胶原或明胶吸附施万细胞移植促进全横断脊髓损伤修复的研究

目的 探讨胶原或明胶吸附施万细胞移植对全横断脊髓结构和功能修复的影响。方法 将胶原或明胶吸附施万细胞移植到成年大鼠全横断脊髓的损伤处，术后3个月用爬网格方式测试动物后肢自主运动功能恢复情况；用荧光金逆行标记法观察大脑感觉运动区和脑干红核的神经元神经纤维再生；用免疫组织化学法检测脊髓CGRP和5-HT能神经纤维再生。结果 移植施万细胞的大鼠后肢自主运动功能有显著的恢复。大脑感觉运动区和脑干红核均有被荧光金标记的神经元胞体，提示两个区域的神经元轴突能在脊髓再生并穿越损伤区到达尾侧脊髓。脊髓损伤处有CGRP和5-HT阳性神经纤维，以及损伤处尾侧有5-HT阳性神经纤维。对照组大鼠以上结果均为阴性。结论 施万细胞移植可促进大鼠全横断脊髓结构和功能的恢复。胶原或明胶可作为移植细胞的网架用于细胞治疗。     

施万细胞对植入大鼠脊髓损伤区内的神经干细胞存活和分化的影响

目的 探讨施万细胞对植入损伤脊髓内的神经干细胞的存活及其分化的影响。方法 分离和克隆新生大鼠海马组织的神经干细胞；同时获取坐骨神经和臂丛神经，从中分离和纯化施万细胞。在移植前先用核荧光(Hoechst33342)标记神经干细胞。实验组为神经干细胞和施万细胞联合移植入大鼠脊髓半横断处，对照组为单独神经干细胞移植。应用免疫组织化学和酶组织化学技术，在移植后7d、14d、21d和30d分别观察神经干细胞的存活和分化情况。结果 实验组的神经干细胞比对照组迁移的更远，分化为神经丝蛋白染色阳性神经元样细胞的数量比对照组的多，并且有较长的突起长出。在30d实验组中，移植的神经干细胞有部分呈乙酰胆碱酯酶(AchE)染色阳性。而在对照组中，移植区内仅有少数呈AchE染色弱阳性的神经干细胞。结论 在脊髓损伤处，施万细胞可促进移植的神经干细胞存活、迁移和向神经元样细胞分化；有些神经元样细胞能长出较长的突起，有些呈现乙酰胆碱酯酶活性。     

督脉电针与神经干细胞移植联合应用促进脊髓全横断大鼠受损伤的神经元存活及其轴突再生

目的探讨督脉电针与神经干细胞移植联合应用对脊髓全横断大鼠受损伤的神经元存活及其轴突再生的影响。方法将对照组、神经干细胞移植组、督脉电针组和督脉电针＋神经干细胞移植组的成年大鼠胸10脊髓段做全横断损伤；其中神经干细胞移植组和电针神经干细胞组在损伤处移植神经干细胞。电针组和电针神经干细胞移植组在术后开始接受督脉电针治疗。所有动物存活67d。结果1．电针神经干细胞移植组脊髓损伤处的去甲肾上腺素能、5-羟色胺受体、降钙素基因相关肽能和生长相关蛋白-43阳性染色的4种神经纤维均明显多于其他几组。2．电镜下可观察到脊髓横断处有再生的神经纤维穿越，在电针神经干细胞移植组尤为明显。3．大脑体感运动区皮质和中脑红核受损伤的神经元存活数量也多于其他几组，一些神经元的再生神经纤维可能穿越横断处，进入尾端脊髓组织。结论督脉电针与神经干细胞移植联合应用能促进脊髓全横断大鼠受损伤的神经元存活及其轴突再生。     

