人巨细胞病毒UL142基因在临床低传代分离株中的多态性

目的研究人巨细胞病毒(HCMV)UL142基因在低传代分离株中的多态性,探讨其多态性与HCMV先天性感染不同致病性之间的关系。方法27株经荧光定量PCR方法检测HCMVDNA阳性的低传代分离株进行UL142全序列PCR扩增,阳性13株PCR产物进行UL142基因测序及结果分析。结果27株分离株UL142PCR扩增,13株阳性,阳性率48.2%,以Toledo株为参考株序列比较表明,13株UL142可读框长度均与Toledo株相同,为921bp,编码307个氨基酸的蛋白。DNA序列变异均为核苷酸替换,不同临床分离株UL142基因与Toledo株进行同源性比较,结果在核苷酸水平为94.4%~95.9%,氨基酸水平为89.9%~99.6%。二级结构预测分为三种构象。大多数HCMVUL142蛋白重要功能基团位点在所有分离株中均高度保守,仅四个位点在一些分离株中存在缺失或新增。系统进化树分析除Toledo株外,13株核苷酸及氨基酸序列可分为3个基因组。结论13株临床低传代分离株HCMVUL142基因DNA及其编码产物的氨基酸序列比较保守,但仍存在一定多态性。未发现不同临床分离株UL142基因多态性与HCMV先天性感染不同疾病表现的关系。     

人巨细胞病毒UL140基因在临床低传代分离株中的多态性研究

目的　研究人巨细胞病毒HCMV UL14 0基因在临床低传代分离株中的多态性及其与致病性的关系。方法　对 4 0株HCMV临床低传代分离株进行UL14 0基因全序列的PCR扩增 ,对 12株进行了测序及结果分析。结果　 4 0株HCMV UL14 0基因PCR扩增均阳性。测序的 12株HCMV UL14 0开放阅读框架 (ORF)均在Toledo株UL14 0 ORF的第 174位核苷酸处 ,插入一个胞嘧啶核苷酸C ,造成移码突变。与Toledo株相比 ,临床分离株新增了ScAMP磷酸化SPS和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化CKP两种重要功能位点 ,且其所位于的氨基酸位点可能是UL14 0蛋白的蛋白质作用位点。结论　临床分离株UL14 0基因的ORF较Toledo株多出 2 31个核苷酸 ,故两者的核苷酸及其编码产物氨基酸序列明显不同。临床分离株存在SPS及CKP两种新的重要功能位点 ,可能在HCMV UL14 0编码蛋白的生物学功能方面起重要作用。     

人巨细胞病毒UL140基因在临床低传代分离株中的多态性研究

目的 研究人巨细胞病毒HCMV-UL140基因在临床低传代分离株中的多态性及其与：病性的关系。方法 对40株HCMV临床低传代分离株进行UL140基因全序列的PCR扩增，对121进行了测序及结果分析。结果 40株HCMV-UL140基因PCR扩增均阳性。测序的12株HCMV-UL140开放阅读框架(ORF)均在Toledo株ULl40-ORF的第174位核苷酸处，插入一个胞嘧啶核苷酸．造成移码突变。与Toledo株相比，临床分离株新增了SCAMP磷酸化SPS和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化KP两种重要功能位点，且其所位于的氨基酸位点可能是UL140蛋白的蛋白质作用位点。结论 临床分离株UL140基因的ORF较Toledo株多出231个核苷酸，故两者的核苷酸及其编码产物氨基酸序列明显不同。临床分离株存在SPS及CKP两种新的重要功能位点，可能在HCMV-UL140编码蛋白的生物学功能方面起重要作用。     

引起不同临床表现的巨细胞病毒UL144基因多态性的研究

目的研究不同临床背景的人巨细胞病毒（HCMV）临床株中UL144基因的多态性，探讨其多态性与HCMV感染临床表现之间的关系。方法采用巢式PCR法，对具有不同临床表现的122份HCMV感染患儿的尿标本和53份先天性巨结肠患儿痉挛段肠组织标本的临床株进行UL144开放阅读框的扩增，扩增阳性的临床株进行UL144开放阅读框核苷酸测序。结果50份尿标本和23份肠组织标本临床株完成DNA测序。种系进化树分析结果显示HCMVUL144基因分为3组4个基因型，UL144G1a（52％）为主要基因型。有症状与无症状HCMV感染临床株的基因型分布比较，差异无显著性。引起神经系统及肝胆系统受累的临床株与无症状感染临床株基因型分布比较，差异无显著性。与美国及日本的临床株比较，UL144基因型分布差异具有显著性。结论HCMVUL144基因具有高度多态性；UL144G1a为先天性或围生期HCMV感染的主要基因型；UL144基因分布与地理位置有关；UL144基因分型与HCMV感染的临床表现及组织嗜性无关。     

