Aβ42）结合的噬菌体阳性克隆,理论上这些阳性噬菌体所展示的多肽可以作为配体与Aβ42（受体）结合,而这种结合则有可能影响Aβ42寡聚体的聚集和沉淀,从而为阿兹海默症的治疗提供某些支持。     

从噬菌体十二肽库中筛选MMP-2抑制剂的研究

为了筛选抑制MMP-2(基质金属蛋白酶-2)的小分子多肽，以纯化MMP-2为目标蛋白，经3轮筛选，并通过ELISA分析，从噬菌体展示12肽库中获得6个阳性克隆；经DNA测序并推导小肽序列，分析序列保守性，找到一个保守序列模式“HWKF”，经明胶酶谱活性检测具有该序列的噬菌体克隆能明显抑制MMP-2水解明胶活性，该研究为肿瘤的生物治疗和临床应用提供了一定的帮助。     

噬菌体展示技术生物淘选CTGF表位的研究

噬菌体展示技术筛选缔组织生长因子（CTGF，connective tissue growth factors）蛋白表位。用含有30mmol／L葡萄糖的DMEM培养液干预人肾小球系膜细胞2d后，提取CTGF天然蛋白，应用Western blot—ting方法鉴定CTGF单克隆抗体的特异性；以CTGF单克隆抗体为筛选工具，对噬菌体随机12肽库进行筛选，逐步增加选择压力，经过3轮筛选后随机挑取4个克隆测序，用竞争抑制和间接ELISA方法检测噬菌体阳性克隆的特异性。Westernblotting分析显示，CTGF单克隆抗体能与CTGF天然蛋白及重组蛋白特异性结合。噬菌体文库经过3轮筛选后得到的阳性克隆，测序结果表明4个克隆的序列高度一致，推导获得小肽序列，命名为ZD521；竞争抑制和间接ELISA分析与预期结果一致。本研究用噬菌体展示技术成功获得与CTGF单抗高度结合的小肽，为CTGF功能研究以及进一步以该肽为疫苗预防和治疗纤维化疾病打下基础。     

特异性哇巴因结合肽的筛选及其结合活性的测定

目的　本研究的目的在于寻找特异性哇巴因结合肽(Ouabainconjugatedpeptide,OCP) ,降低哇巴因水平。 方法　利用噬菌体随机肽库表面呈现技术筛选出OCP ,通过测序 ,分析 ,获得氨基酸序列 ,合成筛选出的 12肽 ,采用放射性配基受体结合法 (radioligandbindingassay ,RRA)检测哇巴因结合肽与哇巴因的结合能力。结果　从噬菌体 12肽库中筛选出 3种多肽 ,其中肽A(12肽 )的筛选一致率达到 0 6 7(8/12 )。RRA实验结果显示 ,合成的肽与3 H ouabain具有一定的结合能力 ,平衡解离常数为 1 0 87nmol·L-1,受体密度为12 0pmol·g-1Pro ,IC50 =1 4 6× 10 -4mol·L-1,而且两者之间的结合无相互协同作用。结论　特异性OCP的获得 ,不仅获得了与哇巴因特异结合的蛋白质序列 ,而且为哇巴因的检测及高血压的治疗提供了有价值的实验室数据     

噬菌体随机肽库淘选肺癌细胞NCI-H1299特异性结合多肽

目的利用噬菌体展示肽库筛选出与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽,鉴定其特异性和亲和力,为寻找肺癌早期诊断和治疗标志物打下基础。方法以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,在37℃下对噬菌体随机十二肽库进行三轮减性筛选,挑取单克隆ELISA初步鉴定噬菌体克隆亲和力;阳性克隆提取质粒,测序后合成多肽,鉴定多肽的亲和力及特异性。结果经ELISA初步鉴定,随机挑选的20个单克隆中,其中6号对NCI-H1299亲和力最高,将其命名为PhageZS6。细胞免疫荧光试验进一步证明,合成的相应多肽FITCZS6对NCI-H1299具有高亲和力。结论利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞具有较高亲和力的多肽ZS6,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础。     

