结核分枝杆菌Rv1048c基因异源表达菌株的构建及其对小鼠巨噬细胞存活率的影响研究

目的 对结核分枝杆菌H37Rv菌株中功能未知基因Rv1048c进行生物信息学分析，构建重组表达菌株MS＿Rv1048c,并研究其对小鼠巨噬细胞存活率的影响。方法 软件在线分析Rv1048c的氨基酸序列及其编码蛋白的基本性质，利用PCR扩增Rv1048c目的片段，构建重组质粒pMV261-Rv1048c,转入耻垢分枝杆菌，构建重组菌株MS＿Rv1048c与空载菌MS＿vec。分析该基因对菌株生长的影响；通过CCK-8、总胆固醇测定和油红(O)染色的方法，初步探究重组菌株感染巨噬细胞后对其活性的影响。结果 Rv1048c基因全长1 116 bp,蛋白由371个氨基酸构成，分子式是C₁₇₇₈H₂₈₂₁N₅₂₁O₅₂₅S₁₀,预测该蛋白是一种定位在细胞外的含有多个磷酸化位点的、不稳定的亲水性蛋白。本试验首次成功构建未知基因Rv1048c的异源表达载体，生长曲线测定发现该基因使菌株生长缓慢，细胞实验发现基因增强了重组菌株对细胞的侵袭能力。结论 Rv1048c可能具有结核分枝杆菌独有的生长...     

结核分枝杆菌Rv1773c促进细菌侵入巨噬细胞的研究

目的筛选出能促进分枝杆菌对巨噬细胞侵入的功能性结核基因并进行验证。方法将H37Rv RD10-16区的18个结核分枝杆菌(MTB)基因构建到pMV261载体上,然后将重组pMV261质粒电转至耻垢分枝杆菌M.smegmatis(Ms)中,并将各重组菌株命名为rMs::Rvs。运用菌落计数法筛选功能性基因;采用流式细胞术Flow cytometry(FCM),动物实验验证该基因的功能。结果菌落计数显示rMs::Rv1773c组菌落数最多,与对照组相比差异有统计学意义(P0.05);FCM验证Rv1773c促进Ms入侵巨噬细胞能力较强,rMs::Rv1773c组感染小鼠脾脏菌落数增多。结论筛选的RD14区功能性结核基因Rv1773c可能作为结核菌毒力因子,具备促进分枝杆菌入侵巨噬细胞的功能。     

Rv1508c调节和促进分枝杆菌对链霉素药物敏感性的研究北大核心CSCD

目的通过检测抗结核药物-利福平、异烟肼以及链霉素对结核分枝杆菌RD区(Region of Differences,RD)基因的IC50(half maximal inhibitory concentration,IC50)值,筛选对3种抗结核药物敏感或耐药的毒性结核分枝杆菌RD区基因。方法将结核分枝杆菌RD6、RD9和RD15区基因与穿梭质粒pMV261连接,连接产物电转化耻垢分枝杆菌中。分别将对数生长期的耻垢分枝杆菌以及重组耻垢分枝杆菌中加入浓度倍比稀释的异烟肼(0.031 25~4μg/ml)、利福平(0.031 25~4μg/ml)和链霉素(0.031 25~4μg/ml)100μl,37℃培养2d后,用酶标仪测A600值。用Graphpad Prism5计算IC50值并进行统计学分析。结果成功构建RD6、RD9和RD15区基因重组质粒,电转化入耻垢分枝杆菌后通过检测利福平、异烟肼以及链霉素对以上RD区基因的IC50值,成功筛选出对链霉素敏感的RD6区基因Rv1508c。同时对Rv1508c在分枝杆菌(毒性结核分枝杆菌H37Rv、减毒结核分枝杆菌H37Ra、BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌以及海洋分枝杆菌)中的分布做了鉴定,确定其只存在于H37Rv和H37Ra中。结论结核分枝杆菌RD6区基因Rv1508c能促进分枝杆菌对链霉素的敏感,使链霉素杀伤分枝杆菌作用增强,Rv1508c作为链霉素一个靶点,在今后研究中,Rv1508c可作为抗结核药物增敏剂的应用。     

