宽体金线蛭与菲牛蛭抗凝血酶活性及抗凝机制比较研究

摘 要 目的：比较宽体金线蛭和菲牛蛭抗凝血酶活性及对凝血途径的影响,为进一步揭示水蛭抗凝作用机制提供参考。方法: 采用凝血酶滴定法、发色底物法 萃取 HPLC联合法测定水蛭对凝血酶的作用;同时采用凝固法测定其活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）和凝血酶时间（TT）,比较宽体金线蛭与菲牛蛭对不同凝血途径的影响。结果: 凝血酶滴定法的结果表明,不同水蛭的抗凝活性顺序依次为：菲牛蛭活体冻干品>菲牛蛭清水吊干品>>宽体金线蛭清水吊干品;发色底物法 萃取 HPLC法测定不同水蛭对凝血酶抑制作用的结果表明：不同水蛭水提取物对凝血酶的作用均表现出低浓度促进,高浓度抑制,且菲牛蛭具有强烈凝血酶抑制活性,而宽体金线蛭在加入更高剂量时才表现出抑制作用,且抑制作用较弱,菲牛蛭的抗凝血酶活性远远高于宽体金线蛭;不同水蛭样品均使APTT、PT、TT延长,但是菲牛蛭活体冻干品主要延长TT,清水吊干品主要延长APTT,而宽体金线蛭使APTT、TT延长更加显著。结论:宽体金线蛭和菲牛蛭对凝血酶及凝血途径的作用很大区别。     

半合成β-1,4-葡聚糖硫酸钠的抗凝血特性

目的研究半合成β-1,4-葡聚糖硫酸钠(Na-MCS)的抗凝血效果和作用机制。方法采用凝固分析法、以肝素为阳性对照进行抗凝血效果的评价，再通过发色底物法对凝血因子进行抑制分析，揭示Na-MCS的抗凝血作用机制。结果0.6 μg·mL^-1 Na-MCS即可显著延长APTT和TT，但在更高浓度下对PT影响仍不大，使正常人血浆的APTT延长1倍的Na-MCS剂量为0.7 μg·mL^-1，低于活性为150 u·mg^-1的肝素。结论在一定浓度范围内，Na-MCS的抗凝血活性与肝素相当，Na-MCS通过抗凝血酶AT-III的调节作用来抑制凝血因子IIa和Xa的活性，从而产生抗凝血作用。     

地龙抗凝血活性体外评价方法的建立

目的 建立一种基于全自动血凝分析仪测定纤维蛋白原-凝血酶时间的地龙及其相关制剂的抗凝血活性的体外评价方法。方法 以威廉环毛蚓提取物为研究对象,采用BCA蛋白测定法测定可溶性蛋白含量,以抗凝血活性为指标,建立纤维蛋白原-凝血酶时间法测定活性,以活性浓度与可溶性蛋白浓度的比值（比活）作为活性评价指标。结果 10批地龙提取物可溶性蛋白含量为（26.56±3.57）%,比活为（34.64±3.98）U·μg^-1。其比活大小与蚓激酶标准品（43.60 U·μg^-1）相当,且是市售蚯蚓酶（22.17 U·μg^-1）比活的1.5倍。结论 采用BCA蛋白测定法测定地龙提取物可溶性蛋白,方法简便、可靠;所建立的纤维蛋白原-凝血酶时间法,操作简便,人为影响因素小,结果客观准确,可用于实时测定,重复性和仪器精密度良好,线性范围较广,具有可行性,可用于地龙及其制剂活性的评价。     

猴头菌-地龙生物转化物体内外抗凝血活性研究

目的 探讨猴头菌-地龙（HD）生物转化物体内外抗凝血活性。方法 以华法林钠为西药阳性对照组,以逐瘀通脉胶囊为中药阳性对照组,以地龙和猴头菌为HD生物转化物的原料药材对照组,生理盐水为阴性对照组,将36只健康家兔分6组分别灌胃各组药物水煎液或混悬液,30~40 min后耳缘静脉采血,离心,将血浆置于凝血分析仪上测定凝血活酶时间和凝血酶原时间,进行统计分析。结果 在给定剂量下,体内抗凝血活性：华法林钠片 > HD生物转化物 > 地龙≈逐瘀通脉胶囊 > 生理盐水≈猴头菌,体外抗凝血活性：HD生物转化物 > 地龙 > 猴头菌≈华法林钠片≈生理盐水≈逐瘀通脉胶囊。结论 HD生物转化物有显著的抗凝血活性,有良好的开发应用前景。     

