人参皂苷Rb2在体外调控破骨细胞的作用

目的探究人参皂苷Rb2在体外对破骨细胞的作用及机制。方法通过培养RAW264.7破骨前体细胞,加入不同浓度Rb2溶液(0.1μM,1μM,10μM),采用CCK-8检测Rb2药物毒性,利用TRAP染色观察破骨细胞形态并计数,使用RT-PCR方法检测TRAP、NFATc1破骨活动特异性基因m RNA的表达,通过Western blot技术检测破骨细胞中LC3 I、LC3 II、m TOR的蛋白表达水平。结果 TRAP阳性计数,与空白对照组相比(168.2±22.6),0.1μM组(131.0±16.3),P=0.018;1μM组(98.8±17.9),P0.01;10μM组(85.8±17.3),P0.01,破骨细胞数量明显减少。对照组TRAP、NFATc1破骨分化特异性基因m RNA表达明显下降,与对照组相比各组P0.01。LC3 II/LC3 I的比值显著增高,m TOR量下降,与对照组相比各组P0.01。结论 Rb2可能通过自噬途径影响破骨基因的表达,从而减少破骨细胞的形成,m TOR通路在此过程中起重要作用。     

MiR-184在人胃癌组织中的表达及对胃癌细胞凋亡的影响

[目的]探讨miR-184在人胃癌组织中的表达及对胃癌细胞凋亡的影响。[方法]使用Real-time PCR检测miR-184表达,SGC-7901细胞转染,MTT法检测细胞增殖情况,Hoechst33342染色观察细胞自噬、凋亡情况,Transwell法检测细胞侵袭能力应用,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测各组细胞NF-κB、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达。[结果](1)胃癌组织的miR-184表达水平显著低于正常胃组织(1.74±0.12 vs 2.51±0.41,t=12.745,P<0.001)。(2)转染1d后,miR-184 mimics组的miR-184表达水平(6.02±1.15)显著高于NC组(2.15±0.37)(t=22.652,P<0.001),miR-184 inhibitors组表达水平(0.52±0.09)显著低于NC组(t=30.268,P<0.001)。(3)24~72h内,miR-184 inhibitors组和NC组的细胞增殖能力显著性高于miR-184 mimics组(P<0.05)。(4)Mi R-184 mimics组(45.39%±1.74%)侵袭率显著低于NC组(52.05%±2.03%)(t=17.614,P<0.001),而miR-184 inhibitors组(94.51%±3.08%)侵袭率显著高于NC组(t=22.652,P<0.001)。(5)MiR-184 mimics组(72.32%±22.82%)细胞凋亡率显著高于NC组(44.07%±16.23%)(t=7.133,P<0.001),而miR-184 inhibitors组(35.31%±11.29%)凋亡率显著低于NC组细胞(t=3.133,P=0.001)。(6)MiR-184 mimics组可见大量自噬泡,NC组自噬泡可见部分,miR-184 inhibitors组仅可见极少量自噬泡。(7)MiR-184 mimics组NF-κB、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达水平显著高于NC组(t=14.055、14.486、28.450,P均<0.001),miR-184inhibitors组NF-κB、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达水平显著低于NC组(t=15.423、10.354、39.836,P均<0.001)。[结论]MiR-184可在一定程度上抑制胃癌细胞的侵袭和增殖能力,其主要作用机制是诱导胃癌细胞的自噬与凋亡。     

肺癌A549细胞诱导RAW264.7破骨细胞分化中AMPK信号通路的作用

目的:探讨AMPK信号通路在体外肺癌细胞诱导破骨细胞分化中的作用。方法:将肺癌A549细胞与RAW264.7细胞共培养后随机分为阴性对照组、阳性对照组、AICAR组,药物干预后行TRAP染色观察破骨细胞的分化,流式细胞仪观察破骨细胞细胞凋亡情况,qPCR检测破骨细胞AMPK、mTOR和CTSK mRNA的表达,Western blot检测破骨细胞AMPK、p-AMPK、mTOR和p-mTOR蛋白的表达。结果:与阴性对照组比较,AICAR组破骨细胞数明显减少,差异具有统计学意义（P＜0.05）;对诱导破骨细胞凋亡的作用无差异;上调AMPK的mRNA和蛋白表达,下调mTOR的mRNA和蛋白表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:AICAR可以抑制肺癌细胞诱导破骨细胞分化,而AMPK/mTOR信号通路可能参与了肺癌细胞诱导破骨细胞分化过程。     

