大鼠髁突软骨细胞凋亡与胰岛素样生长因子1的影响

背景：胰岛素样生长因子 1 参与了髁突软骨生长与改建,是软骨发育关键因子。目的：探索胰岛素样生长因子 1 对体外培养大鼠髁突软骨细胞凋亡的作用,以及对凋亡相关因子 Bcl-2 和 BaxmRNA 及蛋白表达变化的影响。方法：体外培养并鉴定出生后 1,28 d 大鼠髁突软骨细胞后,将每个年龄组的髁突软骨细胞分别分为实验组和对照组。饥饿培养 24 h 后,实验组加入 100 μg/L 重组大鼠胰岛素样生长因子 1 细胞因子孵育 48 h,对照组正常培养。结果与结论：与对照组相比,实验组加入重组胰岛素样生长因子 1 后,髁突软骨细胞数量增多,增殖速度显著增加（P 〈 0.05）。实时 PCR 和 Western blot 检测显示,加入重组胰岛素样生长因子 1 培养 48 h 后,各组髁突软骨细胞中 bcl-2 mRNA 和蛋白表达增加,bax mRNA 和蛋白表达减少（P 〈 0.05）。提示胰岛素样生长因子 1 可以促进新出生及青春期大鼠髁突软骨细胞增殖,抑制其凋亡,并可能通过 Bcl-2 和 Bax 介导抑制凋亡。     

体外培养软骨细胞与生长因子的加入

背景:自体软骨细胞体外培养生长缓慢,极易发生去分化,胰岛素样生长因子和碱性成纤维细胞生成因子可以刺激关节软骨细胞的增殖和分化.目的:观察应用碱性成纤维细胞生成因子和胰岛素样生长因子1对关节软骨细胞的作用.方法:采用成人关节软骨细胞体外培养,以碱性成纤维细胞生成因子(10μg/L)和胰岛素样生长因子1(100 mg/L)对其作用,采用MTT法和免疫细胞化学技术进行观察和评价.结果与结论:在体外培养软骨细胞时应用碱性成纤维细胞生成因子可以明显促进细胞增殖,但同时发生去分化.在体外培养软骨细胞时应用胰岛素样生长因子1可以明显促进细胞产生细胞外基质,有利于软骨细胞表型的表达,对细胞的增殖作用不明显.提示采用顺序性应用胰岛素样生长因子1和碱性成纤维细胞生成因子对体外培养的软骨细胞进行作用,可以在更短的时间内获得大量的、具有良好细胞表型的软骨细胞.     

三种不同培养条件下兔关节软骨细胞增殖速率的差别

目的:观察兔关节软骨细胞在3种不同培养条件下增殖速率的差别。方法:实验于2004-10/2006-10在上海长海医院血管外科实验室完成。取4周龄新西兰雄性兔6只,利用机械与酶消化的方法获得均一性兔关节软骨细胞,在单层培养条件下增殖至第2代;将第2代细胞在高密度条件下转入藻酸盐凝胶24孔培养介质,进行三维培养。根据实验目的,将24孔培养板分为单层培养对照组,三维培养组(培养液不含胰岛素样生长因子Ⅰ),含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养组(培养液含50μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ),每日在倒置相差显微镜下观察软骨细胞的生长状态,进行细胞计数1周,绘制细胞生长曲线,比较3种不同培养条件下兔关节软骨细胞的增殖速率。结果:①单层培养细胞24h后开始贴壁生长,细胞形态呈多角形、星形、圆形,72h后,倒置显微镜下观察细胞增殖数目明显增多,细胞增殖呈片状;三维培养条件下的软骨细胞,刚接种至藻酸钠凝胶时,细胞形态为圆形;三维培养(含胰岛素样生长因子Ⅰ)体系中的软骨细胞从转入三维培养的第3天起,发现细胞出现分裂增殖,局部有细胞团族形成,第7天,凝胶中开始有大量的细胞团族形成。在培养过程中,三维培养软骨细胞形态始终保持圆形。②1周内,单层培养条件下的软骨细胞增殖速率要明显高于三维培养组;含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养组的软骨细胞增殖速率明显高于不含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养组。结论:单层培养方法短期内(1周)对软骨细胞的增殖作用要优于三维培养方法;胰岛素样生长因子Ⅰ对三维培养条件下关节软骨细胞具有促进增殖的作用。     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化

