骨髓基质细胞的体外培养和向成骨及软骨分化的实验研究

目的 研究骨髓基质细胞（BMSC）的成骨及软骨分化功能。方法 采用细胞静置贴壁培养法，体外培养了兔和儿童的BMSC，用传至2－3代兔BMSC和Ⅱ型胶原联合治疗兔膝关节软骨缺损，采用成骨诱导培养法研究儿童BMSC的成骨效应。结果 （1）Ⅱ型胶原和bFGF对兔BMSC的贴壁和生长是有效的。（2）用兔BMSC和Ⅱ型胶原治疗12周后，能使兔膝关节软骨缺损获得恢复，其软骨细胞分化明显；（3）用成骨诱导培养法，可使儿童BMSC骨钙素分泌水平比常规对照组升高8－10倍，并可见有典型的成骨化的黑色矿化细胞区。结论 骨髓基质细胞具有成骨和软骨分化功能。     

不同基因转染对骨髓基质干细胞成骨活性的影响

为了优化骨组织工程种子细胞，探讨不同基因对骨髓基质干细胞（MSCs）成骨活性的影响，我们首先利用RT—PCR方法获得了全长BMP-2．VEGF 165及bFGF基因，克隆入真核表达载体peDNA3．0，鉴定正确后，经脂质体介导转入分离培养的大鼠骨髓基质干细胞，G418筛选出稳定表达株。并利用RT—PCR、免疫组织化学方法证明目的基因能够在骨髓基质干细胞中得到稳定表达。MTT实验结果显示转基因后的MSCs增殖能力有不同程度的提高。细胞内碱性磷酸酶活性明显上调，BMP-2、bFGF转染组骨钙索水平升高，成骨活性增强。提示：BMP-2、bFGF基因修饰的骨髓基质干细胞作为种子细胞能够更为有效地在骨组织工程中发挥作用。     

骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响

背景：基因转染技术正积极地应用于组织再生治疗之中,研究表明骨形态发生蛋白7具有骨诱导特性,可以有效促进成骨细胞的发育以及新骨的形成。 目的：探讨骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响。 方法：分离、培养羊骨髓基质干细胞,利用重组骨形态发生蛋白7腺病毒(adenovirus bone morphogenetic protein 7,Adeno-BMP7)对第2代骨髓基质干细胞进行基因转染,透射电镜观察转染后细胞超微结构。流式细胞仪检测转染后的细胞周期,Western blot检测骨形态发生蛋白7的表达,Von Kossa染色观察钙结节形态情况。取转染后第3天及相应未转染的骨髓基质干细胞制备珊瑚-细胞复合物,于裸鼠脊柱两侧背部皮下注射4周和8周后进行大体观察和组织学检测。 结果与结论：体外细胞超微结构观察可见Adeno-BMP7基因转染骨髓基质干细胞存在活跃的物质合成代谢;流式细胞仪检测发现转染不会对骨髓基质干细胞的细胞周期产生明显影响;Western blot检测转染后的骨髓基质干细胞存在骨形态发生蛋白7蛋白的表达;Von Kossa染色可见转染Adeno-BMP7后的骨髓基质干细胞形成较大的钙结节。经裸鼠皮下回植实验发现,Adeno-BMP7转染后骨髓基质干细胞的成骨能力和成骨质量明显提高。以上结果表明经Adeno-BMP7转染可以有效促进骨髓基质干细胞成骨分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

骨形态发生蛋白2基因转染人羊水干细胞复合β-磷酸三钙支架促进骨再生

目的研究重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白2（BMP-2）基因转染人羊水干细胞（hAFSC）的体外成骨分化,评价基因修饰的hAFSC负载于β-磷酸三钙（β-TCP）多孔支架后体内成骨能力。方法收集人工破膜后的中段羊水原代培养hAFSC,免疫磁珠分选CDl17／c-kit阳性的hAFSC,分别转染腺病毒介导的BMP-2或增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因,转染组转染BMP-2和EGFP基因、对照组转染无BMP-2编码序列的EGFP基因,空白组不做病毒转染。48h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达及生长状况,应用流式细胞仪检测转染率。转染第7、14、21、28天采用ELISA检测各组hAFSC培养液中的BMP．2分泌量以确认转染后目的蛋白表达效果。各组hAFSC成骨诱导14d后进行碱性磷酸酶（ALP）染色,28d后进行茜素红染色评价成骨能力;成骨诱导3、7、14d后定量检测各组细胞ALP活性。20只8周龄裸小鼠随机分为Adv-hBMP-2-hAFSC-β-TCP组、Adv-EGFP-hAFSC-β-TCP组、hAFSC-β-TCP组和β-TCP组,每组5只,将细胞载体复合物植入各组裸小鼠股骨,8周后观察异位成骨组织学情况。结果hAFSC生长良好,Adv-hBMP-2或Adv-EGFP基因转染48h后荧光显微镜下见细胞贴壁良好,发出强绿色荧光,无死细胞产生,转染阳性率达（89．00±4．25）％。转染Adv-hBMP-2组hAFSC培养液上清中BMP-2第7、14、21、28天分别为（3．405±0．229）μg／L、（4．575±0．179）μg／L、（3．910±0．175）μg／L、（2．694±0．205）μg/L,第14天蛋白BMP-2分泌已达到高峰且第28天仍有蛋白表达,各时间点均明显高于对照组与空白组（均P〈0．05）。hAFSC成骨诱导14d后细胞相连成片,与对照组及空白组比较,ALP染色转染组染色阳性面积更大、阳性细胞数量更多。成骨诱导28d后茜素红染色见转染组细胞多中心聚集,伴大量红色钙结节形成,结节数量与大小明显优于对照组与空白组。成骨诱?     