依达拉奉联合神经干细胞移植修复大鼠脊髓损伤

背景：依达拉奉是一种自由基清除药,可以减轻受损神经组织水肿和改善脊髓损伤区微环境。 目的：观察依达拉奉联合神经干细胞移植对大鼠脊髓全横断损伤的修复效果。 方法：成年雌性SD大鼠80只,建立胸9脊髓全横断损伤模型,随机分为4组：对照组不做处理;依达拉奉组脊髓损伤后6 h经尾静脉注射依达拉奉;神经干细胞移植组脊髓损伤后6 h脊髓损伤区域注入神经干细胞悬液;依达拉奉+细胞移植组脊髓损伤后6 h神经干细胞移植的同时尾静脉注射依达拉奉。 结果与结论：造模后8周可观察到PKH-26标记的神经干细胞在体内存活并在脊髓内迁移;细胞移植组和依达拉奉联+细胞移植组可见少量连续性神经纤维通过损伤区。荧光金逆行脊髓追踪显示神经干细胞移植组和依达拉奉+细胞移植组可见被荧光金标记的神经锥体细胞穿越损伤区。PKH-26标记的阳性细胞数及荧光金阳性神经纤维数：依达拉奉+细胞移植组最多,依达拉奉组、神经干细胞移植组次之,对照组最少,各组之间差异有显著性意义(P < 0.05);后肢功能运动BBB评分依次为依达拉奉+细胞移植组>神经干细胞移植组>依达拉奉组>对照组。提示依达拉奉能促进神经干细胞在损伤区的存活并向神经细胞分化,依达拉奉联合神经干细胞移植有促进细胞移植修复大鼠脊髓损伤的效果。     

体外诱导的皮肤源性神经干细胞在大鼠受损伤脊髓内的存活、分化和迁移

目的探讨经体外诱导的皮肤源性神经干细胞能否在大鼠脊髓半横断损伤处存活、迁移和分化.方法应用转染绿色荧光蛋白基因新生大鼠的皮肤在体外经分离细胞、培养、诱导增殖以及用免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞等过程,将诱导产生的皮肤源性神经干细胞移植入大鼠脊髓半横断损伤处,30 d和60 d后用免疫细胞化学染色法观察移植细胞的存活、迁移和分化.结果皮肤分离细胞在培养10 d时,呈悬浮生长的细胞已增殖成若干细胞球,并呈nestin免疫细胞化学阳性染色,表明是神经干细胞球.在体内可观察到脊髓损伤处有许多带有绿色荧光的移植皮肤源性神经干细胞,有些还迁移到较远的宿主脊髓组织内.存活的移植细胞有些呈现nestin阳性、MAP2阳性及GFAP阳性.结论经体外诱导的皮肤源性神经干细胞能够在受损伤的大鼠脊髓内存活、迁移并分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞.     

伸长细胞移植促进成年大鼠脊髓再生修复的研究

目的探讨采用体外培养的伸长细胞(Tanycytes,TAs)移植治疗大鼠脊髓损伤的可行性。方法将体外培养的TAs标记后,移植入全横断脊髓损伤大鼠。实验大鼠共分5组:A.单纯TAs细胞移植组,B.TAs细胞加壳聚糖载体移植组,C.壳聚糖载体移植组,D.单纯损伤组,E.假手术组。移植后通过BBB评分法评价大鼠的运动功能恢复情况,并且通过光学显微镜观察移植细胞的存活、迁移和损伤脊髓的修复情况,以及观察大鼠脑区神经元存活状况。结果与对照组相比,TAs移植促进了脊髓损伤局部结构的修复和大鼠下肢运动功能的恢复;移植组可在脑皮质观察到HRP逆行标记神经元;对照组皮质感觉运动区和红核神经元密度小于移植组,差异有显著意义。结论TAs移植可促进损伤脊髓轴突的再生、促进大鼠后肢运动功能的改善。     

督脉电针与神经干细胞移植对脊髓全横断大鼠后肢功能恢复的影响

目的探讨督脉电针与神经干细胞移植联合应用对脊髓全横断大鼠后肢运动功能恢复的影响。方法将对照组、神经干细胞移植组(神经干细胞组)、督脉电针组(电针组)和督脉电针 神经干细胞移植组(电针神经干细胞组)大鼠胸10脊髓段做全横断损伤；其中神经干细胞组和电针神经干细胞组在损伤处移植神经干细胞。电针组和电针神经干细胞组在术后开始接受电针治疗。结果1．对照组大鼠后肢完全瘫痪。其余各组均能观察到大鼠后肢的运动。电针神经干细胞组BBB分数高于其他组。2．对照组大鼠后肢不能爬行网格。神经干细胞组2只、电针组3只和电针神经干细胞组5只大鼠能通过爬行网格攀上平台。3．脊髓损伤后，对照组的皮质体感诱发电位或皮质运动诱发电位的潜伏期增长和峰峰值变小。经电针治疗后，电针神经干细胞组的潜伏期和峰峰值均较电针组和神经干细胞组有明显的改善。4．对照组的后肢肌肉发生明显的萎缩，而电针组和电针神经干细胞组的后肢肌肉萎缩较轻。结论督脉电针与神经干细胞移植联合应用能促进脊髓全横断大鼠后肢运动功能的恢复。     