背景：用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论。鉴于此,课题组提出＂同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨＂的实验设技。目的：同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法。方法：分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组：实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子。比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况。制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养。分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析。结果与结论：实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组（u=3.326,P〈0.01）。实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞。组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性。提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨。同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求。     

携带人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的重组腺病毒体外转导培养关节软骨细胞

目的:胰岛素样生长因子Ⅰ通常被认为是软骨生长和稳定中最关键的生长因子之一,可以促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖.应用携带人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的重组腺病毒(Adenovirus-human insulin like growth factor-Ⅰ transgene construct,Ad-hIGF-Ⅰ)体外转导培养关节软骨细胞,探讨其在体外促进软骨细胞外基质成分生成的能力.方法:实验于2005-01/2007-04在大连医科大学附属四院骨科实验室完成.分离培养3周龄兔膝关节及股骨头软骨细胞,将受测细胞随机分为转导组与未转导组,以500感染复数的Ad-hlGF-I转导第1代软骨细胞,转导组中的第1,3,5,7代细胞分别为转导后48 h,3周,7周和9周的软骨细胞.采用样本碱水解法、阿利新蓝法和酶联免疫吸附方法检测转导组和未转导组的第1,3,5,7代细胞羟脯氨酸、糖胺多糖、胰岛素样生长因子I蛋白浓度.结果:①倒置显微镜观察,转导组兔关节软骨细胞生长增殖稳定,至第7代仍旧以三角形、梭形及纺锤形细胞为主,偶见长梭形和树根形细胞,且轮廓清晰,透亮度大,折光性强;而末转导组细胞培养至第4代时即己出现长梭形细胞,自第5代细胞形态几乎全部变成长梭形.②随着培养时间延长和传代次数增加,软骨细胞上清液中胰岛素样生长因子I蛋白、羟脯氨酸和糖胺多糖浓度的逐渐降低,转导组软骨细胞均高于同代未转导组细胞(P<0.05).结论:携带人胰岛素样生长因子I基因的重组腺病毒体外转导的关节软骨细胞,可以稳定产生内源性的胰岛素样生长因子I,并进而促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和蛋白多糖.     

藻酸钠凝胶三维培养条件下胰岛素样生长因子Ⅰ对兔关节软骨细胞表型的影响

目的:观察胰岛素样生长因子Ⅰ对藻酸盐凝胶三维培养条件下兔关节软骨细胞表型的影响。方法:实验于2004-10/2006-10在上海长海医院血管外科实验室完成。实验材料:4周龄雄性新西兰兔6只。实验方法:利用机械与酶消化的方法获得均一的兔关节软骨细胞,在单层培养条件下将软骨细胞增殖至P2代;将P2代细胞高密度条件下转入藻酸盐凝胶培养介质,进行三维培养。细胞培养分组:①不含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养。②含50μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养组。③单层培养。实验评估:①三维培养细胞于培养的2,4,6周行冰冻切片苏木精-伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。②单层培养细胞每传代1次行细胞爬片苏木精-伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。结果:①细胞学外观形态变化:两组藻酸盐凝胶三维培养体系中的软骨细胞在6周的培养过程中始终保持了圆形的细胞外观。单层培养软骨细胞在第5代以前,均保持了星形及多角形的正常软骨细胞外观。②免疫组织化学显示结果:培养6周后,含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养软骨细胞特异性Ⅱ型胶原细胞仍呈强阳性染色,表达水平较转入三维体系前未见降低,培养细胞保持了良好的分化表型。单层培养软骨细胞在第5代以前,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性。第6代以后,大部分细胞呈梭形,向成纤维细胞转化,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阴性。结论:胰岛素样生长因子Ⅰ对藻酸盐三维培养条件下的关节软骨细胞表型具有维持作用。     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化

背景:用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论.鉴于此,课题组提出"同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨"的实验设技.目的:同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法.方法:分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组:实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子.比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况.制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养.分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析.结果与结论:实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组(u=3.326,P < 0.01).实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞.组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性.提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨.同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求.     