硫酸钙对人骨髓基质干细胞诱导成骨过程中BMP-2和VEGF表达的影响初步研究

目的探讨硫酸钙（CS）对成骨诱导培养液诱导人骨髓基质干细胞（hBMSC）向成骨细胞转化及成骨基因改变的影响,以明确CS促进骨形成可能的分子生物学机制。方法分离培养hBMSC,随机分为2组,第1周均用成骨诱导液培养,实验组在第2周改以含CS的成骨诱导培养液培养,而对照组仍继续使用成骨诱导培养液培养,实验第14天收集细胞,进行RNA的抽提、纯化和质量检测,并合成cDNA,用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞骨形态发生蛋白2（BMP-2）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达。细胞爬片后,用含或不含CS的成骨诱导培养液分别连续培养hBMSC,异硫氰酸荧光素（FITC）染色,荧光显微镜观察矿化结节形成情况。结果两组细胞均生长并缓慢增殖,细胞生长形态和矿化结节形成情况分别在相差显微镜和荧光显微镜下观察无显著区别。但是与对照组相比,实验组BMP-2和VEGF相对表达量均增高（P〈0.05）。结论 CS可能具有潜在的骨诱导活性、能够促进骨形成,与含CS成骨诱导培养液诱导BMSC成骨基因表达上调有关。     

NAC-PCCs载骨形态发生蛋白2基因纳米微球促大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化

目的　构建半胱氨酸及磷酸胆碱共接枝的仿生壳聚糖载体（NAC-PCCs），并包封骨形态发生蛋白2（BMP2）基因进行诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的研究。 方法　制备pBMP2/NAC-PCCs材料，检测其粒径、形态，绘制DNA缓释曲线，研究微球抗DNA酶降解能力。在骨髓间充质干细胞与材料共培养过程中，检测材料的转染效能、ROS清除能力、BMP2蛋白分泌水平、成骨相关基因RUNX2、OC表达、碱性磷酸酶活性等指标，以研究其对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。 结果　微球材料能有效避免DNA被生物酶降解，其转染效率为23.1%，ROS清除率为(36.13±0.47)%。同时实验结果显示与NAC-PCCs共培养的细胞， 其细胞内BMP2表达水平高于其余各组且成骨分化效果最佳。 结论　NAC-PCCs包封BMP2基因形成的纳米微球材料具有促进BMSC成骨分化作用。     

新型壳聚糖基仿生网络复合膜诱导骨髓间充质干细胞定向成骨分化

目的 探讨新型壳聚糖基网络复合膜诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）定向成骨分化的可行性.方法 采用仿生学方法,壳聚糖、明胶、果胶按照一定比例制作成新型壳聚糖基仿生网络复合膜.设计4个组：实验组1（复合膜＋常规培养基）,对照组1（常规培养基）,实验组2（复合膜＋成骨诱导（OS）培养基）,对照组2（OS培养基）.通过倒置相差显微镜、四甲基偶氮唑盐（MTT）法、扫描电镜（SEM）检测细胞在复合膜上的生长和增殖情况;通过测定碱性磷酸酶（ALP）活性来评价MSCs在复合膜上的成骨分化能力;通过特殊染色和能谱分析（EDX）来评定钙盐的沉积.结果 MSCs在网络复合膜上贴附、生长良好且增殖旺盛.MTr法检测细胞活力显示实验组吸光度（OD）值与对照组比较无统计学意义（P＞0.05）.SEM观察到细胞在支架材料表面呈聚集生长,分泌大量的细胞外基质,可见散在的结节形成.实验组1的ALP活性明显增高,与实验组2、对照组比较有统计学意义（P＜0.01）.茜素红和Von Kossa染色可见实验组细胞分化后形成的钙化结节;ALP染色可见胞浆内蓝染颗粒;EDX检测到Ca、P沉积.结论 新型壳聚糖基网络复合材料具有良好的生物相容性,在不添加诱导剂的条件下,可以诱导MSCs定向成骨分化.     