重组单环刺螠纤溶酶对大鼠急性心肌缺血的保护作用

目的 研究重组单环刺螠纤溶酶对大鼠急性心肌缺血的保护作用。方法 重组表达单环刺螠纤溶酶,并通过纤维蛋白平板法测定酶活力,体外抗凝试验检测抗凝效果。建立大鼠急性心肌缺血模型,观察并测定重组单环刺螠纤溶酶对大鼠心肌梗死质量比、血清学生化指标[乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、肌酸激酶（creatine kinase,CK）和天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate amino transferase,AST）]、凝血指标[凝血酶原时间（prothrombin time,PT）、部分凝血活酶时间（partial thromboplastin time,APTT）、纤维蛋白原（fibrinogen,FIB）、凝血酶时间（thrombin time,TT）]、组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator,t-PA）及组织型纤溶酶原激活物抑制因子1（tissue plasminogen activator inhibitor,PAI-1）活性的影响。结果 与模型组相比,重组单环刺螠纤溶酶能缩小心肌梗死范围,抑制AST、LDH、CK的升高,延长PT、APTT、TT,降低FIB,降低PAI-1活性,升高t-PA活性,均具有显著性差异（P<0.01）。结论 重组单环刺螠纤溶酶能明显增强纤溶活性,降低凝血时间,说明其抑制凝血系统、活化纤溶系统的作用机制之一可能是抑制血栓形成、抗心肌缺血。重组单环刺螠纤溶酶可有效预防心肌梗死,此结果可为下一步的临床应用提供一定的理论依据。     

降钙素原抗凝血酶Ⅲ和D-二聚体在新生儿重症肺炎诊治中的价值

目的 探讨降钙素原、抗凝血酶Ⅲ和D-二聚体在新生儿重症肺炎诊治中的价值。方法 选取新生儿普通肺炎97例、重症肺炎43例及健康新生儿70例为研究对象。重症肺炎组患儿,按照外周血PCT水平分为PCT<2.00 ng/mL组和PCT≥2.00 ng/mL组。对全部新生儿采集静脉血分别测定血小板 (PLT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)、D‐二聚体(DD)和抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)。结果 与健康新生儿组比较,普通肺炎组、重症肺炎组TT 、PT、APTT延长(P<0.05),PCT、DD、FIB水平升高(P<0.05),AT-Ⅲ和PLT水平降低(P<0.05)。 与普通肺炎组比较,重症肺炎组PCT、AT-Ⅲ和PLT水平降低(P<0.05),DD、FIB水平升高(P<0.05),两组PT、APTT、TT比较差异无统计学意义(P>0.05)。与PCT<2.00 ng/mL组比较,PCT≥2.00 ng/mL组的患儿DIC的发生率高(32.0% vs 11.1%),ATⅢ活性降低,PLT水平降低,而DD的水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 降钙素原、抗凝血酶Ⅲ和D-二聚体在新生儿重症肺炎诊治中具有重要的价值。     

闪式提取猴头菌-地龙生物转化物中抗凝血活性成分的工艺研究

目的 优选闪式提取猴头菌-地龙生物转化物（Hericium erinaceus-Pheretima biotransformation,HD）中抗凝血活性成分工艺参数。方法 以活化部分凝血酶时间为评价指标,以水作提取溶剂,提取2次,通过响应面设计试验法,对闪式提取HD中抗凝血活性成分的主要工艺参数进行优化。结果 闪式提取HD中抗凝血活性成分的最优工艺条件为：提取2次,第1次提取加水12倍,5 500 r·min^-1提取7 min;第2次提取加水10倍,5 500 r·min^-1提取7 min。在此工艺条件下所制备提取液的活化部分凝血酶时间均值最高,为（53.42±3.02）s。结论 通过优化与验证,首次创立了闪式提取HD中抗凝血活性成分的工艺路线。该工艺提取速度快,提取溶剂无毒,提取设备操作简单、所占空间小,节约资源。     