人巨细胞病毒UL 146基因α趋化因子在巨细胞病毒感染中的作用

人巨细胞病毒（HCMV）在人群中感染非常普遍，对于免疫功能正常的人来说通常是不显性感染或潜伏感染，但胎儿及免疫缺陷患者感染可导致极高的病死率。目前，关于HCMV先天感染的致病机制还不十分清楚。HCMV UL146基因编码α趋化因子同源物，其核苷酸及氨基酸序列的变异和蛋白趋化因子功能区的高度保守提示这个功能区对于HCMV具有重要的生物学意义。     

人巨细胞病毒UL146基因α趋化因子在巨细胞病毒感染中的作用

人巨细胞病毒(HCMV)在人群中感染非常普遍,对于免疫功能正常的人来说通常是不显性感染或潜伏感染,但胎儿及免疫缺陷患者感染可导致极高的病死率.目前,关于HCMV先天感染的致病机制还不十分清楚.HCMV UL146基因编码α趋化因子同源物,其核苷酸及氨基酸序列的变异和蛋白趋化因子功能区的高度保守提示这个功能区对于HCMV具有重要的生物学意义.     

先天性人巨细胞病毒感染与UL73基因多态性相关性研究

目的探讨编码包膜糖蛋白的UL73基因多态性与先天性人巨细胞病毒(HCMV)症状性感染的相关性。方法采集2010年11月至2012年2月及2013年1月至2014年6月在本院出生的新生儿尿液进行HCMV感染筛查,选择确诊为先天性HCMV感染的患儿,于1、3、6、12个月进行体检及临床检查,包括头颅超声、脑干听性诱发电位筛查、肝功能、血常规检查等。根据1年内有无临床症状将患儿分为无症状组和有症状组。对其尿液样本进行HCMV-DNA提取、UL73基因测序及gN分型。结果共68例确诊为HCMV感染的新生儿随诊到12个月,其中无症状41例,有症状27例。对68份尿液样本进行UL73全序列PCR扩增,获得57株阳性株,序列测定gN1、gN2、gN3、gN4型分别为9、5、11、32例。gN1、gN2、gN3、gN4各型症状性感染发生率分别为22.2%、40.0%、18.2%和62.5%,差异有统计学意义(P=0.028),gN4型高于gN1和gN3型(P<0.05)。结论 gN1和gN3型可能代表不致病或最温和毒性的gN蛋白类型,gN2及gN4型有症状比例及严重程度高,gN4型是最主要且严重的毒性类型,建议对gN2及gN4型患儿加强管理和随访。     

筛选与分析与人巨细胞病毒UL133编码蛋白相互作用的蛋白

目的 应用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库中与人巨细胞病毒(HCMV)UL/b′ UL133编码蛋白相互作用的蛋白,为研究UL/b′编码蛋白的生物学功能,揭示HCMV先天感染的致病机制奠定基础.方法 设计特异性引物,在引物上下游分别引入NdeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶识别位点,采用PCR技术扩增 HCMV临床分离株H株的UL133基因片段,将其扩增产物与载体pGBKT7 同时使用NdeⅠ和BamHⅠ进行双酶切,纯化后,将UL133片段插入到pGBKT7载体上,构建诱饵质粒 pGBKT7-UL133,并测序分析.利用醋酸锂小量酵母转化方法,将测序正确的诱饵质粒pGBKT7-UL133转化入AH109酵母感受态细胞中,然后将转化的菌液涂布在色氨酸缺陷型培养基(-Trp)上,筛选阳性菌落.再将人胎脑cDNA文库质粒转化到含pGBKT7-UL133质粒的AH109菌株中,在四缺培养基(-Ade/-His/-Leu/-Trp)中筛选,在铺有X-Gal的滤纸上进行显色反应,提取显蓝色的阳性酵母筛选质粒,运用电穿孔方法将其转化到TG1的大肠杆菌中,并行PCR鉴定,提取大肠杆菌中的文库质粒,并将其回转到含诱饵质粒pGBKT7-UL133 的酵母菌株中,进行回转验证.对筛选到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 用于酵母双杂交筛选的诱饵质粒pGBKT7-UL133成功构建,含有诱饵质粒的酵母菌株在-Trp上生长.转化有人胎脑cDNA文库和诱饵质粒pGBKT7-UL133的酵母菌AH109,在四缺培养基中观察到有28个酵母菌落生长,通过显色反应、酵母质粒转化及回转酵母细胞筛选得到4个阳性克隆.通过序列比对,发现在这些基因中,其中一个基因编码人类还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)依赖性氧化还原酶1.结论 成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL/b′区UL133编码蛋白相互作用的蛋白-NADPH,提示UL133蛋白可能在增加病毒毒力和传染性,干扰细胞间的信号传导和细胞的生长、分裂、凋亡等方面发挥重要作用.     

