人外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

树突状细胞(DC)作为抗原提呈细胞,在激发T细胞免疫应答及T细胞依赖性抗体生成中起重要作用,骨髓及外周血的CD34造血前体细胞在GM-CSF和TNF-α的作用下,可在体外分化发育,生成树突状细胞.本研究从正常人外周血分离获得单核细胞,加入100ng/ml hGM-CSF、500U/ml hIL-4,体外培养1周后,获得大量高纯度的树突状细胞,其高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子B7-1和CD40,能强烈激发同种异体T淋巴细胞增殖,培养条件以应用自体血清或胎牛血清为最佳;单独应用hGM-CSF只能生成巨噬细胞;在培养末期加入TNFα可促进DC进一步成熟.本研究为DC的深入研究与临床应用奠定了基础.     

α干扰素促进急性髓性白血病来源的树突状细胞的成熟分化

目的:研究α干扰素(interferon alpha,IFN-α)对不同亚型的急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞来源的树突状细胞(dendritic cell,DC)免疫表型及功能的影响。方法:5例初发AML患者(其中M2 1例、M4 2例、M5 2例)的外周血单个核细胞,在含GM-CSF、IL-4、TNF-α的无血清培养液中培养11 d,其后加入IFN-α-2a(1 000 U/ml)继续培养3 d,获得DC(IFN-AML-DC),光镜下观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞免疫表型,同种异体混和淋巴细胞反应检测DC的免疫功能。结果:所有患者白血病细胞培养14 d后均转化为IFN-AML-DC,与正常人外周血单核细胞由GM-CSF IL-4 TNF-α培养获得的DC(monocyte-derived DC,MoDC)及AML细胞由GM-CSF IL-4 TNF-α培养获得的DC(AML-DC)相比,IFN-AML-DC具有典型成熟形态的细胞明显增多,表达CD83 细胞的比例显著增加,HLA-DR、CD86分子的表达水平增高,对同种异体T淋巴细胞的激活能力明显高于MoDC及AML-DC。结论:IFN-α能够促进AML-DC的体外成熟,形成更强的免疫激活能力,为AML的免疫治疗提供更有力的手段。     

树突状细胞应用于急性白血病免疫治疗的初步研究

目的为了将树突状细胞(DC)应用于急性白血病的免疫治疗,初步探索从急性白血病患儿的外周血诱导扩增树突状细胞的可能性,并对其特性加以研究。方法获取完全缓解6个月以后的急性白血病患儿的外周血单核细胞,加入rIL-4、hGM-GSF、TNF-α等细胞因子诱导单核细胞分化形成DC,利用间接免疫荧光技术进行DC的表型鉴定,利用混合淋巴细胞反应检测了其抗原刺激能力。结果培养7～8天后的细胞高度表达DC的特征性表面分子CD1α(86.2％)、CD80(73.2％)及HLA-Ⅰ类(64.6％)、HLA-Ⅱ类(77.2％)分子等;正常人DC的产量平均为9.05×106/100ml,白血病人DC的产量平均为2.0×106/100ml,两者差别有极显著意义(P＜0.001);5×102个DC可较强地刺激同种异体淋巴细胞增殖,并且随着DC浓度的增加,淋巴细胞增殖反应增强。结论急性白血病人完全缓解6个月后从外周血可以诱导出有较强的抗原刺激能力的DC。     

脐血来源树突状细胞体外诱导抗卵巢癌免疫特异性

[目的]研究脐血来源树突状细胞(DC)体外诱导特异性抗卵巢癌细胞的免疫效应.[方法]①从脐血中分离单个核细胞(MNCs)后,获得单核细胞(Mo).粒单集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导分化,培养7天后应用流式细胞仪进行细胞表型分析.②诱导单核细胞分化的第3天加入人卵巢癌细胞株3AO的冻融抗原,共培养4天后获得负载肿瘤抗原的成熟DC;将致敏DC与从脐血中分离的同种异体T淋巴细胞共培养3天,获得细胞毒T淋巴细胞(CTL);四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL及上清对人卵巢癌细胞株3AO、人胚肾细胞株293T(对照细胞)、人肝癌细胞株HCCC-9810的细胞毒作用.[结果]①脐血来源单核细胞(Mo)在GM-CSF和IL-4作用下,7天后可分化生成成熟的DC,高表达DC特异性抗原CDla、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、HLA-DR、CD83.②DC可负载并递呈肿瘤抗原,激活同种异体T淋巴细胞,诱导肿瘤特异性CTL产生.不同浓度CTL及上清对卵巢癌细胞3AO有特异性杀伤、抑制作用(P＜0.05).[结论]脐血中单核细胞可体外分化扩增为成熟的功能性DC,并诱导出特异性杀伤卵巢癌细胞的免疫效应.     