马鞭草总黄酮通过AKT/mTOR信号通路调控自噬抑制肝癌细胞增殖

目的:分析马鞭草总黄酮(total flavonoids of verbena officinalis L.,TFV)对肝癌细胞自噬和增殖的影响,并探讨其机制。方法:MDC染色法检测自噬泡水平,Western印迹检测自噬相关蛋白水平,运用3-甲基腺嘌呤(3-MA)、雷帕霉素(RAPA)研究TFV对自噬、细胞增殖的影响,MTT法检测细胞存活率。裸鼠成瘤实验验证TFV对裸鼠体内瘤体的瘤重、瘤体积及自噬相关蛋白水平的影响。结果:TFV能增加HepG2、Huh-7细胞中MDC染色标记的荧光颗粒,并伴随浓度的上调明显增加,促进HepG2、Huh-7细胞中自噬蛋白Beclin-1、LC3 II/LC3 I水平表达,降低p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平(P<0.05)。与TFV组比较,TFV+3-MA组抑制率、LC3 II/LC3 I明显降低,p-mTOR/mTOR明显增加(P<0.05);与TFV组比较,TFV+RAPA组抑制率、LC3 II/LC3 I明显增加,p-mTOR/mTOR明显降低(P<0.05);与TFV组比较,TFV+3-MA组裸鼠瘤体LC3 II/...     

NF-κB及Rb蛋白在进展期胃癌中的表达及E-cadherin/catenin复合物在转移淋巴结中再表达的临床意义

目的探讨NF-κB、Rb蛋白与E-cadherin/catenin复合物对胃癌转移机制和对患者预后的影响。方法采用免疫组化(SP)法分别检测了NF-κB、Rb蛋白在肿瘤原发灶及E-cadherin/catenin复合物在胃癌原发灶及其相应淋巴结内的表达情况。结果 NF-κB蛋白在胃癌组织中表达阳性率为81.40%,Rb蛋白在胃癌组织中表达阳性率为65.12%,E-cadherin/catenin复合物在胃癌原发灶中异常表达率为98.84%,在转移淋巴结中再表达阳性率为63.95%。NF-κB表达与胃癌病理类型和分化程度密切相关(P<0.05)。Rb蛋白表达与肿瘤分化程度密切相关(P<0.05)。E-cadherin/catenin复合物在转移淋巴结中的表达与肿瘤细胞的分化程度密切相关(P<0.05)。Kaplan-Meier曲线显示NF-κB、Rb蛋白的表达与患者的预后无关(P>0.05);E-cadherin/catenin复合物在转移淋巴结内表达情况与患者的预后密切相关(P<0.05)。Wilcoxon’s log-rank test进行组间差别检验显示各组间差别无显著性(P>0.05)。Cox’s proportional-hazard多变量分析显示E-cadherin/catenin复合物在转移淋巴结内的表达可以作为一个独立的预后因素(P<0.05)。Sperman秩相关分析显示NF-κB、Rb蛋白表达与E-cadherin/catenin复合物在转移淋巴结内表达均无显著相关性。结论胃癌中存在NF-κB、Rb蛋白的高表达,转移淋巴结中存在E-cadherin/catenin复合物的高表达;E-cadherin/catenin复合物在转移淋巴结内的表达情况与患者的预后密切相关,可以作为一个独立的预后因素。     

硼替佐米对多发性骨髓瘤患者破骨细胞生成的影响及机制研究

目的:观察多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者破骨细胞在体外诱导分化成熟过程中,硼替佐米(Bortezomib,Btzmb)对其分化和功能的影响,以及破骨细胞分化过程中上游关键信号分子肿瘤坏死因子受体相关蛋白6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)的改变.方法:患者外周血单个核细胞在经核因子KB受体活化因子配体(receptor activator of NF-kB ligand,RANKL)及巨噬细胞集落刺激因子(macmphage colony stimulating factor,M-CSF)诱导后向破骨细胞分化过程中,采用不同剂量的Btzmb进行处理,观察抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistant acid phosphatase,TRAP)染色阳性的破骨细胞数量,检测培养液中的TRAP活性,并观察骨片上骨陷窝数量的变化.采用Westem印迹和RT-PCR法,分析Btzmb对破骨前体细胞中TRAF6蛋白和mRNA的影响.结果:2.5和5 nmol/L Btzmb组破骨细胞数量分别为(157±21)和(98±15)个,较对照组(307±25)明显减少(P均＜0.05),骨陷窝形成数量分别为对照组的(53±24)%和(29±7)%(P均＜0.05),上清液中破骨细胞活性分别为对照组的(86±24)%和(60±25)%(P均＜0.05).破骨前体细胞经Btzmb处理后观察24 h,TRAF6蛋白活性逐渐降低,TRAF6 mRNA水平也有所下降.结论:Btzmb抑制MM患者破骨细胞的分化和功能,该作用可能与TRAF6有关.     