胰岛素样生长因子Ⅰ对大鼠纤维环细胞体外增殖活性影响的量效关系

背景：近年来体外椎间盘髓核和纤维环组织细胞培养技术的建立，特别是软骨组织工程研究的不断深入及自体椎间盘细胞移植修复髓核缺损动物实验的初步成功，为退变椎间盘的形态结构与生理功能的完全再生修复带来了希望。目的：通过对椎间盘纤维环细胞的培养，观察胰岛素样生长因子Ⅰ对大鼠纤维环细胞体外增殖活性的影响及量效和时效关系。设计、时间及地点：单一样本观察，于2006—09／2007-01在山西医科大学寄生虫实验室完成。材料：清洁级1月龄Wistar系大鼠30只，雌雄不限。方法：体外分离培养大鼠纤维环细胞。剂量一效应实验：在培养的细胞中分别加入由含体积分数为0．01或0．1的小牛血清HAMF-12配制成的不同浓度的胰岛素样生长因子Ⅰ（0．1，1．0，10，100μg／L）。以不加生长因子做对照，培养72h。时间效应实验：在培养的细胞中分别加入含有最佳效应浓度胰岛素样生长因子Ⅰ体积分数为0．1的小牛血清＋F12培养液，分组为对照组和100ug／L的胰岛素样生长因子Ⅰ组，分别培养1，3，5，7d。主要观察指标：①苏木精-伊红、甲苯胺蓝、免疫细胞化学染色分析细胞的生物学特性。②噻唑蓝比色法观察胰岛素样生长因子Ⅰ在体积分数为0．01和0．1的血清浓度下对大鼠纤维环细胞体外增殖的调节作用及其剂量、时间与作用效果的关系。结果：苏木精-伊红染色细胞多为梭形，有伪足伸出，细胞核为圆形或椭圆形；甲苯胺蓝染色，胞浆为深蓝色；免疫细胞学方法检测表明纤维环细胞有Ⅰ型胶原表达；在体积分数为0．1的血清条件下，胰岛素样生长因子Ⅰ能提高细胞的增殖活性，并且在有效浓度范围内呈剂量效应关系。结论：胰岛素样生长因子Ⅰ能促进大鼠纤维环细胞的体外增殖，其效应在一定范围内与剂量和时间呈正相关。     

共培养诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化

背景：研究发现共培养可诱导人源干细胞向特定细胞分化,但如何控制两种细胞间比例以最大效率获得目的细胞是研究中的难题。目的：观察人脐血问充质干细胞与兔软骨细胞按不同比例共培养后向软骨细胞分化的情况。方法：复苏人脐血间充质干细胞并进行传代,将经流式细胞仪鉴定的人脐血间充质干细胞与体外分离的兔软骨细胞按照2：1或3：1的比例共培养,并用100pg／L的胰岛素样生长因子1进行诱导。在共培养14d,提取细胞RNA和蛋白质,实时定量PCR检测聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达,Westernblot检测聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达。结果与结论：人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞共培养14d,共培养的细胞聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达高于单纯胰岛素样生长因子1诱导的细胞。在人脐血间充质干细胞与软骨细胞比例相同时,加入胰岛素样生长因子1可提高细胞聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达。同时人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞按3：1共培养更能促进细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白及聚集蛋白多糖蛋白的表达;而按2：1共培养时,细胞聚集蛋白多糖mRNA表达更多。可见人脐血问充质干细胞与兔软骨细胞共培养后可诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化,且按3：1的比例共培养可获得更多的软骨细胞。     

