Akt在Islet-1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中的作用

目的研究Akt在Islet-1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程的作用以及机制。方法构建过表达Islet-1细胞模型;流式细胞计量术检测转染效率;CCK-8检测细胞增殖;Western blot检测Islet-1、c Tn T和p-Akt/T-Akt蛋白表达;RT-q PCR检测心肌早期特异转录因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c mRNA表达。结果随着MK-2206(Akt抑制剂)浓度的增加,细胞增殖抑制率升高(P<0.05),对Akt活性的最佳抑制浓度为8 nmol/L;随着Islet-1诱导分化时间的延长,感染细胞的p-Akt/T-Akt蛋白表达降低(P<0.05),心肌特异转录因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c基因的表达升高(P<0.05);而经MK-2206处理的感染细胞,GATA4、Nkx2.5和Mef2c的复制在第1周时出现明显升高后又逐渐降低(P<0.05)。结论 Akt在Islet-1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中于不同分化阶段发挥着不同的调节作用。     

Islet-1 specifically assists the process of C3H10TI/2 cell differentiating into cardiomyocyte-like cells in the histone acetylation regulatory network

目的 筛选并分析转染Islet-1慢病毒载体的C3H10T1/2细胞转化为心肌样细胞过程中与Islet-1相互作用的组蛋白乙酰化酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs),明确Islet-1在C3H10T1/2细胞分化为心肌样细胞乙酰化调控网络中的关键枢纽作用.方法 培养转染Islet-1慢病毒载体的C3H10T1/2细胞,观察细胞形态.免疫荧光和免疫印迹检测Islet-1的表达部位和最高表达时间点.免疫共沉淀与Islet-1结合的蛋白.免疫印迹验证Islet-1相互作用的HATs和HDACs.结果 诱导组细胞形态出现心肌样细胞改变.各组Islet-1主要在胞质表达.诱导组Islet-1表达量在诱导后3周最高(0.782 ±0.015).诱导组Islet-1表达量显著高于空白对照组和C3H10组(分别为0.819±0.026,0.127±0.006和0.126 ±0.001)(P＜0.05),免疫共沉淀技术可行.与Islet-1相互作用的HATs和HDACs有GCN5、P300/CBP和HDAC4.结论 Islet-1与GCN5、P300/CBP和HDAC4相互作用特异性辅助C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化.     

Islet-1 在乙酰化调控网络中特异性辅助C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化

 目的 筛选并分析转染Islet-1慢病毒载体的C3H10T1/2细胞转化为心肌样细胞过程中与Islet-1 相互作用的组蛋白乙酰化酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）,明确Islet-1在C3H10T1/2细胞分化为心肌样细胞乙酰化调控网络中的关键枢纽作用。方法 培养转染Islet-1慢病毒载体的C3H10T1/2细胞,观察细胞形态。免疫荧光和免疫印迹检测Islet-1的表达部位和最高表达时间点。免疫共沉淀沉淀与Islet-1结合的蛋白。免疫印迹验证Islet-1 相互作用的HATs和HDACs。结果 诱导组细胞形态出现心肌样细胞改变。各组Islet-1主要在胞浆表达。诱导组Islet-1表达量在诱导后3周最高（0.782±0.015）。诱导组Islet-1表达量显著高于空白对照组和C3H10组（分别为0.819±0.026,0.127±0.006和0.126±0.001）（P<0.05）,免疫共沉淀技术可行。与Islet-1相互作用的HATs和HDACs有GCN5、P300/CBP和HDAC4。结论 Islet-1 与GCN5、P300/CBP和HDAC4相互作用特异性辅助C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化。     