CCN3在肺癌骨转移灶中高表达及其对破骨细胞的作用

背景与目的:肺癌易转移至骨并导致溶骨性破坏的具体机制目前还不清楚,本研究观察CCN3在肺癌骨转移灶中的表达水平以及在前体成骨细胞(MC3T3-E1)与前体破骨细胞(RAW264.7)共培养体系研究CCN3重组蛋白对前体破骨细胞分化的影响。方法:采用免疫组化检测9例肺癌骨转移转灶组织及相应癌旁组织中CCN3的表达;构建RAW264.7细胞与MC3T3-E1细胞共培养模型,向共培养体系中加或不加800 ng/mL的CCN3重组蛋白,采用Real-time PCR检测RAW264.7细胞的破骨细胞标志基因抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)、组织蛋白酶K(cathepsin K,CK)、降钙素受体(calcitonin receptor,CTR)mRNA的表达,并通过TRAP染色法对破骨细胞进行鉴定。结果:肺癌骨转移灶组织中的CCN3表达量明显高于癌旁组织;CCN3重组蛋白可显著促进共培养体系中的RAW264.7细胞的破骨细胞标志基因TRAP、CK、CTR的mRNA的表达量;TRAP染色可见对照组TRAP阳性细胞数[(6.2±1.48)个]明显低于加了CCN3重组蛋白的试验组[(21.4±3.04)个],差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:CCN3在肺癌骨转移灶中高表达及其可诱导破骨细胞分化,CCN3可能在肺癌骨转移和溶骨性破坏中具有重要作用。     

一种从骨巨细胞瘤组织中纯化破骨细胞的简单方法(英文)

目的从人骨巨细胞瘤组织中分离纯化及鉴定破骨细胞。方法我们利用0.25%胰酶-EDTA 和Ⅰ型胶原酶从人骨巨细胞瘤组织中纯化出大量破骨细胞,并进行表型特征的鉴定:包括抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP 染色),采用 RT-PCR 方法检测降钙素受体、组织蛋白酶 K 和破骨细胞分化因子受体(RANK)表达。结果该方法所得细胞纯度可达79.7%,具有破骨细胞表型特征。结论该方法所得破骨细胞可用于生化和分子生物学研究,是进行骨代谢研究较好的破骨细胞来源。     

自噬对宫颈癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的 观察自噬对宫颈癌细胞增殖迁移能力的影响,并探讨其可能机制。方法 采用不同浓度雷帕霉素诱导人宫颈癌HeLa细胞,吖啶橙染色观察自噬小体的形成,Western blot检测自噬相关基因LC3B以及PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表达情况,采用RTCA仪器实时检测细胞的增殖能力,Transwell小室检测细胞的迁移能力。应用自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)阻断宫颈癌细胞自噬后,采用RTCA仪器实时检测细胞的增殖能力,Transwell小室检测细胞的迁移能力。构建带有绿色荧光蛋白的LC3B质粒,转入HeLa细胞,通过G418药物筛选转染阳性细胞,荧光显微镜观察LC3B的细胞定位,Western blot检测LC3B表达。RTCA仪器实时检测野生型和LC3B过表达HeLa细胞的增殖能力,Western blot检测PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表达。结果 雷帕霉素诱导后,宫颈癌HeLa细胞自噬水平增高,增殖和迁移能力有所下降;PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达改变(P＜0.05)。自噬抑制剂3-MA诱导HeLa细胞增殖和迁移水平下降(P＜0.05)。荧光显微镜和Western blot结果显示构建的LC3质粒成功转入Hela细胞中并且能够抑制宫颈癌细胞的增殖(P＜0.05)。结论 在一定范围内,随着自噬水平的升高,HeLa细胞增殖和迁移能力降低,可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥作用。通过基因靶向扰乱自噬关键基因(如LC3等)而改变宫颈癌细胞自噬水平可能为宫颈癌的治疗带来新策略。     