依赖性膜磷脂结合蛋白AnnexinⅡ对大鼠脊髓横断损伤的修复作用

目的在体内实验中观察钙依赖性膜磷脂结合蛋白AnnexinⅡ对大鼠脊髓损伤以及神经干细胞移植的作用。方法在成年大鼠全横断脊髓损伤的局部微量注射AnnexinⅡ，观察其对损伤的脊髓神经细胞存活、神经纤维生长和损伤后的功能恢复的影响，以及对联合移植的胚胎神经干细胞移植后存活和迁移的影响。结果在动物脊髓横断损伤6周，神经干细胞移植4周后，损伤局部微量注射AnnexinⅡ＋NSC移植组实验动物的运动评分结果较空白对照组和单独进行NSC移植组都有明显增高（JP〈0．01），脊髓损伤处的空洞面积也较上述两组显著减小（P〈0．01）；注射AnnexinⅡ＋NSC组损伤节段以上荧光金标记神经细胞数目较空白对照组明显增多（P〈0．01）。结论AnnexinⅡ蛋白可能具有减小局部损伤空洞面积，保护损伤的神经元和神经纤维并防止其走向变性和死亡的效应，并对神经干细胞的移植效应有一定的促进和协同作用，使脊髓损伤大鼠的功能得到一定程度的恢复。     

胚胎脊髓移植对大鼠脊髓全横断后功能修复及NOS表达的影响

目的　探讨胚胎脊髓移植对脊髓全横断大鼠脊髓功能修复及NOS表达的影响。方法　在脊髓全横断处移植胚胎脊髓 6 0d后 ,应用NADPH d组织化学方法检侧脊髓内一氧化氮合酶神经元的分布及形态变化 ,并做图像分析。用BBB评分法观察大鼠后肢运动功能的恢复。结果　胚胎大鼠脊髓移植后可以使全横断脊髓前角内NOS表达增加 ,与损伤对照组比较有显著性差异 (P <0 .0 1) ;大鼠后肢的自主运动功能恢复好于损伤对照组。结论　胚胎脊髓移植对成年大鼠损伤脊髓功能恢复有促进作用 ,NO可能参与修复作用。     

神经干细胞移植修复大鼠脊髓半切伤的研究

目的：观察神经干细胞移植修复脊髓半切伤的疗效并探讨移植最佳时机。方法：制备大鼠T13-L1脊髓半切伤模型，取胎龄13、5d胎鼠大脑组织，体外分离、培养、诱导神经干细胞，并采用免疫细胞化学技术分别检测NSC（neural stemcell）特征性标志Nestin（巢蛋白）表达和用血清诱导分化为大量神经元NSE（neuron specific enolas）和神经胶质细胞GFAP（glial fibrillary acidic protein）表达。用明胶海绵吸附BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶）标记好的神经干细胞悬液移植到脊髓半横断处，移植时间选择损伤后立即移植、损伤后第9、14d。观察移植后的大鼠行为的变化，通过CBS（combine behavioral score）评分和爬网格实验评价大鼠的运动功能恢复情况，并进行免疫组化鉴定，光学显微镜观察移植神经干细胞的存活和迁移。结果：在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈Nestin阳性的神经球；用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的神经胶质细胞。与对照组相比，神经干细胞移植组明显修复了损伤结构，改善了下肢的功能，尤其是第9d移植组。结论：神经干细胞移植促进了脊髓损伤后神经结构和功能的恢复，是治疗脊髓半切伤一种有效方案，考虑综合因素移植干细胞的最佳时机应选损伤后9d左右。     