成人关节软骨细胞增殖与人参皂甙Rg1的促进作用

背景：人参总皂甙的主要有效成分为人参皂甙Rg1,有促进细胞增殖、抗衰老、抗细胞凋亡、抗炎及抗自由基等作用,但以往实验对象多为鼠、兔等动物的关节软骨细胞。目的：体外培养成人软骨细胞,观察人参皂甙Rg1对体外培养的成人关节软骨细胞增殖的促进作用。方法：实验分2组,Rg1组使用含质量浓度为40mg/L人参皂甙Rg1的DMEM培养液培养,对照组使用未加人参皂甙的DMEM培养液培养,每日应用倒置相差显微镜观察细胞生长情况至第7天,并进行细胞计数。同时培养至第6天检测软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：对照组自培养第2天起细胞进入对数增殖期,到第7天细胞数约为接种时的8倍。Rg1组自培养第2天起细胞增殖能力较对照组增强（P〈0.05）,到第7天细胞数约为接种时的18倍（P〈0.05）。免疫组织化学SABC法检测结果显示,Rg1组与对照组细胞胞浆均可见Ⅱ型胶原表达,两组差异无显著性意义（P〉0.05）。说明人参皂甙Rg1可促进成人软骨细胞的增殖。     

转化生长因子β1抑制人肾小管上皮细胞的增殖

背景：慢性肾衰竭进展过程中的一个重要病理改变是炎症和纤维化,主要包括肾小球和肾小管的炎症和纤维化。目前大多数研究主要集中于肾小球,对于肾小管病变的研究相对较少。但实际上部分疾病的肾小管病变出现在肾小球病变之前,其对于疾病预后更具有指导意义。目的：观察转化生长因子β1对人类肾小管上皮细胞HK-2增殖的影响,探索转化生长因子β1在肾小管炎症和纤维化方面的作用。方法：将传代培养的HK-2细胞分成空白对照组和转化生长因子β1作用组,分别使用DMEM／F12培养液,以及含转化生长因子β1（2,5,10#g／L）的DMEM／F12培养液培养,在倒置显微镜下观察各组细胞形态的改变,并使用MTT法检测细胞增殖情况。结果与结论：转化生长因子β1能显著抑制人。肾小管上皮细胞的增殖,并促使细胞向纤维样改变,与空白对照组相比差异有显著性意义（P〈0．05）,其抑制增殖作用并不随转化生长因子β1质量浓度的增大而显著增强,作用时间可持续至72h。结果可见转化生长因子β1能够抑制人肾小管上皮细胞的增殖,并具有促进肾间质纤维化的作用。     

同种异体血清体外培养兔膝关节软骨细胞的增殖

背景:兔关节软骨细胞体外单层培养采用胎牛血清培养基易去分化,有必要寻找合适培养基来提高兔关节软骨细胞培养质量。目的:观察同种异体兔血清对体外培养的兔膝关节软骨细胞增殖能力的影响。方法:以0.4%链霉蛋白酶和0.025%Ⅱ型胶原酶分离成年兔膝关节软骨细胞,将获得的软骨细胞随机分为实验组和对照组。实验组以体积分数10%异体兔血清+DMEM/F12培养;对照组以体积分数10%胎牛血清+DMEM/F12培养,传代培养至4代。结果与结论:实验组前4代软骨细胞增殖较对照组慢,但软骨细胞形态未发生明显改变而对照组软骨细胞出现去分化现象。提示体积分数10%异体兔血清培养利于维持软骨细胞增殖和形态的稳定,是较好的获取大量优良软骨细胞的体外培养方式。     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清DMEM培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数1O％胎牛血清的DMEM,F12培养液进行诱导分化。结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物nestir。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6．0％-7．0％;BrdU掺入实验显示细胞增殖率为37．9％。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型B微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