TRADD和NF-κB在乙肝后肝硬化和肝癌中的表达及意义

目的探讨TNF受体相关死亡区域蛋白(TRADD)、核因子κB(NF-κB)在乙肝后肝硬化(LC)和原发性肝癌(HCC)中的表达及其临床意义。方法 采用Western blot分别检测35例LC和HCC中TRADD和NF-κB蛋白的表达。采用Fisher精确概率法进行统计分析。结果 TRADD在HCC中表达阳性率为68.6%(24/35), LC中为100.0%(P＝0.0002)。NF-κB在HCC中表达阳性率为77.1%(27/35), LC中为100%(P=0.002)。TRADD与HCC患者的甲胎蛋白水平相关(P＜0.01)。结论 乙肝后肝硬化中TRADD和NF-κB介导的肝细胞增殖和凋亡处于活跃水平。这种细胞增殖和凋亡信号转导机制的异常可能在肝硬化癌变过程中起着重要作用。     

miR-4319通过靶向调控USP2抑制乳腺癌细胞侵袭

目的探讨miR-4319与泛素特异性蛋白酶2(USP2)表达的相关性以及miR-4319靶向USP2通过核转录因子κB(NF-κB)信号通路对乳腺癌细胞侵袭的影响。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-4319在正常乳腺癌上皮细胞(MCF10A)、低侵袭性乳腺癌细胞(MCF7)和高侵袭性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)中的表达量。将MCF10A、MCF7和MDA-MB-231细胞分为6组进行转染:(1)MDA-MB-231/NC组,瞬时转染插入一段乱码序列(scramble 1),即作为miR-4319过表达对照质粒;(2)MDA-MB-231/miR-4319组,瞬时转染插入目的片段miR-4319质粒过表达miR-4319,即miR-4319过表达;(3)MDA-MB-231/miR-4319+Con组,瞬时转染同时转入miR-4319过表达质粒和USP2过表达对照质粒,即miR-4319过表达以及USP2过表达对照;(4)MDA-MB-231/miR-4319+USP2组,瞬时转染同时转入miR-4319过表达质粒和USP2过表达质粒,即miR-4319过表达和USP2过表达;(5)MDA-MB-231/miR-4319inhibitor组,瞬时转染miR-4319的反义序列抑制miR-4319的表达,即抑制miR-4319的表达;(6)MDA-MB-231/miR-4319inhibitor NC组,瞬时转染插入一段乱码序列(scramble 2),即作为抑制miR-4319组的对照组。qRT-PCR检测miR-4319在MDA-MB-231细胞中的转染效率。荧光素酶实验检测miR-4319与USP2 mRNA是否存在结合位点。qRT-PCR检测miR-4319在乳腺癌细胞中过表达后的USP2 mRNA表达水平。蛋白质印迹法检测过表达miR-4319或抑制miR-4319表达后的USP2蛋白表达水平。Transwell侵袭实验检测过表达miR-4319或USP2后MDA-MB-231细胞侵袭能力。双荧光素酶实验检测miR-4319对NF-κB信号通路活性的影响以及过表达USP2后miR-4319对NF-κB信号通路活性的影响。结果 qRT-PCR结果显示,miR-4319相对表达量在细胞MDA-MB-231(t=14.860,P<0.001)和MCF7(t=12.770,P<0.001)中分别为0.330±0.075和0.570±0.082,均低于细胞MCF10A(1.012±0.051);miR-4319相对表达量MDA-MB-231/miR-4319组(3.980±0.083)高于MDA-MB-231/NC组(1.009±0.058),差异有统计学意义,t=102.90,P<0.001。荧光素酶实验结果显示,pGL3-USP2 3’-UTR-WT报告载体与miR-4319质粒共转染后的荧光素酶活性下降,差异有统计学意义,t=15.740,P<0.001。qRT-PCR结果显示,USP2 mRNA相对表达量MDA-MB-231/NC组(1.013±0.058)和MDA-MB-231/miR-4319组(0.988±0.062)基本没有变化,差异无统计学意义,t=1.201,P=0.296。而蛋白质印迹法结果显示,USP2蛋白相对表达量miR-4319组(0.371±0.083)低于miR-4319/NC组(1.003±0.064),miR-4319/inhibitor组(1.982±0.093)高于inhibitor/NC组(1.104±0.072),USP2蛋白相对表达量的组间比较差异有统计学意义,F=212.4,P<0.001。Transwell侵袭实验结果显示,穿过Matrigel细胞数MDA-MB-231/miR-4319组(58.337±5.972)低于MDA-MB-231/NC组(192.371±5.476),差异有统计学意义,t=29.720,P<0.001;穿过Matrigel细胞数MDA-MB-231/miR-4319+USP2组(167.197±8.292)高于MDA-MB-231/miR-4319+Con组(63.283±10.397),差异有统计学意义,t=14.150,P=0.001。双荧光素酶结果显示,miR-4319/NF-κB-luc组荧光素酶活性(0.324±0.06)低于NC/pRL-TK组(1.024±0.080)、NC/NF-κB-luc组(2.023±0.110)和miR-4319/pRL-TK组(1.109±0.050),组间比较差异有统计学意义,F=237.1,P<0.001;miR-4319+USP2/NF-κB-luc组荧光素酶活性(2.032±0.12)高于miR-4319+USP2/pRL-TK组(1.094±0.100)、miR-4319+Con/pRL-TK组(1.063±0.080)和miR-4319+Con/NF-κB-luc组(0.334±0.050),组间比较差异有统计学意义,F=164.2,P<0.001。结论 miR-4319在乳腺癌细胞中低表达,miR-4319靶向结合USP2,过表达USP2逆转了miR-4319对乳腺癌细胞侵袭能力的抑制作用和NF-κB转录活性的抑制作用。miR-4319通过靶向结合USP2抑制NF-κB信号通路,从而抑制乳腺癌细胞的侵袭。     