粒-巨噬细胞集落刺激因子剂量对小鼠骨髓源性树突状细胞成熟状态的影响

 目的　观察不同剂量粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）对小鼠树突状细胞（DC）形态、纯度、成熟程度的影响,为不同用途的DC疫苗制备选择合适的GM-CSF质量浓度提供理论依据。方法　用低剂量（5 ng／ml）、常规剂量（20 ng／ml）、高剂量（50 ng／ml）GM-CSF联合重组小鼠白细胞介素-4（mIL-4）诱导小鼠骨髓细胞体外分化为DC,流式细胞术测定CD11c、CD80和CD86表达率。结果　低剂量GM-CSF组诱导的DC不具有典型的DC形态,低表达CD11c、CD80和CD86。常规剂量GM-CSF组诱导的DC高表达CD11c、CD80和CD86,具有更强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。高剂量GM-CSF组CD11c、CD80和CD86表达率最高,并具有最强的刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。结论　GM-CSF剂量影响诱导分化的DC成熟程度。低剂量的GM-CSF诱导的DC为不成熟的DC,常规剂量和高剂量GM-CSF诱导分化的DC为细胞表型和功能成熟的DC。高剂量GM-CSF诱导的DC细胞表型和功能最成熟。     

IL-27促进人单个核细胞来源树突状细胞的分化成熟及其作用机制

目的:探讨IL-27对人外周血单个核细胞来源的树突状细胞(dendritic cell,DC)形态和功能的影响及其作用机制。方法:从正常健康人外周血中分离出单个核细胞,将其用GM-CSF、IL-4体外培养7 d,并于培养的第5天加入不同刺激因子,并将细胞分为4组:阴性对照组、阳性对照组(20 ng/ml TNF-α)、IL-27(20 ng/ml)组、IL-27+TNF-α组(即双细胞因子组,10ng/ml TNF-α+10 ng/ml IL-27)。用倒置显微镜观察培养7 d的DC形态,用流式细胞术检测DC表面共刺激分子CD1a/CD83和CD80/CD86的水平,RT-PCR检测DC表面趋化因子受体CCR5、CCR7 mRNA的表达,混合淋巴细胞实验检测DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力,Western blotting检测DC信号通路蛋白P-STAT1/STAT3的含量。结果:IL-27组和双细胞因子组诱导7 d时DC呈现典型的成熟形态学特征;DC表面CD1a和CD83双阳性表达[(35.75±4.10)%、(52.49±2.65)%vs(23.29±4.49)%,P<0.05]、CD80和CD86双阳性表达[(39.06±1.61)%、(54.10±0.46)%vs(22.66±3.20)%,P<0.05]、趋化因子受体CCR7 mRNA[3.98±0.09、4.75±0.11 vs 3.09±0.18,P<0.05]和转录因子蛋白P-STAT1/STAT3水平均较阴性对照组明显上调,而CCR5 mRNA[0.99±0.03、0.61±0.02 vs 1.23±0.26,P<0.05]表达含量则明显下降;IL-27组和双细胞因子组DC均可明显刺激T细胞增殖,且随DC与T细胞比例增加而增强,以双细胞因子组的刺激作用更为明显。结论:细胞因子IL-27可以直接或者协同TNF-α诱导人DC分化成熟,并增强DCs的抗原提呈功能,其机制可能与活化P-STAT1/STAT3信号通路有关。     