体外培养成骨细胞对自体骨髓间充质干细胞定向成骨分化的影响

目的观察体外培养成骨细胞对自体骨髓间充质干细胞（BMSC）增殖和定向成骨分化的影响．探讨此诱导方法作为骨组织工程种子细胞来源方法的可行性。方法应用密度梯度离心联合贴壁筛选法从兔股骨骨髓中分离、纯化BMSC．取第3代BMSC常规培养设为空白对照组,利用含有钙化诱导剂的DMEM培养基诱导培养第3代BMSC．设为钙化对照组。取第3代成骨细胞,1：1的比例和第3代BMSC共同培养．设为实验组。碱性磷酸酶（ALP）染色及钙结节染色鉴定诱导结果．ALP定量测定观察共同培养中成骨细胞对BMSC诱导影响。总蛋白定量测定观测诱导成骨细胞的分化活性．结果成骨细胞与BMSC共同培养24h后．在倒置光学显微镜下可见两种细胞形态混杂生长．共同培养5d后．细胞形态趋于一致,多呈长梭形。诱导培养5d后．实验组与钙化对照组ALP染色均为阳性。诱导培养21d．两组钙结节茜素红染色均呈阳性．而BMSC空白对照组并未见钙结节形成。ALP定量测定,实验组于3、5、7、9d均低于钙化对照组,且差异均具有统计学意义。实验组与空白对照组ALP定量测定,在4个时间段差异也均具有统计学意义。总蛋白定量测定显示实验组于第3天．A值高于钙化对照组,差异具有显著统计学意义（P〈0．01）,而第5天、第7天、第9天时却低于钙化对照组．差异具有显著统计学意义（P〈0．01）。实验组于各时间段均高于空白对照组．差异亦具有统计学意义。结论成骨细胞与BMSC共同培养应用于BMSC的成骨诱导．从诱导效率和诱导后成骨细胞的分化活性方面．都能证实该共同培养方法的有效性。但与钙化诱导方法相比．共同培养的诱导效果差于钙化诱导方法。     

生物陶瓷及其BMP和TGF复合物修复节段性骨缺损及成骨效应的研究

目的 制备生物活性陶瓷细胞外基质复合材料,并通过动物体内骨植入研究,探讨人工骨材料对骨缺损的修复作用及相互作用机理,为骨替代材料临床应用提供依据.方法 合成TCP、CHA、HA,并将其作为BMP的载体,制备成TCP/BMP、CHA/BMP复合材料,植入兔桡骨10 mm骨缺损,同时加入TGF-β1,同时以单纯的TCP、CHA、HA材料组做对照.通过X线摄片及生物力学测定,扫描电镜及组织学染色分析等手段,观察新骨形成及材料的降解规律.结果 术后动物均无不良反应.复合材料组植入2周时,骨断端部位可见软骨细胞;4周时可见新生软骨及骨组织,并向板层骨转化;8周时材料界面可见板层骨形成,TCP、CHA材料明显降解吸收,骨形成量明显增加;16周时材料界面新生骨趋向成熟,CHA材料降解区域由大量板层骨、骨髓组织填充;24周时新骨形成进一步增加,骨组织接近正常,但HA降解不明显,复合材料组新骨形成量明显高于相应的单纯材料.骨组织标本放射学及扫描电镜检测结果与组织观察结果基本一致.16周生物力学测定最大负载、弯曲及张力指标接近正常,与相应的单纯材料相比差异有显著性意义,说明细胞外基质的加入不仅有效地促进了新骨的形成,同时也加速了新骨的钙化.结论 三种生物陶瓷是细胞外基质的理想载体,生物陶瓷基质复合材料对骨缺损有较强的修复能力,其中可降解生物陶瓷将是一类较为理想人工骨替代材料.     

大鼠BMSCs成骨诱导及复合支架材料构建组织工程骨组织的研究*

目的利用诱导成骨分化的骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)复合生物支架材料构建组织工程骨组织。方法采用密度梯度离心法获取大鼠骨髓间充质干细胞,原代培养扩增后,条件培养基诱导成骨分化作为实验组,并设非条件培养基培养为对照组。诱导培养后,通过碱性磷酸酶、钙结节染色;I型胶原、骨钙素检测鉴定成骨性。将诱导的BMSCs利用滴加法种入自制组织工程生物支架复合培养,采取扫描电镜、HE切片染色观察培养8天时细胞在支架内部的生长情况。结果密度梯度离心法获取培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形或三角形贴壁生长,以梭形为主;经成骨诱导剂诱导后细胞呈多角形贴壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性、茜素红染色出现阳性的钙化结节;Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组明显增加(<0.05);ELISA法检测骨钙素结果较对照组明显升高(<0.01)。HE切片染色可见支架内部有细胞长入,细胞呈圆形或椭圆形。扫描电镜可见支架内部有大量细胞长入,细胞粘附、生长良好,呈现完全伸展状态,细胞-支架-细胞之间有基质连接。结论本实验获取的原代细胞为骨髓间充质干细胞,诱导剂诱导后成功分化为成骨细胞。采用经诱导成骨后的细胞作为组织工程骨构建的种子细胞,与三维支架材料复合后共培养,使构建的组织复合物更接近骨组织,为临床大段骨缺损的修复增加可能性。