Rv1508c调节和促进分枝杆菌对链霉素药物敏感性的研究

目的通过检测抗结核药物-利福平、异烟肼以及链霉素对结核分枝杆菌RD区(Region of Differences,RD)基因的IC50(half maximal inhibitory concentration,IC50)值,筛选对3种抗结核药物敏感或耐药的毒性结核分枝杆菌RD区基因。方法将结核分枝杆菌RD6、RD9和RD15区基因与穿梭质粒pMV261连接,连接产物电转化耻垢分枝杆菌中。分别将对数生长期的耻垢分枝杆菌以及重组耻垢分枝杆菌中加入浓度倍比稀释的异烟肼(0.031 25~4μg/ml)、利福平(0.031 25~4μg/ml)和链霉素(0.031 25~4μg/ml)100μl,37℃培养2d后,用酶标仪测A600值。用Graphpad Prism5计算IC50值并进行统计学分析。结果成功构建RD6、RD9和RD15区基因重组质粒,电转化入耻垢分枝杆菌后通过检测利福平、异烟肼以及链霉素对以上RD区基因的IC50值,成功筛选出对链霉素敏感的RD6区基因Rv1508c。同时对Rv1508c在分枝杆菌(毒性结核分枝杆菌H37Rv、减毒结核分枝杆菌H37Ra、BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌以及海洋分枝杆菌)中的分布做了鉴定,确定其只存在于H37Rv和H37Ra中。结论结核分枝杆菌RD6区基因Rv1508c能促进分枝杆菌对链霉素的敏感,使链霉素杀伤分枝杆菌作用增强,Rv1508c作为链霉素一个靶点,在今后研究中,Rv1508c可作为抗结核药物增敏剂的应用。     

结核分枝杆菌PE22/PPE36融合蛋白对耻垢分枝杆菌表型及巨噬细胞功能影响的研究

目的 将结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)PE/PPE家族重组融合蛋白PE22/PPE36异源表达于耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis, Ms)后，探讨其对Ms表型及巨噬细胞功能的影响，分析其在Mtb感染过程中发挥的作用。方法 原核表达获取融合蛋白PE22/PPE36,纯化后免疫6～8周龄小鼠制备多克隆抗体；电击法构建重组菌Ms＿PE22/PPE36及Ms＿vec,并用所制备的多克隆抗体验证重组融合蛋白在Ms中的表达。将重组菌接种于2×YT培养基中观察其菌落形态及生长曲线；点板法及菌落计数法检测重组菌在H₂O₂、SDS、溶菌酶、NaNO₂、低pH、饥饿等压力条件下的存活情况，以分析PE22/PPE36融合蛋白对Ms表型的影响；重组菌侵染巨噬细胞ANA-1及RAW 264.7后，流式细胞术检测ANA-1细胞凋亡率，ELISA法检测ANA-1细胞TNF-α及IL-6分泌量，Griess法检测ANA-1及RAW 264.7细胞NO分泌量并用通道抑制剂检测所涉...     

四对结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统基因功能的初步研究

目的探讨结核分枝杆菌毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统中的4对基因的功能,为研究结核分枝杆菌的传播机制提供基础科学数据。方法选取结核分枝杆菌TA系统VapBC家族中4对基因,包括VapC 4个毒素基因(Rv1720c、Rv2103c、Rv2494和Rv3408)和VapB4个抗毒素基因(Rv1721c、Rv2104c、Rv2493、Rv3407),在大肠杆菌和耻垢分枝杆菌中分别构建严谨型阿拉伯糖诱导质粒体系及乙酰胺诱导穿梭质粒体系观察VapC对细菌生长的抑制作用,及其对应的VapB解除抑制作用。结果在大肠杆菌和耻垢分枝杆菌的实验结果一致,Rv2103c具有一定抑制作用和Rv2104c具有消除抑制作用,其余3对毒素-抗毒素基因未见到明显的对细菌生长的抑制和消除抑制的作用。结论成功构建了VapBC家族在大肠杆菌及耻垢分枝杆菌中的表达体系,并发现了一对TA系统基因对细菌生长的抑制和消除抑制的作用。     