脐带间充质干细胞在不同培养体系条件下的生物学特性

背景：体外培养的脐带间充质干细胞在不同培养体系下生长状态差异显著,因此选取一种更适合的培养基相当必要。目的：对比观察人脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长增殖情况,并检测细胞免疫表型以及间充质干细胞的诱导分化能力。方法：在无菌条件下用贴块法收获人脐带间充质干细胞,用T75培养瓶培养传代后,取第3代脐带间充质干细胞分别种入到含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养基、含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和Mesen PRO RSTM培养基中,培养第1,3,5,7天进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。采用流式细胞仪分析第3代脐带间充质干细胞免疫表型,并检测其成骨及成脂肪诱导分化能力。结果与结论：培养出的第3代人脐带间充质干细胞高表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD29、CD31、CD34、HLA-DR。经成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中有大量红色小脂滴;成骨诱导后,茜素红染色后镜下可见成骨样细胞团,说明脐带间充质干细胞在体外具有多向分化的潜能。在倒置显微镜下观察可见含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中的细胞集落密集,形态均匀,而其他2种培养基中的细胞集落密集程度和形态都不如前者好。在培养传代细胞时,可优先选择含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。     

威灵仙提取物干预膝骨关节炎软骨细胞的生长活力

背景：近年来研究显示关节软骨细胞过度凋亡是骨性关节炎开始和进展的关键因素,利用药物抑制软骨细胞凋亡来控制骨性关节炎的进展是现在的研究热点。而威灵仙在国内临床治疗骨关节炎时取得了较确切的疗效,但是其具体的作用机制是否通过抑制软骨细胞凋亡来实现尚未见相关报道。目的：观察中药威灵仙提取物对膝骨关节炎软骨细胞生长活力的影响。方法：取骨关节炎晚期行膝关节置换的关节软骨,剪碎后,采用酶消化法消化细胞,将处于对数生长期第3代细胞随机分组,实验组分别加入0.01,0.05,0.1,0.5,1.0g/L威灵仙提取物培养基,对照组仅加入普通培养基进行培养。Live/Dead染色法测定人软骨细胞活力指数,TUNEL染色法测定人软骨细胞凋亡指数。结果与结论：0.05,0.1g/L威灵仙提取物能明显提高软骨细胞活力,而0.5,1.0g/L威灵仙提取物反而降低了软骨细胞活力,其活力指数与对照组比较差异均有显著性意义（P〈0.05）;0.01,0.05,0.1g/L威灵仙提取物能有效抑制软骨细胞凋亡,1.0g/L威灵仙提取物反而促进了软骨细胞凋亡,其凋亡指数与对照组比较差异均有显著性意义（P〈0.05）。结果可见威灵仙提取物在合适的质量浓度时能有效提高人软骨细胞活力,抑制人软骨细胞凋亡,尤以0.1g/L时效果最佳。     

膝关节腔内培养骨髓间充质干细胞复合脱钙骨的组织工程软骨

背景：如何更好地以组织工程学方法修复关节软骨缺损并达到良好的远期疗效目前尚无公识。目的：创新性地在膝关节腔内培养兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨的组织工程软骨。方法：采用全骨髓贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞,DMEM／F12完全培养基培养,成软骨诱导条件培养基诱导分化。取同种异体兔的髂骨和椎体骨制作成脱钙骨支架,诱导后的骨髓间充质干细胞种植于脱钙骨支架上,培养1d后将细胞支架复合物用筋膜包裹置于兔左膝关节腔内培养,单纯脱钙骨支架筋膜包裹置入右膝关节腔。于培养第4,8,12周分别取材,行大体观察并制成石蜡切片,采用苏木精伊红染色、甲苯胺蓝染色,Ⅱ型胶原免疫组化染色方法进行组织学观察。结果与结论：培养4,8周,细胞一支架组标本Ⅱ型胶原免疫组化的平均吸光度值（A）分别为0．263±0．031,0．340±0．052,单纯支架组标本分别为0．147±0．027,0．165±0．030,两组比较差异有显著性意义（P〈0．05）;培养12周细胞支架组标本Ⅱ型胶原免疫组化A值平均为0．362±0．037,标本类似正常软骨外观,Ⅱ型胶原免疫组化反应呈阳性;而单纯支架组脱钙骨支架降解。培养12周细胞一支架组苏木精一伊红染色结果显示细胞数量多,脱钙骨支架基本被吸收;而甲苯胺蓝染色结果显示有被染成紫红色的异染性基质形成。结果提示兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨可在兔膝关节腔内培养出组织工程软骨。     