CD14+单核细胞系白血病细胞来源树突细胞体外刺激特异抗白血病T细胞应答

背景与目的:白血病细胞能在体外分化为树突细胞(dendriticcells,DCs),从而有希望用于白血病的免疫治疗。本研究旨在探讨CD14高表达的单核细胞系白血病(M4、M5)细胞分化而来的DCs体外诱导抗白血病T细胞应答的能力。方法:取5例初诊CD14高表达的M4或M5型白血病患者的骨髓标本,分离单个核细胞(bonemarrowmononuclearcells,BMMNCs),将白血病细胞分为3组:贴壁白血病细胞组、非贴壁白血病细胞组及总白血病细胞组。流式细胞术(flowcytometry,FCM)比较3组细胞的CD14表达。用含GM-CSF、IL-4和TNF-α或不含细胞因子的培养液培养细胞7～10天后,通过细胞形态学观察及FCM检测细胞表型,鉴定单核白血病细胞来源的DCs(monocyticleukemiacell-deriveddendriticcells,Mo-LDCs);采用异基因混合淋巴细胞反应(allogeneicmixedlymphocytereaction,Allo-MLR)以及细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)抗白血病细胞毒分析检测Mo-LDCs的免疫功能,染色体核型分析结合异常表面抗原确定Mo-LDCs的白血病来源。结果:3组中贴壁白血病细胞的CD14含量最高,在细胞因子联合诱导下,可分化为大量CD83 成熟DCs。在同一病例的3组细胞以及不同病例的总单核细胞组间,培养前CD14的表达率与诱导后CD83 DCs的产率成正相关(r=0.967,P=0.007)。Mo-LDCs具有典型的成熟DCs的形态及表型特征,在Allo-MLR中能刺激同种T细胞明显增殖,并能刺激扩增特异性抗白血病CTL。同时,Mo-LDCs持续存在所起源白血病的核型异常和异常表达的髓系抗原。结论:在细胞因子组合诱导下,M4、M5亚型AML的CD14 细胞可分化为具有免疫功能的Mo-LDCs,单核系白血病细胞的CD14表达高低可能预示其DCs分化能力。Mo-LDCs具有经典的DCs的表型及功能,还具有白血病的克隆异常,可用于M4、M5患者的免疫治疗。     

人类外周血来源树突状细胞的体外诱导培养

目的 探讨体外诱导培养较高纯度和成熟度的树突状细胞(DC)的方法.方法 密度梯度离心分离人类外周血单核细胞,直接贴壁法收集前体细胞,含人类血清及细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4完全RPMI1640培养基,37 ℃、5%CO2孵育培养;第3天全量换液并添加细胞因子,第5天加入rhTNF-α促进成熟,第8天收获悬浮细胞.同时进行形态学和细胞表型分析.结果 镜下表现为典型的DC形态特征;流式分析细胞表型CD1a阳性表达从第5天的(18.69±8.73)%增加到第8天的(78.07±9.43)%,CD83表达从(14.74±4.06)%增加到(46.82±14.15)%,第5天CD80表达(9.82±4.61)%,第8天CD80表达(60.11±20.50)%;40 ml外周血约得(3.12±1.30)×106个DC.结论 该方法可以体外诱导培养出较大数量和较高纯度的成熟DC,并且培养体系成熟,操作性和可重复性强.     