Sigma E基因对耻垢分枝杆菌五种药物敏感性的影响及机制研究

目的 探讨Sigma E (sigma factor E,SigE)基因影响耻垢分枝杆菌对5种药物的敏感性及其作用机制研究。方法 PCR法扩增出耻垢分枝杆菌sigE基因,克隆入质粒pMV261构建重组pMV261-SigE质粒,测序验证。重组质粒电转入耻垢分枝杆菌,Western blot检测SigE的表达。设立含空质粒转化菌为对照组,采用刃天青作为指示剂的微量滴定板法和菌落计数法检测pMV261-SigE重组耻垢分枝杆菌对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星和环丙沙星5种抗结核药物的敏感性。采用相应抗生素处理重组耻垢分枝杆菌48 h诱导细菌进入非复制持留状态,随后在含20 ng/mL的结核分枝杆菌复苏促进因子E (resuscitation-promoting factor E, RpfE)的7H9中静置培养2周,计数最大可能数和细菌生长数,测算复苏指数来了解SigE对药物敏感性的影响机制。结果 成功构建pMV261-SigE,经测序鉴定序列正确,Western blot检测到SigE在耻垢分枝杆菌中表达。与对照组相比,表达SigE重组耻垢分枝杆菌组对异烟肼、利福平等5种药物的相对荧光百分比高,敏感性下降。5组抗生素中,异烟肼、乙胺丁醇两种药物作用后pMV261-SigE重组耻垢分枝杆菌复苏指数明显高于对照组。结论 SigE可通过促进耻垢分枝杆菌进入持留状态影响异烟肼和乙胺丁醇作用的敏感性。     

颗粒溶素和白细胞介素12重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病的治疗作用

目的 探讨携带编码人天然颗粒溶素和小鼠白细胞介素12（IL-12）基因质粒（pZM03）的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染的疗效与机制。方法 结核分枝杆菌H37Rv感染Balb／c小鼠4周后，分别用生理盐水、耻垢分枝杆菌、pZM03、重组耻垢分枝杆菌治疗6次，于第1次治疗后3个月处死小鼠，检测器官荷菌量、脾淋巴细胞γ干扰素的分泌水平、血清IL-12和IgG2a分泌水平和肺、脾组织中颗粒溶素表达，同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果 重组耻垢分枝治疗组的肺和脾组织对数荷菌量分别为（4.57±0．28）和（3．47±0．25）CFU／g，比生理盐水组的（5．77±0．12）和（4．66±0．18）CFU／g、载体组的（5．62±0．14）和（4．65±0．26）CFU／g及质粒组的（5．04±0．22）和（4．25±0．48）显著降低；重组耻垢分枝杆菌组和pZM03组经结核菌素纯蛋白衍生物刺激后，1干扰素分泌水平显著高于耻垢分枝杆菌组和生理盐水对照组；重组耻垢分枝杆菌组血清IL-12水平和IgG2a水平显著高于耻垢分枝杆菌组和生理盐水对照组。用免疫组织化学方法检测到小鼠肺及脾组织中颗粒溶素的表达。生理盐水和耻垢分枝杆菌组的肺组织病理改变以渗出为主，病变广泛，增生改变不明显；重组耻垢分枝杆菌组的病变范围局限，并有类上皮细胞和泡沫细胞。治疗组和对照组的脾脏病理改变不明显。结论 携带颗粒溶素和IL-12的重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病有一定的免疫治疗作用，与增强宿主Th1型免疫应答和颗粒溶素的抗菌活性有关。     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素与人IL12融合基因重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的构建表达肝素结合血凝素与人IL12融合基因的重组耻垢分枝杆菌并对其进行鉴定。方法通过RT-PCR从人淋巴细胞获得hIL12基因模板,采用PCR技术克隆hIL12的P40和P35两个亚基及结核分枝杆菌的HBHA基因,通过酶切鉴定及DNA测序证实连接的基因片段均正确后,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pSMT3-HBHA-hIL12,并用电穿孔法将重组质粒转到耻垢分枝杆菌中。分别用HBHA单克隆抗体和hIL12多克隆抗体检测HBHA和hIL12蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达,并测定重组耻垢分枝杆菌生长状态的改变。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,通过HBHA单抗和hIL12多抗进行免疫荧光法检测证实HBHA和hIL12均有表达,并且重组的耻垢分枝杆菌的生长速度比正常组有较大的提高。结论成功构建了表达结核分枝杆菌HBHA基因和人IL12的重组耻垢分枝杆菌,为构建一种结核病的候选疫苗提供了实验基础。     