P2X7R激动剂BzATP对非小细胞肺癌A549细胞生长和凋亡的影响

目的 研究配体门控离子通道P2X7受体(P2X7R)在非小细胞肺癌A549细胞中的表达,观察P2X7R激动剂2'-3'-O-(4-苯甲酰-苯甲酰)腺苷三磷酸三乙烷胺盐(BzATP)对A549细胞生长及凋亡的影响,并探究相关作用机制.方法 采用免疫荧光法检测P2X7R在A549细胞中的表达.用不同浓度的BzATP(150、300、600 μmol/L)处理,未用BzATP干预的细胞作为对照组.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)和Hoest33342染色法分别检测细胞存活率与凋亡情况,酶联免疫吸附试验检测上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度,Western blotting检测核转录因子-κB(NF-κB) p65、NF-κB抑制因子α(IκBα)及磷酸化NF-κB抑制因子α(phospho-IκBα)蛋白的表达.结果 P2X7R在A549细胞膜上表达.在300、600 μmol/L BzATP作用下A549细胞存活率分别为(67.87±8.98)％、(44.73±6.92)％,较对照组(98.60±1.44)％明显下降,差异均具有统计学意义(=4.481,P=0.027;t =3.920,P=0.038).BzATP可促进细胞凋亡,并且300、600 μmol/L BzATP可上调细胞培养上清中TNF-α浓度,分别为(57.35±6.41)pg/ml、(78.63±11.33) pg/ml,与对照组(42.56±0.37) pg/ml比较差异具有统计学意义(t=6.410,P=0.035;t=11.330,P=0.005).此外,BzATP可下调NF-κB p65的表达,上调IκBα的表达,对phospho-IκBα的表达无明显作用.结论 P2X7R表达于A549细胞膜,BzATP能够抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,其作用机制可能与促进细胞中TNF-α的释放,抑制NF-κB通路有关.     

冰片对血脑肿瘤屏障开放程度及紧密连接蛋白表达的影响

目的：探讨冰片对血脑肿瘤屏障（BTB）开放程度和紧密连接蛋白表达的影响。方法建立体外BTB试验模型,分为空白对照组（培养基）、冰片低剂量组（25μg/ml）、冰片中剂量组（50μg/ml）、冰片高剂量组（100μg/ml）。采用辣根过氧化酶（HRP）流量和酶联免疫吸附法（ELISA）测定不同时间点BTB的通透性及紧密连接相关蛋白的表达。结果随着时间延长,低、中、高剂量组各时间点通透率均逐渐升高（P﹤0.01）;低、中、高剂量组10～240 min通透率高于空白组（P﹤0.01）;中、高剂量组30～180 min通透率高于低剂量组（P﹤0.05）;高剂量组10～180 min通透率高于中剂量组（P﹤0.05）;不同时间点间和不同组别间Occludin蛋白表达水平比较,差异均无统计学意义（P﹥0.05）;各组ZO-1和F-actin蛋白表达量均先降低后逐渐升高（P﹤0.05）;低剂量组30 min后,中、高剂量组60 min后蛋白表达量缓慢上升,且均至240 min时基本与给药前水平一致（P﹥0.05）;中、高剂量组在30、60 min时ZO-1和F-actin蛋白表达量最低（P﹤0.01）,并存在剂量依赖趋势,即高剂量﹤中剂量﹤低剂量﹤给药前。结论冰片可以增加BTB的开放程度,从而提高化疗药物的透过率,其机制可能是通过调控紧密连接蛋白ZO-1和F-actin的表达而实现的。     