组蛋白乙酰化修饰失衡在苯肾上腺素诱导小鼠心肌肥厚中的调控作用

目的:探讨苯肾上腺素诱导小鼠心肌肥厚的组蛋白乙酰化调控机制,为防治肥厚性心肌病提供新的思路。方法:选取健康C57BL/6小鼠,苯肾上腺素皮下注射建立小鼠心肌肥厚模型,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)和染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation,ChIP)分别检测心脏核转录因子GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4,GATA4)mRNA表达水平及其启动子区组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化(H3K27ac)水平,Western blot检测小鼠心肌组织组蛋白H3K27ac、心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)及α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)的表达,HE染色及超声心动图观察小鼠心肌肥厚。结果:Western blot及ChIP-qPCR表明小鼠心肌组织组蛋白H3K27ac水平及GATA4启动子区组蛋白H3K27ac水平在苯肾上腺素组显著高于生理盐水对照组(P0.05),GATA4及ANP的表达水平在苯肾上腺素组也显著高于生理盐水对照组(P0.05);而组蛋白乙酰化酶抑制剂漆树酸能够降低苯肾上腺素诱导的组蛋白H3K27的高乙酰化,且GATA4mRNA及ANP蛋白的表达水平在漆树酸处理组也显著降低(P0.05);HE染色及超声心动图显示苯肾上腺素能够降低左室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter,LVESD)和左室舒张末期内径(left ventricular enddiastolic diameter,LVEDD)并增加左室后壁(left ventricular posterior wall,LVPW)厚度,诱导小鼠心肌肥厚,而漆树酸能够提高LVESD和LVEDD并降低LVPW厚度,从而改善小鼠心肌肥厚。结论:组蛋白乙酰化修饰失衡参与了苯肾上腺素诱导的小鼠心肌肥厚,而组蛋白乙酰化酶抑制剂漆树酸能够下调苯肾上腺素诱导的组蛋白高乙酰化进而改善小鼠心肌肥厚。     

β联蛋白参与骨形成蛋白9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化

目的探讨骨形成蛋白9(BMP9)诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化过程β联蛋白(β-catenin)的作用。方法利用重组腺病毒BMP9(Ad-BMP9)诱导C3H10T1/2细胞分化,通过Western blot法检测Ad-BMP9及不同剂量XAV-939处理后β-catenin的激活情况;在完全抑制β-catenin的情况下,Ad-BMP9诱导1周,通过实时定量PCR法检测心肌细胞增强因子2C(MEF2C)、心肌组织特异性转录因子GATA结合蛋白4(GATA4);Ad-BMP9处理3周后,通过Western blot法及免疫荧光技术检测心肌连接子蛋白43(Cx43)、心肌肌钙蛋白T(c Tn T)的表达。结果在感染效率约50%的情况下,BMP9可过度激活β-catenin,使其磷酸化水平增高;在XAV-939抑制β-catenin后,Ad-BMP9诱导的C3H10T1/2细胞表达的c Tn T、GATA4、Cx43和MEF2C均受到抑制。结论β-catenin能被BMP9激活并参与BMP9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化。     

苯中毒病人TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白化学修饰改变

目的:研究拓扑异构酶Ⅱα(TOPOⅡα)启动子调控因子SP1组蛋白化学修饰在苯中毒病人中的改变。方法:25例临床慢性苯中毒患者骨髓单个核细胞为病例组,25例正常人骨髓单个核细胞为对照组,染色质免疫沉淀技术探讨TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白乙酰化和甲基化水平的变化,RT-PCR法测定Sp1 mRNA的表达水平。结果:与对照组相比,临床苯中毒病例TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白H4和H3乙酰化水平下降(P0.01),组蛋白H3K9甲基化水平升高(P0.01),组蛋白H3K4甲基化水平无明显改变。与正常对照组相比,临床苯中毒病例TOPOⅡα启动子调控因子Sp1的mRNA表达水平降低(P0.05)。结论:慢性苯中毒TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修饰水平的改变伴随着mRNA水平的变化。TOPOⅡα启动子调控因子Sp1可能通过组蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修饰改变在苯中毒所致的造血毒性中发挥作用。     

HIV-1感染引起组蛋白乙酰化和增加p21WAF1表达

目的：DNA甲基化和组蛋白乙酰化是基因表达调控的主要形式。人类免疫缺陷病毒（HIV-1）可引起T淋巴细胞DNA甲基化酶上调。本文旨在明确HIV-1对细胞周期依赖刺激酶抑制剂p21^WAF1表达的影响。方法：建立HIV-1感染的Hut78细胞系；以RT-PCR和Westem blotting 分析p21^WAF1表达情况；以亚硫酸氢钠修饰DNA和基因测序，研究p21^WAF1基因启动子甲基化，以Western blot-ting 和染色体免疫测定探究总组蛋白和与p21^WAF1基因启动子相关的组蛋白乙酰化水平。并以GST pull-down和免疫沉淀分析HIV-1导致乙酰化及乙酰化引起p21^WAF1过表达的可能机理。结果：HIV-1感染后，其反式激活蛋白Tat与辅助转录因子P/CAF、hGCN5结合，共同刺激组蛋白H3乙酰化。尽管p21^WAF1启动子部分区域有甲基化发生，但p21^WAF1表达仍上调。这可能与E2A对p21^WAF1的作用有关。结论：HIV-1感染可引起T淋巴细胞p21^WAF1基因的甲基化和乙酰化紊乱，导致p21^WAF1表达增强。     