重组耻垢分枝杆菌Msmc^2-CFP10-ESAT6的构建

目的构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10-ESAT6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法采用基因拼接（Gene SOEing）法体外扩增结核杆菌1hp-ESAT6融合基因,插入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pB-CG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,电转化耻垢分枝杆菌mc2155,构建耻垢疫苗株Msmc2155-CFP10-ESAT6,热诱导表达CFP10-ESAT6融合蛋白,Western blot分析其免疫原性。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,并在耻垢分枝杆菌中经热诱导表达出分子质量单位约为22 ku的CFP10-ESAT6蛋白,该蛋白可被结核病患者血清、鼠抗ESAT6血清和鼠抗CFP10血清识别。结论结核分枝杆菌lhp-ESAT6融合基因在耻垢分枝杆菌中成功表达。     

PhoP/PhoR基因过表达结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv的构建及鉴定

目的构建PhoP和PhoR基因过表达结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv(以下简称H37Rv),检测不同电压条件下电转化构建的PhoP/PhoR基因过表达H37Rv菌株PhoP/PhoR基因的表达水平。方法提取并鉴定结核分枝杆菌重组穿梭质粒pMV361-PhoP和pMV361-PhoR,利用电转化技术将结核分枝杆菌重组穿梭质粒pMV361-PhoP和pMV361-PhoR导入H37Rv的感受态细胞中,构建PhoP/PhoR基因过表达H37Rv,应用实时荧光定量PCR检测不同电压条件下电转化构建的PhoP/PhoR基因过表达H37Rv的PhoP/PhoR基因表达水平。结果成功构建PhoP/PhoR基因过表达H37Rv。应用实时荧光定量PCR检测不同电压条件下电转化构建的PhoP/PhoR基因过表达H37Rv的PhoP/PhoR基因表达水平,其中在电压为2 300~2 500V的范围内,电压越高,电转化菌的PhoP/PhoR基因表达量越高。结论成功构建了PhoP/PhoR基因过表达H37Rv菌株,以电压为2 500V电转化构建的PhoP/PhoR基因过表达H37Rv的PhoP/PhoR基因表达量较高。     

流式细胞术检测不同毒力结核分枝杆菌感染巨噬细胞的凋亡率及其时相性变化

目的利用流式细胞技术检测结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株(BCG)分别感染巨噬细胞的凋亡率及其时相性变化。方法分别用结核分枝杆菌H37Rv株和BCG菌株感染巨噬细胞RAW264.7细胞株,于感染后1、3、6及12h,用流式细胞技术检测各组感染巨噬细胞的凋亡率,并分析其时相性变化。结果结核分枝杆菌H37Rv株和BCG菌株感染均使巨噬细胞凋亡率升高,其中在感染后1h和12h凋亡率升高更显著,两组比较凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。结论结核分枝杆菌感染导致巨噬细胞凋亡,凋亡率与菌株毒力强弱相关,毒力弱的结核分枝杆菌感染早期巨噬细胞升高更显著。     