富血小板血浆复合软骨细胞构建可注射性组织工程化软骨

背景：富血小板血浆中含有大量的生长因子,因此其在骨再生、创伤愈合等方面得到了较多的应用,然而其在组织工程软骨的研究报道较少。 目的：观察富血小板血浆对软骨细胞增殖和分化的影响,以及富血小板血浆复合软骨细胞构建组织工程化软骨的可行性。 方法：检测兔全血、富血小板血浆及激活富血小板血浆中转化生长因子β、胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子BB及表皮生长因子的浓度。将兔软骨细胞在分别含10％,15％,20％,30％富血小板血浆的DMEM培养液中培养7d,CCK-8法检测细胞增殖,QT-PCR检测细胞内II型胶原、蛋白聚糖、Sox-9的表达。在兔皮下注射自体富血小板血浆与软骨细胞复合物,6周后取材进行组织学检测。结果与结论：富血小板血浆中各生长因子浓度高于全血（P〈0．05）,激活富血小板血浆中各生长因子浓度高于富血小板血浆（P〈0．05）。不同浓度富血小板血浆均能促进软骨细胞的增殖,且20％浓度内呈浓度依赖性。20％浓度组促II型胶原表达的能力强于其他浓度组（P〈0．05）,15％浓度组促Sox-9和蛋白聚糖表达的能力强于其他浓度组（P〈0．05）。富血小板血浆一软骨细胞复合物移植后,新生组织呈软骨样并有明显的软骨陷窝,细胞外富含软骨样基质,表明其作为可注射性支架用于软骨组织工程。     

三种比色法评价4种牙科金属材料对L-929细胞的毒性

背景：采用不同方法评价材料的细胞毒性可能会得出不同的实验结果。目的：采用3种比色法评价镍铬合金、钴铬合金、3铬13及纯钛等牙科金属材料对小鼠成纤维细胞（L-929细胞）的细胞毒性。方法：以镍铬合金、钴铬合金、3铬13及纯钛4种牙科金属材料的浸提液分别作用于体外培养的L-929细胞24,72h。以体积分数10％小牛血清＋高糖DMEM培养液培养的L-929细胞为阴性对照组,以0.7％丙烯酰胺＋体积分数10％小牛血清＋高糖DMEM培养液培养的L-929细胞为阳性对照组,分别采用MTT、CCK-8及结晶紫3种比色法检测上述材料的细胞毒性。结果与结论：①4种材料浸提液中培养的细胞形态正常,胞内结构清晰,随着培养时间延长细胞大量增殖,与阴性对照组细胞形态无明显差异。阳性对照组细胞数量明显减少,形态完整性受破坏,形成大量细胞碎片。②培养24h时,CCK-8比色法检测中钴铬合金组的细胞相对增殖率低于阴性对照组沪〈0．05）,MTT及结晶紫比色法检测中钴铬合金组的细胞相对增殖率与阴性对照组比较差异无显著性意义（P〉0．05）;培养72h时,MTT比色法检测中4种牙科金属材料组细胞相对增殖率低于阴性对照组（P〈0．01）,CCK-8及结晶紫比色法检测中4组的细胞相对增殖率与阴性对照组比较差异无显著性意义（P〉0．05）,但材料细胞毒性均为0—1级。表明上述4种牙科金属材料细胞毒性均在临床应用的允许范围内,具有良好的生物安全性。