应用噬菌体展示短肽探索腺病毒表位

腺病毒感染可以引起广泛的疾病,例如急性咽炎、气管炎、肺炎、结膜炎、角膜炎、及胃肠炎等,在我国引起肺炎的腺病毒绝大多数为3型或7型。对于腺病毒感染至今尚缺乏特异性地预防和治疗手段。本研究目的是为了获得含有中和抗体相关的3型腺病毒模拟表位短肽的噬菌体克隆,为设计新疫苗提供新的思路。从噬菌体肽库中筛选目的短肽是近年来发展起来的一项新技术,噬菌体肽库也称噬菌体表位库,即以噬菌体衣壳蛋白PⅢ为载体,插入一段编码外源短肽的随机基因片段,从而构成了一个长度固定、序列随机的短肽集合体。本研究用3型腺病毒中和抗体筛选噬菌体随机十五肽库,经三轮筛选后,随机挑取了22个噬菌体克隆,分别加入3型腺病毒感染的Hela细胞,用结晶紫染色法观察Hela细胞的病变程度。并选择一个有明显保护作用的,即病变程度较轻的阳性噬菌体克隆进行测序。结果发现8／22个克隆菌体短肽对3型腺病毒感染Hela细胞具有保护作用。其中一个有明显保护作用的噬菌体短肽的序列为：Leu-Val-Gly-Ile-Trp-His-Arg-Leu-Pro-Gly-Ala-His-Arg-Gly-Ala,即LVGI－WHRLPGAHRGA。我们得到的结论是噬菌体短肽可以模拟中和抗体相关的腺病毒表位,保护Hela细胞免受3型腺病毒感染。     

肺癌特异性结合多肽的体外筛选和鉴定

目的应用噬菌体随机肽库技术筛选出与肺癌细胞特异性结合的多肽。方法以人肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,人胚肺细胞MRC-5为吸附细胞,对噬菌体随机12肽库进行3轮全细胞减性筛选后,随机挑取噬菌体克隆进行ELISA鉴定;对亲和力较高的阳性克隆进行DNA测序并翻译为氨基酸序列;化学合成异硫氰酸荧光素标记的多肽(FITC-ZS-5),采用细胞和组织免疫荧光法鉴定FITC-ZS-5与肺癌细胞的亲和力及特异性。结果通过3轮减性筛选后,与NCI-H1299细胞结合的噬菌体克隆得到有效的富集;ELISA结果显示5号克隆对NCI-H1299细胞亲和力最高,将其命名为Phage ZS-5;测序结果显示Phage ZS-5所表达的多肽序列在国内外均未见报道,细胞及组织免疫荧光实验结果显示FITC-ZS-5对肺癌细胞及组织具有较高的亲和力和特异性。结论应用噬菌体随机肽库技术筛选到肺癌靶向性多肽ZS-5,为肺癌的靶向治疗和诊断奠定基础。     

晚期糖基化终产物受体胞外段的原核表达及其相互作用蛋白的筛选

目的构建晚期糖基化终产物受体(receptor for ad-vanced glycation end-product,RAGE)胞外段基因的原核表达载体并诱导表达,应用噬菌体展示技术筛选其相互作用蛋白。方法用RT-PCR方法扩增人RAGE胞外段cDNA,构建于原核表达载体pET14b,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导RAGE胞外段融合蛋白表达,用Ni2+-NTA亲和层析柱进行纯化并行Western blot鉴定。以重组RAGE胞外段蛋白为靶分子,进行3轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第3轮洗脱物中随机挑选分隔良好的噬菌体克隆扩增后进行ELISA鉴定。对获得的阳性噬菌体克隆分别进行扩增、纯化,提取DNA测序后翻译为氨基酸序列,用BLAST软件搜索Gen-Bank中的同源序列。结果成功构建并表达、纯化了RAGE胞外段融合蛋白。经过3轮筛选后,随机挑取的24个噬菌体克隆中11个可与RAGE胞外段结合。对11个噬菌体测序后用BLAST软件搜索同源序列,得到14个编码蛋白。结论应用噬菌体展示技术筛选到与RAGE胞外段相互作用的蛋白,为进一步研究其功能和作用机制提供新线索。     