耐异烟肼和链霉素的结核分枝杆菌临床分离株与敏感株差异蛋白表达研究

目的 鉴定结核分枝杆菌对异烟肼和链霉素耐药相关的潜在蛋白。 方法 以药物敏感株（01105）和标准株H37Rv为对照,核素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)结合Nano液相色谱-串联质谱分析仪（LC-MS-MS）技术和生物信息学,鉴定并相对定量结核分枝杆菌对异烟肼与链霉素耐药的临床分离株02166菌体蛋白。 结果02166菌株分别与01105菌株和H37Rv菌株比较差异表达蛋白为153个和130个,02166菌株与01105菌株和H37Rv比较差异表达蛋白均为86个(共同差异表达蛋白)。差异表达蛋白理论相对分子质量和等电点分布广泛,相对分子质量从7.63~326.22,等电点从3.74~12.48,其主要参与中间代谢、呼吸作用和脂类代谢。共同差异表达蛋白：9个核糖体蛋白（Rv0056、Rv0651、Rv0652、Rv0701、Rv0719、Rv1630、Rv2785c、Rv2909c和Rv3458c）在02166菌株中表达下调;5个蛋白（Rv0234c、Rv2466c、Rv2626c、Rv2986c和Rv3118）在02166菌株中呈显著差异表达,其中琥珀酸半醛脱氢酶（Rv0234c）和假定未知蛋白（Rv2466c）在02166菌株中表达上调倍数>1.2,DNA结合蛋白HU同系物hupB（Rv2986c）、假定未知蛋白(Rv2626c和Rv3118)在02166菌株中表达下调倍数<0.5。 结论iTRAQ发现了耐异烟肼和链霉素的结核分枝杆菌临床分离株差异表达蛋白,为进一步探讨结核分枝杆菌异烟肼或链霉素耐药机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌Hsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的相关性研究

目的建立结核分枝杆菌感染RAW264.7株巨噬细胞模型,研究结核分枝杆菌Hsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的相关性。方法分别用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株感染RAW264.7巨噬细胞株,于感染后1、3、6及12h,利用激光共聚焦显微镜鉴定卡介苗及结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株感染RAW264.7巨噬细胞模型;同时利用流式细胞技术于上述各时间点检测各组感染巨噬细胞的凋亡率,并分析其时相性变化;利用PCR技术扩增模型目的基因,利用Western blot检测上述各个时间点Hsp16.3蛋白表达水平的时相性变化。结果激光共聚焦显微镜下观察到RAW264.7巨噬细胞内有标记MTB16KD的绿色荧光,证实结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型构建成功。巨噬细胞感染结核分枝杆菌后凋亡率升高,其中感染后1、3和12h凋亡率H37Rv感染组与BCG感染组比较差异有统计学意义(P<0.05);巨噬细胞感染结核分枝杆菌后的PCR产物大小为435bp;感染细胞Hsp16.3蛋白表达升高,其中感染后1h和3h升高更显著。结论结核分枝杆菌感染可导致巨噬细胞凋亡,感染巨噬细胞的凋亡率与菌株毒力强弱有关,弱毒力结核分枝杆菌感染的巨噬细胞早期凋亡更显著;结核分枝杆菌感染巨噬细胞的凋亡与结核分枝杆菌表达Hsp16.3水平高低有关,在感染早期强毒力结核分枝杆菌Hsp16.3表达水平较高。     

结核分枝杆菌Rv2660c蛋白原核重组表达及其免疫活性研究

目的利用原核表达系统表达、纯化结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2660c,评价其在血清学方面用于结核病诊断的价值。方法合成Rv2660c全基因核酸序列,构建pET28a-Rv2660c融合表达载体,在原核系统内进行重组表达,亲和层析纯化重组Rv2660c蛋白,采用Western-Blot、ELISA实验分析重组蛋白的免疫反应。结果pET28a-Rv2660c在大肠杆菌内成功表达重组Rv2660c蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白分子量为10.2 KD,与预期一致,Western-Blot结果表明重组蛋白Rv2660c只能与活动性结核患者血清反应,出现一条杂交条带;ELISA结果发现重组Rv2660c蛋白与结核患者血清能产生较强的反应,结核病菌阳患者组、菌阴患者组、潜伏感染组以及健康对照组A450平均值分别为0.52、0.48、0.28和0.25。结论重组结核分枝杆菌Rv2660c蛋白具有一定的免疫原性,对活动性结核病的诊断具有一定的价值,但对结核分枝杆菌潜伏感染的诊断没有价值。     