僵蚕抗凝成分仿生提取液的氨基酸序列分析

目的利用高效液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）对僵蚕胃蛋白酶提取液的有效抗凝成分进行结构分析。方法采用Hola C₁₈ (2.1mm×100 mm,2.7 μm)色谱柱, 以0.05%甲酸水溶液-0.05%甲酸乙腈溶液为流动相,梯度洗脱, LC-MS/MS正离子模式分析,初步探究抗凝活性成分的相对分子量和氨基酸组成。结果僵蚕经胃蛋白酶解得到相对分子量500~1000的活性肽,且多肽为低于10个氨基酸组成的低聚肽。结论僵蚕蛋白类组分通过酶解为活性低聚肽发挥抗凝作用,胃蛋白酶提取法更具科学性。     

耳内窥镜下鼓室内注射甲强龙对伴眩晕突聋患者听力康复及前庭功能和凝血功能的影响

目的 探讨耳内窥镜下鼓室内注射甲强龙对伴眩晕突聋患者听力康复及前庭功能和凝血功能的影响。方法 以2014年3月至2017年6月铜川市人民医院收治的62例伴眩晕突聋患者为研究对象。根据治疗方案不同将所有患者分为对照组和观察组各31例。所有患者均给予改善内耳微循环、降低血黏度和抗凝等常规治疗。对照组在常规治疗基础上采取甲强龙静脉注射治疗。观察组在常规治疗基础上给予耳内镜下鼓室注射甲强龙治疗,均治疗10 d。分析对比两组的治疗总有效率和治疗前后的凝血功能和前庭功能情况,采用血浆凝固法对凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）和纤维蛋白原（FIB）进行测定。结果 观察组的治疗总有效率为77.42%,高于对照组的54.84%,差异有统计学意义（P<0.05）。耳内窥镜下鼓室内注射甲强龙对前庭功能正常患者的治疗总有效率77.78%,高于对前庭功能异常患者的治疗总有效率38.46%（P<0.05）。治疗前,两组之间的前庭功能情况差异均无统计学意义;对照组治疗后的前庭功能情况差异无统计学意义;观察组治疗后的前庭功能正常占比高于治疗前,同组治疗前后比较差异有统计学意义（P<0.05）。治疗前,两组的PT、APTT、TT和FIB水平不具有统计学差异;治疗后,两组治疗后的PT、APTT和TT水平高于且FIB水平低于治疗前,同组治疗前后比较差异有统计学意义（P<0.05）;观察组的PT、APTT和TT水平高于且FIB水平低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 耳内窥镜下鼓室内注射甲强龙治疗伴眩晕突聋,有利于患者听力康复,能一定程度上改善前庭功能和凝血功能,但该研究的不足之处在于样本量较少,需要扩大样本量做进一步研究。     

丹红注射液对大鼠深静脉血栓形成模型的作用研究

目的 考察丹红注射液对大鼠深静脉血栓形成模型的作用。方法 以大鼠深静脉血栓形成模型为研究对象,通过检测出血时间、纤维蛋白原含量（FIB）、凝血酶时间（TT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）和血栓重量等指标,全面考察丹红注射液对大鼠深静脉血栓形成模型的改善作用。结果 丹红注射液2、1 mL·kg^-1剂量下可明显延长模型大鼠的出血时间、TT、APTT和PT,显著降低纤维蛋白原含量和静脉血栓的重量。结论 丹红注射液对大鼠深静脉血栓形成有明显的改善作用。     