抗表皮生长因子受体噬菌体抗体库的构建筛选及单链抗体可溶性表达

近年来的研究表明,表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 是肿瘤治疗中一个很重要的靶点。本研究应用噬菌体展示技术筛选EGFR特异性单链抗体 (single chain Fv, scFv)。利用高表达EGFR的人鳞状上皮癌细胞A431免疫小鼠,提取脾细胞mRNA,RT-PCR扩增VH和VL基因并拼装成scFv基因。将scFv基因连接到噬菌粒pCANTAB 5E中,电击转化E.coli TG1细胞,构建了库容为2.5×10⁷的噬菌体单链抗体库。用纯化的EGFR为靶抗原对噬菌体抗体库进行5轮富集筛选,得到次级抗体库6F-10。挑取48个克隆进行ELISA测定,45个克隆为阳性。取阳性值最高的克隆感染E.coli HB2151,IPTG诱导scFv的表达。scFv (约27 kD) 以可溶形式存在于细胞质及细胞周质中,并可分泌至上清液。测序结果表明,scFv基因序列全长768 bp,编码256个氨基酸。VH为与小鼠Ig同源的重链可变区基因,VL为κ型轻链可变区基因;VH和VL均由3个抗原互补决定区和4个框架区构成。免疫印迹和细胞免疫荧光显示,可溶性scFv可分别与纯化的EGFR抗原以及细胞表面的EGFR发生特异性结合。抗EGFR特异性scFv的获得,为研制靶向EGFR的抗体药物与研究生物治疗提供导向载体分子。     

噬菌体展示库筛选冠状病毒刺突蛋白抗体

目的 筛选特异性结合冠状病毒刺突蛋白（简称S蛋白）抗原的特异性抗体。方法 根据冠状病毒S蛋白家族数据库,合成保守序列,分子克隆连接到pet-22原核表达载体,纯化蛋白免疫小鼠产生相应的多克隆抗体,利用噬菌体展示技术提取免疫后小鼠脾脏制备噬菌体抗体scfv展示库,经过高通量筛选得到对S蛋白抗原具有高亲和力和强特异性的抗体片段。结果 通过合成的冠状病毒S蛋白糖蛋白亚基CoV＿Spike＿S1-S2＿S2制备了抗体scfv噬菌体展示库,筛选出能与冠状病毒S蛋白特异性结合的单克隆抗体scfv片段。结论 构建的小鼠抗Cov-Spike的抗体scfv库可筛选到特异性结合冠状病毒S蛋白抗原的特异性抗体,为进一步筛选、鉴定具有潜在防治冠状病毒感染的抗体系列药物提供了可行的方法。     

基于报告基因检测的β3肾上腺素受体激动剂筛选模型的建立与应用

目的：建立基于双荧光素酶报告基因检测的β3肾上腺素受体（β3-AR）激动剂筛选模型,并用于β3-AR激动剂的筛选。方法：应用免疫细胞化学法鉴定β3-AR在β3-CHO细胞上的稳定表达,并将pCRE-luc质粒与pRL-TK质粒共同瞬时转染β3-CHO细胞,建立一种基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型。通过检测报告基因萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值,来间接反映配体对β3-AR的激动活性。并以β-AR激动剂异丙肾上腺素刺激对模型的有效性进行验证,在此基础上以此模型对20种新化合物的β3-AR激动活性进行筛选。结果：β3-CHO细胞经免疫细胞化学法鉴定有特异性受体蛋白表达。通过将两个报告基因质粒转染该细胞后,与加入溶剂对照相比,加入异丙肾上腺素可显著促进荧光素酶报告基因的表达,表明该模型有效、可靠。以此模型从20个化合物中初筛出8个活性较强的β3-AR激动剂。结论：本研究建立了基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型,并以此模型筛选发现了几个活性较强的β3-AR激动剂。     

噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用

1985年，Smith GP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面。1988年他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体，表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段，所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。1990年，他们通过亲合筛选，得到了与特定蛋白结合的结合肽，并由于噬菌体表达的肽与编     

应用噬菌体随机肽库筛选腺病毒模拟肽的研究

目的探讨模拟腺病毒表位肽的噬菌体对该病毒感染Hela细胞的保护作用,以便为研制防治腺病毒感染的新型疫苗奠定基础.方法用3型腺病毒中和抗体筛选噬菌体随机六肽库,经3轮筛选后,随机挑取了21个噬菌体克隆,扩增后分别加入3型腺病毒感染的Hela细胞.用结晶紫染色法观察Hela细胞的病变程度. 结果10/21个克隆噬菌体短肽对3型腺病毒感染Hela细胞具有保护作用.结论噬菌体表面的短肽可以模拟中和抗体相关的腺病毒表位,对3型腺病毒感染Hela细胞有一定的保护作用.     