人巨细胞病毒UL/b’区基因编码蛋白生物学功能的研究进展

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在人群中感染广泛,不仅是免疫抑制患者的严重致病原,也是引起新生儿先天及围生期感染最常见、危害最大的一种病原体.近年来,针对区别于实验室株的一个特殊区域UL/b’区基因编码蛋白生物学功能的研究是国内外HCMV研究领域的一个热点.目前已经发现该区域基因产物在HCMV的毒力、传播、组织细胞嗜性及免疫逃避等方面发挥重要作用,其中的UL133-UL138位点可能促进HCMV潜伏感染的建立和维持,而pUL138是目前病毒基因组中鉴定出的惟一明确与HCMV潜伏感染相关的决定因子.因此,HCMV UL/b’区基因产物在HCMV感染过程中发挥重要作用.该文就HCMV UL/b’区部分基因,尤其是与HCMV潜伏感染相关的UL138基因结构及其编码蛋白生物学功能进行综述,为阐明HCMV感染致病机制奠定基础.     

16SrDNA PCR检测方法的研究

为探索快速可靠的诊断新生儿败血症病原菌的新方法。通过自行设计合成细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物，对２０种标准菌株，１２种２７株临床分离细菌，人基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行ＰＣＲ扩增，结果显示：细菌获得３７ｂｐ扩增产物，而人基因组ＤＮＡ，巨细胞病毒均为阴性。     

人巨细胞病毒UL/b'区基因多态性

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）在人群中普遍感染,在新生儿中,HCMV先天感染可引起黄疸性肝炎、先天性巨结肠、小头畸形等各种消化系统和神经系统畸形。导致HCMV不同致病性的发病机制还不十分清楚,一方面与宿主免疫功能,即有效的细胞及体液免疫应答有关;另一方面与病毒的数量、入侵部位及病毒自身的基因结构相关,尤其是与病毒毒力、组织嗜性和病毒逃避机体免疫攻击能力密切相关的基因关系密切。对于HCMV基因多态性的研究可以在基因层面揭示不同来源临床株的结构特点,对全面认识HCMV基因组和进一步深入研究基因组功能具有重要意义,成为HCMV研究的热点领域之一。近年来,国际多个研究小组对HCMV临床株广泛存在而旧有实验室株缺失的UL/b’区基因进行了较系统的研究,取得了较快的进展。此专题对这方面的研究进展进行概要介绍,以供同行了解与深入研究。     

套式聚合酶链反应及限制酶分析检测新生儿肝炎巨细胞病毒感染

在人巨细胞病毒（HCMV）AD169株直接早期蛋白EcoRIJDNA片段内，自行设计二对引物，建立套式PCR检测HCMVDNA。经实验证明有高度的特异性与敏感性，对其它疙疹类病毒和正常人基因组DNA无交叉反应。一次性PCR检测HCMVAD169株基因组的最小检出量为100fg，而套式PCR可达10fg，经PStI酶切后，得到的片段与设计相符。对23例新生儿肝炎临床标本进行病毒分离，一次性PCR，套式PCR检测，结果表明套式PCR能进一步提高一次性PCR的特异性与敏感性，适用于新生儿肝炎HCMV感染的临测。     

咽拭子在新生儿先天性人巨细胞病毒感染筛查中的应用

目的 探讨咽拭子PCR检测在新生儿先天性人巨细胞病毒（HCMV）活动性感染筛查中的临床应用价值。方法 收集51例新生儿的咽拭子和脐血标本,均进行HCMV gB的巢式PCR检测,其中18例进行脐血pp65抗原检测。结果 巢式PCR法检测咽拭子HCMV gB基因的灵敏度和特异性分别为67%和75%,其阳性预测值和阴性预测值分别为57%和82%。结论 咽拭子HCMV gB的巢式PCR检测,具有无创、快速、特异的优点,有望成为新生儿HCMV先天性活动性感染筛查的最佳检测手段。     