督脉电针对移植在大鼠脊髓全横断损伤处的神经干细胞存活分化和迁移的影响

目的探讨督脉电针对脊髓全横断损伤处移植的神经干细胞存活、分化和迁移的影响。方法将20只成年SD大鼠分为神经干细胞移植14d组（NSCs14d组）、督脉电针＋神经干细胞移植14d组（电针NSCs14d组）、神经干细胞移植30d组（NSCs30d组）和督脉电针＋神经干细胞移植30d组（电针NSCs30d组）4组。所有动物均实施T10段脊髓全横断手术，其中电针组和电针NSCs组于术后5d进行电针治疗。分别于术后14d和30d取材检测移植在脊髓损伤处的神经干细胞存活、分化和迁移情况。结果1．电针NSCs14d组或电针NSCs30d组移植的神经干细胞存活数量均多于NSCs14d组或NSCs30d组，但是电针NSCs30d组或NSCs30d组移植的神经干细胞存活数量均少于电针NSCs14d组或NSCs14d组。2．电针NSCs30d组和NSCs30d组的脊髓全横断损伤处及其相邻的组织均有少量移植的神经干细胞呈现微管相关蛋白2（MAP2）阳性染色。3．电针NSCs30d组和NSCs30d组的脊髓全横断损伤处及其相邻的组织均可观察到较多移植的神经干细胞呈现胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）阳性染色。4．在电针NSCs14d组或电针NSCs30d组，移植的神经干细胞向脊髓损伤处尾端组织迁移的距离明显长于NSCs14d组或NSCs30d组。结论督脉电针能够促进大鼠脊髓全横断损伤处移植的神经干细胞存活，这些细胞能分化为MAP2或GFAP阳性细胞；督脉电针对移植在脊髓损伤处的神经干细胞向宿主脊髓组织迁移方向有一定的影响。     

移植胚鼠神经干细胞对大鼠脊髓损伤后红核神经元损伤的影响

目的研究神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后红核神经元的作用。方法5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)法标记处于对数生长期的NSCs,采用电控脊髓损伤打击装置制作大鼠脊髓损伤模型。实验分为3组:NSCs组、SCI组和假手术组(Sham组)。SCI后3 d进行NSCs移植,用免疫组化法观察移植细胞的存活及迁移情况,用辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪技术标记红核神经元,并用四甲基联苯胺(TMB)呈色反应显示红核脊髓束神经元的存活情况,用行为学(BBB)评分法观察大鼠瘫痪肢体的恢复情况。结果在损伤脊髓区域可检测到BrdU标记的阳性NSCs,中脑HRP标记红核神经元数目明显多于SCI组(P<0.01),BBB评分亦明显高于SCI组(P<0.01)。结论体外培养的胚胎大鼠NSCs在移植到脊髓损伤区域后可存活和迁移,对SCI后中脑红核神经元具有保护作用,从而促进了大鼠肢体功能的恢复。     

督脉电针与神经干细胞移植联合应用促进大鼠受损伤脊髓组织产生神经生长活性物质

目的探讨督脉电针与神经干细胞移植联合应用能否促进受损伤脊髓组织产生神经生长活性物质。方法成年大鼠分为正常组、对照组、神经干细胞移植组（NSCs组）、督脉电针组（电针组）和督脉电针＋神经干细胞移植组（电针NSCs组）。除正常组外均实施T10段脊髓全横断手术，其中电针组和电针NSCs组于术后5d进行电针治疗。分别于术后14d和28d取材，进行受损伤脊髓组织环-磷酸腺苷（cAMP）含量的放射免疫检测；用Westen blottlng检测神经营养素-3（NT-3）、神经营养因子受体（Trk）以及生长相关蛋白-43（GAP-43）的水平。结果 1．在术后14d，NSCs组、电针组和电针NSCs组的脊髓损伤区cAMP含量较正常组有增加。但除电针组外，脊髓损伤区的上段或下段组织cAMP含量低于正常组。在术后28d，电针NSCs组脊髓损伤区上段、下段组织cAMP含量仍保持较高水平。NSCs组和电针NSCs组的脊髓损伤区cAMP含量较正常组有所增加。2．NT-3、Trk及GAP-43的表达以电针组和电针NSCs组较为明显，对照组和NSCs组的3种蛋白表达均低于电针组和电针NSCs组。结论督脉电针能促进受损伤的脊髓组织产生cAMP；督脉电针与NSCs移植联合应用能保持受损伤的脊髓组织较高水平的cAMP，而且NT-3、Trk及GAP-43的含量也有增高的趋势。     