从噬菌体肽库中筛选生长因子模拟肽的研究进展

生长因子通过膜受体可将胞外信号转导至胞内，现已发现一些小分子肽能够作为受体的配体模拟天然配体的生物学作用。以可溶性受体的纯化蛋白或转染了膜受体的完整细胞为靶标，人们从噬菌体肽库中筛选出多种模拟肽，对这些肽的序列和生物学功能进行分析，发现它们能够竞争受体与天然配体相结合，可作为生长因子受体的拮抗剂或激动剂。噬菌体展示技术的应用不仅为生物大分子间的结构和功能关系提供信息，而且为新药的研究提供了新思路。本文对从噬菌体肽库中筛选生长因子受体肽类拮抗剂或激动剂的研究进展作一综述。     

应用噬菌体随机肽库筛选腺病毒模拟肽的研究

目的 探讨模拟腺病毒表位肽的噬菌体对该病毒感染Hela细胞的保护作用，以便为研制防治腺病毒感染的新型疫苗奠定基础。方法 用3型腺病毒中和抗体筛选噬菌体随机六肽库，经3轮筛选后，随机挑取了21个噬菌体克隆，扩增后分别加入3型腺病毒感染的Hela细胞，用结晶紫染色法观察Hela细胞的病变程度。结果 10／21个克隆噬菌体短肽对3型腺病毒感染Hela细胞具有保护作用。结论 噬菌体表面的短肽可以模拟中和抗体相关的腺病毒表位，对3型腺病毒感染Hela细胞有一定的保护作用。     

抗CCR7单链抗体的筛选及初步鉴定

目的从噬菌体抗体库中筛选抗CCR7单链融合抗体,并对其生物学特性进行初步检测。方法PCR检测大肠杆菌中ScFv基因插入率;琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;分别以乳腺癌细胞及CCR7多肽片段为靶抗原对抗体库进行4轮和3轮筛选富集。将阳性克隆转化E.coliHB2151进行可溶表达。抗体亲和层析纯化后,经Western blot鉴定,通过ELISA法检测可溶性ScFv抗体的免疫活性。免疫细胞化学和放射免疫显像鉴定scFv抗体与乳腺癌细胞结合的特异性。结果ScFv基因插入率为90%(18/20),双酶切鉴定检测到目的条带。经4轮细胞筛选,3轮抗原筛选抗CCR7抗原的噬菌体抗体得到了明显富集,在E.coliHB2151中实现可溶表达。Western blot结果显示获得抗体相对分子质量为34ku左右。免疫细胞化学检测与放射免疫显像均证实单链抗体与表达CCR7的乳腺癌细胞MDA-MB-435s特异性结合。结论成功从噬菌体抗体库中筛选获得具有较高特异性的抗CCR7单链抗体。抗体在体内体外均与肿瘤细胞表达特异抗原结合。     

抗肝癌细胞单链抗体的筛选和鉴定

以人正常肝细胞系HL-7702为阴性筛选细胞,肝癌细胞系HepG-2为阳性筛选细胞,从全人源噬菌体抗体库中筛选与HepG-2细胞系特异性结合的单链抗体.通过PCR及ELISA鉴定,将阳性克隆转入pET22b载体中构建表达质粒.所得的基因工程菌经测序,以IPTG诱导可溶性单链抗体表达,并通过SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测,最终得到能与HepC-2特异性结合的单链抗体.     

噬菌体展示技术及其在药物开发中的应用

噬菌体表面展示技术(Phage D isplay T echn iques,PDT)是二十世纪八十年代逐步建立并发展起来的一项新技术。它以噬菌体或噬粒为载体,使外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达,进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体,它实现了基因型和表型的一对一转换,提供了高效率的筛选系统,噬菌体展示技术是真正第一个用于体外高通量筛选的技术方法。利用噬菌体表面展示技术可以构建抗体库、随机肽库、蛋白质突变体库和cDNA文库,从而广泛用于单克隆抗体的筛选、先导化合物的筛选、疫苗的研制,改造和提高蛋白类药物、酶和抗体的生物学和免疫学属性,尤其是在抗原表位分析、受体与配体结合位点确定等分子间识别机制的研究方面,具有广阔的应用前景。