苯丁酸调控对顺铂抑制人肺腺癌A549/DDP耐药细胞株增殖与侵袭协同作用研究

目的肺癌已成为威胁人类生存的重要杀手,且随着环境恶化,其发病率和死亡率有逐年升高趋势。本研究分析4-苯丁酸对顺铂作用下人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP细胞增殖和侵袭影响,为临床治疗提供参考。方法体外培养人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP至生长状态良好,分析顺铂及4-苯丁酸联合顺铂对A549/DDP细胞株增殖作用,酶联免疫吸附测定法分析细胞凋亡相关蛋白表达变化,Transwell实验分析细胞侵袭力变化,蛋白质印迹法和免疫细胞化学分析细胞中JAK/STAT信号通路蛋白表达变化。结果随着时间延长,各组对A549/DDP细胞株增殖抑制率呈上升趋势,且高剂量4-苯丁酸联合顺铂组对A549/DDP细胞株增殖抑制率较高,差异有统计学意义,F药物=110.342,P<0.001;F时间=34.527,P<0.001;F药物×时间=58.321,P<0.001。与对照组相比,低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组细胞凋亡蛋白Bcl-2水平降低,Bax、Caspase-3和Caspase-6水平升高,均P<0.001。对照组、顺铂组、低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组细胞侵袭力分别为423.3±35.6、389.3±24.7、375.6±35.2和285.6±23.9,F=44.458,P<0.001;蛋白质印迹法检测发现对照组、顺铂组、低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组JAK2水平分别为1.32±0.26、1.01±0.24、0.90±0.12和0.74±0.13,F=18.633,P<0.001;STAT2水平分别为0.78±0.13、0.70±0.15、0.62±0.09和0.54±0.09,F=18.996,P<0.001;STAT3水平分别为1.01±0.23、0.89±0.14、0.74±0.10和0.40±0.10,F=19.687,P<0.001。免疫细胞化学法检测发现对照组、顺铂组、低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组JAK2水平分别为0.85±0.14、0.78±0.11、0.62±0.17和0.52±0.09,F=21.854,P<0.001;STAT2水平分别为0.85±0.20、0.77±0.14、0.69±0.08和0.52±0.13,F=17.852,P<0.001;STAT3水平分别为0.63±0.14、0.57±0.11、0.50±0.09和0.42±0.08,F=29.754,P<0.001。结论4-苯丁酸调控对顺铂作用下人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP细胞增殖、侵袭有明显抑制作用,且其作用可能与影响JAK/STAT信号通路蛋白表达有关。     

EGCG预防苯并芘诱发大鼠肺癌作用的研究

目的:研究EGCG对苯并芘诱发大鼠肺癌的预防作用。初步探讨其预防作用是否与NF-κB和Ki-67在肺癌中的表达有关。方法:实验分3组,EGCG干预组(简称干预组)、非EGCG干预组(简称非干预组)和对照组,前两组采用胸壁穿刺肺内注射苯并芘的方法制造SD大鼠肺癌模型,其中干预组加入EGCG干预因素,观察各组大鼠肺癌的成瘤率,免疫组化检测大鼠肺癌组织NF-κB p50、Ki-67的表达情况。结果:干预组和非干预组两组间成瘤率〔分别为35.0%(7/20)和80.0%(16/20)〕差异有统计学意义,P<0.01;肺癌组织与非肺癌组织NF-κB p50(χ2=25.377)、Ki-67(χ2=19.157 7)的表达差异有统计学意义,P<0.01;干预组、非干预组和对照组3组中NF-κB p50高表达率分别为35.0%、90.0%和0,Ki-67高表达率分别为40.0%、85.0%和0。干预组和非干预组两组比较,NF-κB p50高表达率差异有统计学意义,χ2=12.906 7,P<0.01,非干预组和对照组两组比较,NF-κB p50高表达率差异有统计学意义(χ2=32.727 3,P<0.01);干预组和非干预组两组比较,Ki-67高表达率差异有统计学意义(χ2=8.64,P<0.01),非干预组和对照组两组比较,Ki-67高表达率差异有统计学意义(χ2=29.565 2,P<0.01);EGCG干预组中有或无继发肿瘤时,NF-κB p50与Ki-67表达差异有统计学意义(分别为χ2=12.175,P<0.01;χ2=9.377,P<0.01);无EGCG干预组有或无继发肿瘤者,NF-κB p50与Ki-67表达也差异有统计学意义(分别为χ2=8.889,P<0.01;χ2=4.804,P<0.05)。结论:EGCG对苯并芘诱发大鼠肺癌有明显的预防作用,其作用机制可能与其抑制NF-κB p50、Ki-67的表达有关。     