蓝贻贝抗凝肽的合成及活性初步研究Δ

目的采用多肽固相合成法合成蓝贻贝抗凝肽MEAP(Blue mussel Mytilus edulis anticoagulant peptide),初步研究其抗凝活性。方法 以2-CTC树脂为载体, Fmoc保护氨基酸为原料,按照蓝贻贝抗凝肽的序列从C端向N端逐步偶联氨基酸,裂解后得到粗肽,经半制备液相纯化后测定精肽的凝血酶时间(TT)、活化的部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)。结果 合成的蓝贻贝抗凝肽粗品的纯度为65.5%,经半制备纯化后的精肽纯度为95.5%;抗凝活性实验显示APTT、TT具有显著的延时作用(P<0.01)。结论 固相合成的蓝贻贝抗凝肽具有抗凝活性。     

全蝎不同工艺提取物抗凝血及溶栓作用的比较研究

目的比较全蝎不同工艺提取物对抗凝血、溶栓作用的影响。方法比较原粉冷浸、水煎煮、水煎醇沉、胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、仿生酶解等不同提取工艺对凝血酶原时间(PT)、纤溶活性(FA)、大鼠凝血时间(CT)及静脉血栓重量(TW)的影响。结果4项指标中以上6种工艺与空白对照组相比较均有显著性差异(P<0.05);3种酶解工艺组与空白对照组相比有极显著性差异(P<0.01),其中仿生酶解组与原粉冷浸组相比有极显著性差异(P<0.01)。结论仿生酶解方法所得样品液抗凝血及溶栓作用较常规方法有极大提高,具有广阔的应用前景。     

纤维素硫酸酯体内抗凝血活性的实验研究

目的:研究纤维素硫酸酯对动物体内的抗凝血活性。方法:用试管法测凝血时间(CT),用凝固法测定活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT),以肝素和硫酸化右旋糖酐为阳性对照,考察其抗凝血活性的量效性和时效性。结果:纤维素硫酸酯能显著延长CT,APTT和TT,且呈剂量依赖性,但在所试剂量范围内对PT无明显影响;其抗凝血活性在给药2h时达到最大。结论:纤维素硫酸酯具有明显抗凝血作用,强于现有同类抗凝血药硫酸化右旋糖酐,略低于150IU·mg-1的肝素。     

鼠尾藻多酚及其各组分的抗凝血活性筛选

目的筛选鼠尾藻多酚及其各组分的抗凝血活性。方法采用膜分离方法对鼠尾藻多酚进行分级;采用毛细管法测定小鼠凝血时间;采用剪尾法测定小鼠出血时间;采用试管法测定新西兰兔激活部分凝血活酶时间、血浆凝血酶原时间和血浆凝血酶时间。结果高相对分子质量(Mr)鼠尾藻多酚分级级分极显著地延长小鼠凝血时间、出血时间、新西兰兔激活部分凝血活酶时间,且其延长程度与多酚Mr成正相关关系,Mr大于1.0×105的组分体内体外抗凝血活性与阿司匹林相近。结论高Mr鼠尾藻多酚具有极显著的体内、体外抗凝血活性。     

In vitro studies on a novel micelle-forming peptide with anticoagulant activity

A novel peptide, tert-butyloxycarbonyl-L-arginine-L-proline lauryl ester laurate, synthesised by a solution-phase method, formed micelles in aqueous solutions and was observed to exhibit anticoagulant activity as shown by clotting assays such as the thrombin time (TT) test, the prothrombin time (PT) test and the activated partial thromboplastin time (APTT) test. TT and PT were found to be normal up to a particular concentration of peptide, and above that level they increased with increasing concentration of peptide, while APTT did not exhibit much significance. Conductometric and potentiometric studies showed that the peptide formed a stable micelle, and the anticoagulant activity of this peptide was also compared with a non-arginine-containing peptide (control) known to form micelles. The anticoagulant action in the micellar form could be due to the inhibition of thrombin, as seen from the decrease in amidolytic activity. The inhibitory activity of the peptide was explained in the light of micelle formation.     