小鼠神经母细胞瘤N2a细胞脑啡肽酶基因的表达与启动子区甲基化和组蛋白修饰相关

目的研究小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a(N2a)细胞中脑啡肽酶(NEP)基因表达的表观调控机制,探讨DNA甲基化与组蛋白乙酰化之间的相互作用。方法体外培养N2a细胞,以3μmol/L、5μmol/L DNA甲基化酶抑制5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-dc)及(300、500、700)nmol/L组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)分别处理N2a细胞48 h和24 h。采用逆转录PCR(RT-PCR)、Western blot法分别检测NEP的mRNA、蛋白表达;亚硫酸氢盐测序聚合酶链反应(BSP)法检测NEP基因启动子区DNA的甲基化水平;染色质免疫共沉淀(ChIP)法检测NEP基因启动子区组蛋白H3的乙酰化水平。结果 5-Aza-dc和TSA均能剂量依赖地提高NEP基因的表达(P0.01);5-Aza-dc可诱导NEP基因去甲基化(P0.01);TSA可增高NEP组蛋白H3乙酰化水平(P0.05),但不能明显改变NEP基因DNA的甲基化水平(P0.05)。结论在小鼠神经母细胞瘤N2a细胞中NEP基因的表达受DNA甲基化及组蛋白乙酰化的调控,组蛋白乙酰化水平并不影响DNA甲基化状态。     

ERK5和JNK参与BMP9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化

目的研究细胞外信号调节激酶5(ERK5)和c-Jun N端激酶(JNK)在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化中的作用。方法利用重组腺病毒将BMP9基因导入C3H10T1/2细胞,Western blot法检测加入BMP9及不同浓度ERK5特异性抑制剂BIX02189或JNK特异性抑制剂SP600125后ERK5和JNK的激活情况;实时定量PCR(qRT-PCR)检测BMP9诱导1周后心肌特异性基因肌细胞增强因子2C(MEF2C)、GATA结合蛋白4(GATA4)表达;Western blot法检测经BMP9诱导3周后心肌特异性蛋白缝隙连接蛋白43(CX43)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达和免疫荧光技术检测CX43、cTnT在细胞内的表达。结果在转染效率达50%左右的情况下,BMP9可过度激活ERK5和JNK,使其磷酸化水平显著增高(P0.05);BIX02189抑制ERK5激活后,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的心肌分化标志物MEF2C、GATA4、CX43、cTnT均受到显著抑制(P0.05),JNK特异性抑制剂SP600125也可抑制MEF2C、GATA4、CX43、cTnT表达,但对MEF2C及GATA4的抑制不如BIX02189显著(P0.05)。结论 ERK5和JNK的过度激活参与了BMP9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌样细胞的分化。     

甲基CpG结合蛋白对基因转录的调控

甲基 Cp G结合蛋白 (Me CPs)有 5个成员 (Me CP1、Me CP2、MBD1、MBD3和 MBD4 ) ,通过特异结合于甲基化 Cp G位点 (m Cp G)而抑制基因表达。目前研究较清楚的是 Me CP1、Me CP2和 MBD1。Me CP1可与至少 1 2个对称的 m Cp G结合 ,Me CP2和 MBD1均与单一的 m Cp G位点结合。Me CP1和 Me CP2可干扰非甲基化敏感的转录因子 Sp1与启动子区的结合 ,也可与组蛋白脱乙酰酶 (HDAC)形成复合物 ,影响局部组蛋白乙酰化状态。HDAC抑制剂 TSA可解除 MBD1对报告基因的抑制 ,提示 MBD1对基因的抑制与脱乙酰化有关     

HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1, -DPA1 and -DPB1 genes in Japanese multiple sclerosis patients

Japanese MS patients and controls were examined for the distribution of HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1, -DPA1 and -DPB1 alleles using in vitro amplification of genomic DNA and probing with sequence-specific oligonucleotides. No significant difference in frequency of the examined alleles was observed among the two groups. This is in contrast to Norwegian MS patients, where an association to a combination of certain DQA1 and DQB1 alleles has previously been demonstrated.     