POKemon和NF-κB p65在肝癌细胞中的信号调控

目的:旨在探讨原癌基因POKemon和核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB) p65在肝癌细胞中的信号调控作用.方法:采用实时荧光定量-PCR(real-time fluorogenic quantitative-PCR,RFQ-PCR)和蛋白质印迹法分别检测POKemon、NF-κB p65 mRNA和蛋白在肝癌细胞株HepG2和SMMC7721及人胚胎肝细胞LO2中的表达情况;随后应用小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)法依次分别抑制POKemon和NF-κB p65在肝癌细胞中的表达,观察二者在肝癌细胞中的变化,并应用FCM法检测对肝癌细胞凋亡的影响.结果:POKemon和NF-κB p65在肝癌细胞HepG2和SMMC7721中的表达量明显高于人胚胎肝细胞LO2;特异性针对POKemon基因的siRNA抑制POKemon的表达后,NF-κB p65在HepG2和SMMC7721细胞中的表达量也明显下降,转染前后分别为2.12±0.14vs 1.37±0.11和2.08±0.16vs 1.35±0.13,差异有统计学意义(P＜0.05),且肝癌细胞凋亡明显增加分别为(5.07±0.46)％vs (39.65±3.75)％和(5.71±0.83)％vs (33.21±3.66)％,差异有统计学意义(P＜0.05);特异性针对NF-κB基因的siRNA抑制NF-κB p65的表达后,POKemon在HepG2和SMMC7721细胞中的表达则无明显变化,其表达量转染前后分别为1.86±0.12vs 1.90±0.13和1.91±0.11 vs 1.85±0.11,差异无统计学意义(P＞0.05),但明显提高HepG2和SMMC7721细胞的凋亡率,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:原癌基因POKemon可通过调控NF-κB p65的表达而阻遏肿瘤细胞凋亡,促进肝癌的发生、发展.     

金复康口服液含药血清调控肺癌淋巴管新生机制探讨

目的中药制剂金复康口服液治疗肺癌的临床疗效已得到肯定,但机制尚不清楚。本研究探讨金复康口服液含药血清抑制肺癌淋巴管新生方向,探究其抑制肿瘤转移的分子学机制。方法将20只SD大鼠随机分为金复康口服液高剂量组〔15g/(kg·d)〕、中剂量组〔10g/(kg·d)〕、低剂量组〔5g/(kg·d)〕和Control组(生理盐水),每组5只。IL-4+为使用白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)刺激的RAW264.7细胞,IL-4-为无任何刺激干预的RAW264.7细胞。流式细胞术分析其细胞表面CD206表达来检测RAW264.7细胞极化成M2型的情况。根据含药血清将共培养模型分为高剂量组、中剂量组、低剂量组、Control组和Blank组(不加含药血清),Elisa法检测共培养模型下室培养基中血管内皮生长因子-C/D(vascular endothelial growth factor C/D,VEGF-C/D)蛋白含量;蛋白质印迹法检测下室Lewis细胞中VEGF-C/D的含量;实时q-PCR检测下室Lewis细胞中VEGF-C/D基因表达量。采用Graphpad prism for Mac(Version 8.1.1)、image J、FlowJo(Version 10.4)对数据进行统计分析。结果 M2型RAW264.7表型鉴定,CD206表达率IL4+为(58.45±1.45)%和IL-4-为(1.98±0.18)%,t=102.25,P<0.001。Elisa检测VEGF-C含量,高剂量组(2 866.07±70.97)pg/mL相对于Control组(3 252.97±94.51)pg/mL明显下降(t=5.47 P<0.01),VEGF-D高剂量组(58.43±17.3)pg/mL相对于Control组(117.7±7.3)pg/mL明显下降,t=5.47,<0.01;蛋白质印迹法检测Lewis细胞中VEGF-C含量,高剂量组(0.11±0.015)%相对于Control组(0.34±0.028)%明显下降(t=12.54,P<0.001),VEGF-D高剂量组(0.38±0.037)%相对于Control组(0.071±0.022)%明显下降,t=12.43,P<0.001;q-PCR测定Lewis细胞高剂量组中VEGF-C基因表达量(0.61±0.095)%相对于Control组(3.89±0.44)%明显下降(t=12.59,P<0.001),VEGF-D高剂量组(0.23±0.025)%相对于Control组(1.78±0.09)%明显下降,t=28.55,P<0.001。成管实验中高剂量组共培养模型下室中的培养基干预的HLEC细胞在Matrigel Matrix胶中形成管腔结构的数量明显减少。结论金复康口服液含药血清能够通过调控Lewis细胞合成VEGF-C/D,减少肺癌淋巴管新生从而达到抑制肿瘤转移。     