嗅鞘细胞移植对大鼠脊髓半横断损伤后轴突再生及后肢功能恢复的作用

为了对嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)后轴突再生及后肢功能恢复进行综合性的评价,本实验采用22只雌性成年SD大鼠,并随机分成A、B、C、D 4组。其中A、B、D组行左侧T11 ～T12节段脊髓半横断手术,然后A组移植嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)悬液;B组移植DMEM/F12培养液;D组移植核荧光试剂(Hoechst33342)标记的嗅鞘细胞,用于鉴定嗅鞘细胞在体内的存活情况;C组作为正常对照组。术后6周内,对大鼠进行BBB评分、IP斜板试验并观察皮质体感诱发电位(cortical somatosensory evoked potential, CSEP)、运动诱发电位(motor evoked potential, MEP)的潜伏期。将辣根过氧化物酶(HRP)注射到横断面尾段脊髓,逆行追踪观察横断面头段脊髓及对侧中脑红核内HRP逆标细胞数,并观察左侧后肢小腿三头肌肌细胞横截面积及直径的变化。结果显示:(1)移植后的OECs数量未见明显减少,细胞核形态较好,细胞未向头、尾侧迁移;(2)移植3周后BBB评分及IP斜板,试验A、B组较C组明显低(P<0.05),但A组明显高于B组(P<0.05);(3)A、B组的CSEP及MEP潜伏期较C组明显延长(P<0.05),但A组要比B组明显缩短(P<0.05);(4)HRP逆行追踪观察到对侧中脑红核大细胞区及脊髓T9 ～T11节段逆标细胞的数量,A组明显多于B组,但A、B组均少于C组;(5)左侧后肢小腿三头肌肌细胞的横截面积及直径,A、B组均较C组减少,但A组减小的幅度明显小于B组。以上结果表明OECs移植能促进半横断脊髓轴突的再生及后肢功能的恢复。     

Functional recovery of stepping in rats after a complete neonatal spinal cord transection is not due to regrowth across the lesion site

Rats receiving a complete spinal cord transection (ST) at a neonatal stage spontaneously can recover significant stepping ability, whereas minimal recovery is attained in rats transected as adults. In addition, neonatally spinal cord transected rats trained to step more readily improve their locomotor ability. We hypothesized that recovery of stepping in rats receiving a complete spinal cord transection at postnatal day 5 (P5) is attributable to changes in the lumbosacral neural circuitry and not to regeneration of axons across the lesion. As expected, stepping performance measured by several kinematics parameters was significantly better in ST (at P5) trained (treadmill stepping for 8 weeks) than age-matched non-trained spinal rats. Anterograde tracing with biotinylated dextran amine showed an absence of labeling of corticospinal or rubrospinal tract axons below the transection. Retrograde tracing with Fast Blue from the spinal cord below the transection showed no labeled neurons in the somatosensory motor cortex of the hindlimb area, red nucleus, spinal vestibular nucleus, and medullary reticular nucleus. Retrograde labeling transsynaptically via injection of pseudorabies virus (Bartha) into the soleus and tibialis anterior muscles showed no labeling in the same brain nuclei. Furthermore, re-transection of the spinal cord at or rostral to the original transection did not affect stepping ability. Combined, these results clearly indicate that there was no regeneration across the lesion after a complete spinal cord transection in neonatal rats and suggest that this is an important model to understand the higher level of locomotor recovery in rats attributable to lumbosacral mechanisms after receiving a complete ST at a neonatal compared to an adult stage.     

Long-term Fate of Allogeneic Neural Stem Cells Following Transplantation into Injured Spinal Cord

To characterize the fate of allogeneic neural stem cells (NSCs) following transplantation into injured spinal cord, green fluorescent protein (GFP)-NSCs isolated from GFP transgenic Sprague–Dawley rat embryos were transplanted into contused spinal cords of Wistar rats. The GFP-NSCs survived for at least 6 months in injured spinal cord; most of them differentiated rapidly into astrocytes, and a few were able to undergo proliferation. After transplantation, the GFP-NSCs remained in the transplantation site at the early stage, and then migrated along white-matter, and gathered around the injured cavity. At 6 months post-transplantation, CD8 T-lymphocytes infiltrated the spinal cord, and mixed lymphocyte culture from host and donor showed that lymphocytes from the host spleen were primed by allogeneic GFP-NSCs. At 12 months post-transplantation, most GFP cells in the spinal cord lost their morphology and disintegrated. The Basso, Beattie and Bresnahan score and footprint analysis indicated that the improvement of locomotor function in transplanted rats appeared only at the early stage, and was not seen even at 6 months after transplantation All these results suggest that the allogeneic NSCs, after transplantation into injured spinal cord, activate the host immune system. Therefore, if immunosuppressive agents are not used, the grafted allogeneic NSCs, although they can survive for a long time, are subjected to host immune rejection, and the effect of NSCs on functional recovery is limited.