口服重组水蛭素抗凝、抗血栓作用的实验研究

目的:探讨口服重组水蛭素的抗凝、抗血栓的作用.方法:将24只Beagle犬,随机分为水蛭素大、中、小剂量组剂量分别为(600,300,150 AUT/kg)和空白对照组,每组6只.各试验组动物均经口给药,分别于给药前、达稳态前和达稳态后取血1～4 mL,测定凝血时间(CT)、血浆凝血酶原时间(PT)、凝血酶凝固时间(TT)、纤维蛋白原(FBG)、活化部分凝血活酶时间(APTT);同时采用下腔静脉结扎法制作血栓模型,计算深静脉血栓形成百分率和血栓重量.结果:各用药组CT,PT,TT,APTT值与空白对照组均有差异或显著差异(P＜0.05或P＜0.01),给药对FBG没有明显影响;深静脉血栓形成百分率和血栓重量也有差异或显著差异.结论:口服重组水蛭素具有很强的特异性凝血酶抑制作用,同时具有抗凝、抗血栓作用,可用于防治实验性深静脉血栓形成.     

萱藻多糖的制备及抗凝血抗血栓活性研究

目的制备萱藻多糖并对家兔体外凝血及小鼠体内血栓形成的抑制作用进行研究。方法采用热水浸提-乙醇沉淀法制备萱藻多糖;检测家兔心脏动脉血活化部分凝血酶时间(APTT),凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)。以角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓模型,检测萱藻多糖体内抗血栓作用。结果萱藻多糖可显著延长家兔血浆APTT、PT和TT;对角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓具有显著的抑制作用(P<0.01)。结论萱藻多糖具有抗凝和抑制实验性血栓形成的作用。     

赤芍总苷提取液体外清除自由基和抗凝血活性的研究

目的:研究赤芍总苷(TPG)提取液体外清除自由基和抗凝血的活性。方法:通过相同溶剂不同方法提取TPG,采用二苯基三硝基苯肼(DPPH)自由基体系、超氧阴离子自由基体系、羟基自由基体系检测TPG清除自由基的活性,同时测定TPG提取液对凝血酶原时间(PT)、部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)的影响。结果:沸水浴0.5h提取2次,TPG含量为4.682%;采用不同方法得到的TPG提取液对DPPH清除率为92.36%～96.65%,抗超氧阴离子活力和活性氧活力分别为415.15～496.97U.L-1和774.32～1911.60U.L-1;当TPG浓度≥0.012g.L-1时可显著延长PT(P<0.05),当TPG浓度≥0.0012g.L-1时可显著延长APTT(P<0.05)和TT(P<0.01)。结论:采用不同方法得到的TPG提取液均有较强的清除自由基和抗凝血活性。     

Design,Synthesis, and Biological Evaluation of Scutellarein Derivatives Based on Scutellarin Metabolic Mechanism In Vivo

Three series of scutellarein derivatives have been designed and synthesized based on metabolic mechanism of scutellarin ( 1 ) in vivo. Their thrombin inhibition activities were tested through the analyzation of prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), thrombin time (TT), and fibrinogen (FIB). The antioxidant activities of these target products were assessed by 1,1‐diphenyl‐2‐picrylhydrazyl radical (DPPH) assay and the ability to protect PC12 cells against H₂O₂‐induced cytotoxicity, and their solubilities were evaluated by ultraviolet (UV) spectrophotometer. The results showed that the two isopropyl groups substituted derivative ( 18c ) demonstrated stronger anticoagulant activity, better water solubility, and good antioxidant activity compared with scutellarein ( 2 ), which warrants further development of 18c as a promising agent for ischemic cerebrovascular disease treatment.     

少棘蜈蚣纤溶活性蛋白的抗血栓作用

目的研究少棘蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch)纤溶活性蛋白的抗血栓作用。方法采用离子交换层析和分子筛等制备法从少棘蜈蚣中纯化到蜈蚣纤溶酶(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch fibrinolyti cenzyme,SSFE),用纤维蛋白平板检测酶活力,常规方法检测了SSFE溶血性和出血性,进行了SSFE体外溶栓和体内溶栓实验,并检测了凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)3个标准化指标。结果PAGE显示SSFE为单一组分,具有纤溶活性;证明SSFE无致出血性且无致溶血活性,低、中、高剂量SSFE使小鼠APTT和TT均明显延长,中剂量SSFE对PT有延长作用,而高剂量作用不明显。结论蜈蚣纤溶酶具有抗血栓作用。