MiR-125b靶向A20/NF-κB信号通路促进胰腺癌细胞增殖机制的研究

[目的]研究miR-125b在胰腺癌组织及细胞系中的表达,探讨其对胰腺癌细胞增殖的影响及作用机制。[方法]QRT-PCR检测miR-125b在60例胰腺癌患者癌组织和癌旁组织中,及3株胰腺癌细胞系和1株正常胰腺导管上皮细胞中的表达;miR-125b敲减慢病毒质粒及阴性对照空载体质粒vector感染SUIT-2细胞,经1.0μg/ml嘌呤霉素筛选稳定敲减miR-125b或vector的SUIT-2细胞,注射到BALB/c裸鼠中,观察抑制miR-125b对胰腺癌细胞体内增殖能力的影响;利用Targetscan 7.2软件及荧光素酶报告基因试验,分析miR-125b对A20基因的靶向作用;SUIT-2细胞转染miR-125b inhibit和scramble后,体外实验检测miR-125b对细胞增殖、肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(tumor necrosis factorα-induced protein 3,TNFAIP3,又称A20)和NF-κB信号通路关键蛋白IKKα/β、IκBα、p65的表达影响。[结果]MiR-125b在胰腺癌的组织中的表达显著高于癌旁组织(0.99±0.21 vs 0.68±0.17,P<0.05);miR-125b在SW1990、SUIT-2、BxPC3胰腺癌细胞系中的表达显著高于在正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7中的表达(4.81±0.13,8.63±0.27,5.64±0.21 vs1.00±0.05,P均<0.05);SUIT-2_(mi R-125b)的裸鼠成瘤体积显著低于SUIT-2_vector细胞(P<0.05)。TargetScan软件预测和荧光素酶报告基因实验验证A20为miR-125b的靶基因;转染miR-125b inhibit后,A20基因表达显著增加(6.98±0.18 vs 1.00±0.06,P<0.05),细胞增殖能力、NF-κB信号通路关键蛋白IK-Kα/β、IκBα、p65的表达显著下降(P均<0.05)。[结论]MiR-125b可通过靶向调控A20/NF-κB信号通路促进胰腺癌细胞的增殖。     

苹果多糖抑制脂多糖引起宫颈癌Hela细胞的TLR-4/NF-κB 通路活化

目的:探讨苹果多糖(AP)对脂多糖(LPS)活化人宫颈癌细胞 Hela 中 TLR-4/NF-κB 通路的影响及相关机制.方法:培养Hela 细胞,将其分为对照组、LPS 处理组(1 μg/ml)、AP(0.5 mg/ml)+LPS处理组 (1 μg/ml),采用免疫荧光法观察 NF-κB 在细胞质、细胞核内的分布情况,免疫印迹法检测 Hela 细胞中 IκB-α,磷酸化 IκB-α,细胞核中NF-κB 以及细胞膜上TLR-4的蛋白变化.结果:AP 可抑制 LPS 刺激引起的 Hela 细胞的 NF-κB 核转位,可有效抑制 IκB-α 降解及 IκB-α的磷酸化,可降低细胞膜表面的 TLR-4表达.结论:AP可能通过抑制脂多糖活化 TLR-4分子来抑制NF-κB通路的激活.