人巨细胞病毒pp65基因疫苗的研制

目的探讨人巨细胞病毒（HCMV）基因疫苗的研制及其预防和治疗HCMV原发和再发感染的效果。方法应用聚合酶链式反应（PCR）扩增HCMVpp65基因全长、巨细胞病毒（CMV）启动子的上下游序列,转化至质粒并载体,测序;合成分泌肽基因,构建自制的含CMV启动子、pp65基因和分泌肽基因的pcDNA5.0转染载体,即HCMVpp65基因疫苗。将该载体疫苗通过脂质转染法转至中国仓鼠卵巢（CHO）细胞,Western点杂交检测CHO细胞上清中pp65蛋白。结果克隆pp65基因全长测序结果与HCMVAD169株上的pp65标准序列比较：一致性为99.99%。构建了含有分泌肽、CMV启动子（含有增强子和内含子）和pp65全长pcDNA5.0的转染载体,即HCMV基因疫苗。转染至CHO细胞,其上清培养提取物Western点杂交阳性。结论含有分泌肽、CMV启动子和pp65cDNA的pcDNA5.0真核载体即粗制的HCMV基因疫苗可成功构建。     

Cytomegalovirus viremia and resistance patterns in immunocompromised children: An 11-year experience

Abstract

We noted a recent increase in number of immunocompromised children with CMV viremia at our institution. The purpose of this study was to determine the frequency of CMV viremia in this population and evaluate factors associated with drug-resistant mutations. A retrospective review of immunocompromised hosts, 0–21?years of age, who had CMV viremia during 2007–2017. CMV viremia was detected using PCR assays. Genetic mutation assays were performed using PCR sequencing of the phosophotransferase UL 97 gene and the polymerase UL54 gene of CMV using Quest Diagnostics (San Juan Capistrano, CA, USA) or ARUP Labs (Salt Lake City, UT, USA). Thirty-one patients were identified, including 10 (32%) during the last 2?years. Of the 31 patients, 18 had hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), 5 had primary immunodeficiency, 4 had malignancies, 3 had heart transplantation and 1 had new Human Immunodeficiency virus (HIV) infection. Antiviral resistance testing was performed on isolates from seven patients: five with persistent viremia (>1?mo), and two prior to starting antiviral therapy. Resistance was identified in three patients’ isolates: two with common variable immunodeficiency (CVID) and one with recurrent Hodgkin’s lymphoma who had undergone autologous HSCT. The two patients with CVID had chronic diarrhea and malabsorption and had received prolonged oral valganciclovir courses prior to emergence of resistance. The patient with Hodgkin’s lymphoma had received a prolonged IV ganciclovir course. All three tested positive for UL97 mutation and two had both UL97 and UL54 gene mutations. Majority of our patients (21/31) with CMV viremia were transplant recipients and ganciclovir resistance developed in 10%. Two had intestinal malabsorption. Treatment with oral valganciclovir should be avoided in patients with poor gut absorption as that may increase the risk of resistance.     

套式聚合酶链反应加限制酶分析检测母婴巨细胞病毒感染

为评价套式聚合酶链反应（套式ＰＣＲ）加限制酶分析在孕妇巨细胞病毒感染及其母婴宫内传播检测中的应用，采用套式ＰＣＲ加限制酶分析，病毒分离、电镜观察和特异性抗体测定，对各孕期孕妇外周血，脐血及死胎组织进行人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）检测。结果：３６７名孕妇ＨＣＭＶ阳性检出率为５．５％，其中，套式ＰＣＲ检出率（４．９％）高于病毒分离（３．０％，Ｐ＜０．０５）。６份ＨＣＭＶＤＮＡ阳性母血中，３份配对脐血ＨＣＭＶＤＮＡ也阳性，母－脐传播率为３／６。３对被证实为母－婴宫内传播ＨＣＭＶ的标本中，２对套式ＰＣＲ，病毒分离及特异性ＩｇＭ、ＩｇＡ均阳性，１对套式ＰＣＲ、病毒分离、特异性ＩｇＡ阳性，ＩｇＭ阴性。提示：套式ＰＣＲ能提高诊断ＨＣＭＶ的特异性与敏感性，对孕妇及胎儿／新生儿ＨＣＭＶ感染的研究有重要意义。