IFN-α联合GM-CSF诱导胃癌患者外周血单个核细胞分化为树突状细胞

目的： 探索干扰素-α（interferon-α,IFN-α）联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF）体外诱导胃癌患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）向树突状细胞（dendritic cell,DC）分化的可能性。 方法： 10 例胃癌患者PBMC分别用GM-CSF 100 ng/ml联合IFN-α 500 IU/ml（命名为IFN-α DC） 或GM-CSF 100 ng/ml联合50 ng/ml IL-4（命名为IL-4 DC）体外培养,然后用CD40L、LPS诱导DC成熟。Giemsa染色法观察IFN-α DC和IL-4 DC的形态,流式细胞术分析IFN-α DC和IL-4 DC表面CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达情况,同种异体混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR）检测不同的成熟DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。 结果： IFN-α DC和IL-4 DC均呈现典型DC形态。IFN-α DC和IL-4 DC分别在诱导第3天和第5天时,细胞表面CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR表达达到较高水平,成熟IFN-α DC表面CD83\[（78.25±15.36）% vs （50.14±10.24）%,P<0.05\]和CD86\[（84.84±10.12）% vs （62.93±15.12）%,P<0.05\]的表达均高于成熟IL-4 DC。成熟IFN-α DC刺激异体T淋巴细胞增殖能力强于未成熟IFN-α DC（P<005）。在DC与T细胞数量比为1∶40和1∶20时,成熟IFN-α DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力明显强于成熟IL-4 DC\[（39.43±9.21）% vs （27.34±10.63）%,（60.31±7.86）% vs （48.63±6.25）%;均P<0.05\]。 结论： 相比常用的IL-4联合GM-CSF诱导方法,IFN-α联合GM-CSF可以在更短时间内将胃癌患者PBMC诱导成具有更强刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的DC细胞,这可能与其表面CD83和CD86表达增高有关。     

钙载体A_(23187)快速诱导人外周血单核细胞成树突状细胞

 目的　探讨钙载体 (calciumionophore ,CI)A2 3 187对正常人外周血单核细胞来源的树突状细胞(Dendriticcell,DC)形态、表面分子表达及免疫功能的影响。方法　分离健康献血者外周血单核细胞 ,分别加入 :重组人粒 /单集落刺激因子 (rhGM CSF) 10 0ng/ml、rhGM CSF 10 0ng/ml +IL 4 5 0ng/ml、rhGM CSF +A2 3 187(钙载体 ,CI)各 10 0ng/ml。体外培养 4 0h后 ,于光镜及电镜下观察细胞的形态、流式细胞仪检测细胞的表面标志、MTT比色法检测上述细胞对同种异体T细胞的刺激增殖作用。结果　外周血单核细胞在GM CSF +A2 3 187各 10 0ng/ml的条件下培养 4 0h ,就可看到典型的DC形态 ,其表面单核细胞的特征性标志CD14分子表达减少 ,HLA DR、CD80、CD86及CD83分子的表达均明显增高 ,且具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力。结论　外周血单核细胞在钙载体A2 3 187及GM CSF的共同作用下 ,4 0h就能获得成熟的DC     

Secretion of Transforming Growth Factor-ß by Human Myelogenous Leukemic Cells and Its Possible Role in Proliferation of the Leukemic Cells

Transforming growth factor(TGF)-ß activity was found in the neutral extracts of human myelogenous leukemic cells or K562 cells and the conditioned medium from K562 cell culture. BALB/c 3T3 cells grown in soft agar in the presence of TGF-ß₁ produced an activity that stimulated the growth of K562 cells. This activity was non-dialyzable. acid-stable, heat-sensitive and partially Inactivated by pronase treatment. These results suggest a mutual growth reliance between the leukemic cells and fibroblasts mediated by paracrine growth factors produced by these cells.     

白血病干细胞的天然耐药性分析

复发或耐药难治的急性白血病不能治愈的原因是患者体内存在一群具有自我更新能力的白血病干细胞（LSC）。虽然这些细胞数量极少,但可自我更新,具有很强的增殖潜能,在白血病发生和复发过程中起着关键性作用。全文对LSC起源、静歇性、抗凋亡性与易产生耐药性特点进行分析,提示有针对性的杀伤LSC,不但可有效克服白血病的天然耐药性,也是解决难治性白血病低缓解率、高复发率和低生存期的有效途径。     

hTERT反义酸对淋巴白血病细胞端粒酶活性的抑制(英文)

目的 研究和探索hTFRT反义核酸对淋巴白血病细胞端粒酶活性的影响。方法 用PCR ELISA试剂合测定端粒酶的活性;免疫组织化学和流式细胞仪技术测定hTERT蛋白的含量;用RT-PCR和电泳技术测定hTERT mRNA水平。结果 实验结果显示,10μmol/L AS PS-ODN作用72 h以后,hTERT mRNA和蛋白的水平显著下降,端粒酶的活性明显受到抑制。结论 hTERT反义核酸是淋巴白血病细胞端粒酶活性的良好的抑制剂。     

hTERT反义酸对淋巴白血病细胞端粒酶活性的抑制(英文)