先兆子痫患者HLA-DQA1、-DQB、-DPA1基因多态性

目的：探讨人类白细胞抗原HLA-DQA1、-DQB1、-DPA1基因多态性与先兆子痫发病的关系。方法：采用序列特异性引物技术（PCR-SSP） 对46例先兆子痫患者和105例正常孕妇及其新生儿进行HLA-DQ-DPA1等位基因分型。结果：所有标本共检出11种HLA-DQA1基因表型、16种HLA-DQB1基因表型、6种HLA-DPA1基因表型。先兆子痫患者HLA-DQB1＊0301基因频率高于正常孕妇，差异有显著性（Pc=0．032，RR=2．43，AR=0．30），其余各基因表型频率两组比较差异均无显著性。结论：HLA-DQB1＊0301基因可能是一种先兆子痫发病的易感基因。     

先兆子痫患者HLA-DQA1、-DQB1、-DPA1基因多态性

目的:探讨人类白细胞抗原HLA-DQ-A1、DQB1、DPA1基因多态性与先兆子痫发病的关系。方法:采用序列特异性引物技术(PCRSSP)对46例先兆子痫患者和105例正常孕妇及其新生儿进行HLA-DQ-DPA1等位基因分型。结果:所有标本共检出11种HLADQA1基因表型、16种HLADQB1基因表型、6种HLADPA1基因表型。先兆子痫患者HLA-DQ-B10301基因频率高于正常孕妇,差异有显著性(Pc=0.032,RR=2.43,AR=0.30),其余各基因表型频率两组比较差异均无显著性。结论:HLADQB10301基因可能是一种先兆子痫发病的易感基因。     

Comprehensive sequence analysis of HLA-DQA1 and -DQB1 alleles and characterization of DRB1-QAP-DQA1-DQB1 haplotypes

It is well known that both chain and β chain of HLA-DQ are highly polymorphic. However the polymorphisms outside the hypervariable region were not fully examined so far. To further clarify the polymorphisms in DQ genes, we determined the nucleotide sequences of full length cDNA, spanning from the leader sequence to the stop codon, from 15 DQA1 alleles and 15 DQB1 alleles. We identified several new DQ alleles which had identical exon 2 sequence and were different in other exons. On the basis of the sequence analyses, a comprehensive PCR-based oligotyping system for DQA1 gene was established. We then characterized DRB1-QAP(DQA1 promoter)-DQA1-DQB1 haplotypes of B-lymphoblastoid cell lines homozygous for HLA and healthy unrelated Japanese and Norwegian populations. It was revealed that DQA1 alleles, which were identical in exon 2 but different in other exons, showed close linkage disequilibrium with diferent characteristic DRB1, QAP and DQB1 alleles. These results suggest that DR-DQ haplotypes have been generated in the early stage of molecular evolution.     

韩国人CYP450 1A1、CYP450 2E1和GSTM1、GSTT1、GSTP1基因座遗传多态性分析

目的 调查代谢相关的CYP4501A1、CYP4502E1和GSTM1、GSIT1、GSTP1基因座在韩国人群中的遗传多态性分布状况。方法 采用多重聚合酶链式反应、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术，分析300名韩国健康大学生的CYP1A1基因3′端限制性内切酶Msp Ⅰ位点、CYP2E1基因5′端转录调节区Pst Ⅰ位点和GSTM1、GSTT1缺失与存在、GSTP1基因第5外显子BsmA Ⅰ位点的基因型，计算基因型和基因频率。结果 CYP1A1基因型频率为ml／ml型39．7％、ml／m2型49．7％、m2／m2型10．7％，基因频率为ml 0．645、m2 0．355。CYP2E1基因型频率为cl／cl型66．7％、cl／c2型30％、c2／c2型3．3％，基因频率为C1 0．818、C2 0．182。GSTM1基因缺失型频率为53．3％。GSTT1基因缺失型频率为54．7％。GSTP1基因型频率为Ile／Ile型62％、Ile／Val型34．3％、VaL／Val型3．7％，基因频率为Ile 0．792、Val 0．208。基因分布符合Hardy-Weirtberg平衡定律。结论 韩国人CYP1A1、CYP2E1、GSTM1、GSTT1基因分布与我国人群较为相近，半数以上人缺乏GSTM1和GSTT1基因，纯合缺失型频率超过印度人的3倍。