目的研究和探索 hTERT 反义核酸对淋巴白血病细胞端粒酶活性的影响。方法用 PCR ELISA 试剂合测定端粒酶的活性;免疫组织化学和流式细胞仪技术测定 hTERT 蛋白的含量;用 RT-PCR 和电泳技术测定 hTERT mRNA 水平。结果实验结果显示,10 μmol/L AS PS-ODN 作用72 h 以后,hTERT mRNA 和蛋白的水平显著下降,端粒酶的活性明显受到抑制。结论 hTERT 反义核酸是淋巴白血病细胞端粒酶活性的良好的抑制剂。     

Expression of Cytokine mRNA in Leukemic Cells from Adult T Cell Leukemia Patients

HTLV-I infection of peripheral mature T cells appears to induce the expression of cellular genes including those of some cytokines and their receptors. We examined the expression of interleukin-lα (IL-l α ), IL-l β , IL-2, IL-3, IL-4 and granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) at the mRNA level in fresh leukemic cells from 20 adult T cell leukemia patients to see whether there is any association between cytokine expression and MTLV-I expression and between their expression and clinical manifestations such as hypercalcemia or neutrophilia. IL-l α , IL-I β and IL-3 expression was observed in 3, 7 and 1 of 20 cases examined, respectively. However, there seemed to be no association between IL-1 expression and clinical manifestations. IL-2, IL-4 and GM-CSF mRNA expression was not detected. HTLV-I viral RNA expression was detected only in one case in which IL-3 mRNA was expressed in both peripheral blood and lymph node cells and a relatively high proportion of leukemic cells expressed IL-2 receptor (p55, Tac). Thus, in the present study we could not find any correlation between cytokine expression and HTLV-I expression in peripheral blood fresh leukemic cells except in one unusual case.     

Curcumin-induced Apoptosis in HL-60 Human Leukemic Cells

Curcumin is the main biologically active phytochemical compound in turmeric. It has been shown to have ‍anticarcinogenic activity. The aims of the study were to identify the mechanism of apoptosis of HL-60 human ‍promyelocytic leukemic cells induced by curcumin and to determine the effects of water-soluble antioxidants, ascorbic ‍acid, Trolox (a water-soluble form of vitamin E), glutathione (GSH) and N-acetylcysteine (NAC) on this process. ‍HL-60 cells were incubated with curcumin for 24 h and apoptotic cells were quantitated by flow cytometry following ‍staining with annexin V-FITC and propidium iodide. Curcumin-treated HL-60 cells produced reactive oxygen ‍species as detected by the dichlorofluorescein fluorescent assay. Apoptosis occurred via the mitochondria pathway ‍as curcumin reduced mitochondrial membrane potential in a dose-dependent manner. In the presence of 10 iM ‍curcumin, vitamin C (56 nM – 5.6 iM) inhibited apoptosis of HL-60 cells; GSH at low concentration (1 iM) reduced ‍apoptosis but had no effect at higher concentrations (10, 100 iM); and Trolox and NAC at 10 and 100 iM, respectively, ‍enhanced apoptosis, but this effect was abolished at higher concentration (1 mM) of NAC. MAPKK/MEK inhibitor ‍PD98059, enhanced curcumin-induced HL-60 apoptotic cell death.     

BLK Selectively Regulates Leukemic Stem Cells in CML

BLK suppresses CML growth by negatively regulating leukemic stem cell function.     

白血病细胞核基质蛋白的研究

目的　研究白血病细胞核基质蛋白与正常骨髓细胞核基质蛋白的差异。方法　应用高盐抽提法抽提细胞核基质蛋白,SDS PAGE技术分析白血病细胞与正常骨髓细胞核基质蛋白的变化。结果　与正常骨髓细胞相比,急性白血病细胞核基质蛋白成分明显增加,且出现多种正常骨髓细胞所没有的蛋白带;不同类型白血病细胞核基质蛋白存在差异。结论　白血病细胞与正常骨髓细胞的核基质蛋白成分有明显差异,新出现的核基质蛋白改变可能与白血病的发生发展有关。