结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c基因的重组质粒构建及蛋白表达

目的应用生物信息学方法分析结核分枝杆菌的Rv1246c和Rv1247c所编码蛋白的结构特征,并对其进行克隆和表达。方法利用Bioedit、Dnaman及Pfam等对Rv1246c和Rv1247c所表达蛋白结构进行分析;以结核分枝杆菌H37Rv的基因组为模板,用PCR分别扩增Rv1246c和Rv1247c基因片段,并重组到原核表达载体pET32a( )中,转化E.coliBL21(DH3)菌株,用IPTG诱导蛋白表达。通过SDS-PAGE及Western-blot免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价。结果生物信息学分析表明它们与大肠杆菌的relBE家族有相似的蛋白模块,Rv1246c蛋白与大肠杆菌RelE同源性是21.55%,Rv1247c同源性是23.85%;两个重组质粒构建成功;通过SDS-PAGE检测分别在31kD和29kD处有特异性条带;Western-blot免疫印迹出现特异性阳性信号;间接ELISA检测多克隆抗体效价均大于1:40 000。结论本研究首次成功构建了结核分枝杆菌的Rv1246c和Rv1247c的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了Rv1246c和Rv1247c蛋白,为进一步研究该组基因的分子功能奠定了良好基础。     

结核分枝杆菌膜蛋白MmpS5-MmpL5的表达及功能研究

目的: 表达结核分枝杆菌膜蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5外排泵系统,探讨其在贝达喹啉耐药中的作用。方法: 构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5的乙酰胺诱导型表达载体,在耻垢分枝杆菌中诱导表达MmpL5蛋白及MmpS5-MmpL5蛋白,测定表达菌株的生长特性及其外排能力,同时探讨贝达喹啉对表达菌株最小抑菌浓度的变化与对菌体三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量的影响。结果: 成功在耻垢分枝杆菌中表达结核分枝杆菌膜蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5,表达菌株的生长不受影响,共表达MmpS5-MmpL5蛋白的菌株外排能力增加,导致其对溴化乙锭的积累量(△荧光强度为395)较表达MmpL5蛋白组(△荧光强度为655)和携带pMV261s空质粒组(△荧光强度为642)减少约40%。贝达喹啉对MmpS5-MmpL5重组耻垢分枝杆菌的最低抑菌浓度由0.25μg/ml提高到2μg/ml,增加了8倍。贝达喹啉将MmpS5-MmpL5重组耻垢分枝杆菌菌体内ATP含量[(0.197±0.018)μmol/L]降低36.49%[(0.125±0.010)μmol/L]。MmpL5单表达不能形成外排泵,也对贝达喹啉无影响。结论: 结核分枝杆菌的膜蛋白MmpL5和MmpS5需要共表达才能在耻垢分枝杆菌中发挥作用,降低贝达喹啉的药物敏感性。MmpS5-MmpL5蛋白表达体系的建立为进行贝达喹啉的具体转运机制研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2673基因过表达对分枝杆菌细胞壁组分的影响

目的分析结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Rv2673基因过表达对分枝杆菌细胞壁组分的影响。方法构建Rv2673在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Msm)中的表达载体,导入到Msm后提取膜蛋白,以抗组胺酸标签的单克隆抗体鉴定表达的Rv2673蛋白。细菌培养时加入~(14)C-葡萄糖,收获Msm后分别以氯仿∶甲醇(2∶1)、氯仿∶甲醇∶水(10∶10∶3)、ε-soak-lovolunnee试剂分步提取全细胞的细胞壁组分,其余的沉淀则用以提取LAM。以HP-TLC及SDS-PAGE方法分离提取的组分,放射自显影。结果生物信息学分析表明Rv2673蛋白为在羧基末端具有8次跨膜结构的膜蛋白;Western bloting方法检测到过表达Rv2673的菌株膜蛋白中具有表达的Rv2673蛋白。TLC方法对细胞壁组分的分步分析表明过表达Rv2673的菌株及其对照菌株间DPA、DPM、Ac2PIM2、AcPIM2和Ac2PIM4/AcPIM4等小分子脂溶性分子没有显著性差异,但Western blot分析的细胞壁中大分子脂类组分显示,Rv2673具有显著性促进Ac2PIM6和AcPIM6生成的作用,以及促进LM转变为LAM。推测Rv2673蛋白能促进大分子脂类分子的生物合成,但对细胞壁中小分子的脂类分子无显著影响。结论 Rv2673参与LAM中阿拉伯聚糖分枝结构的形成,推测Rv2673蛋白对细菌感染宿主细胞及/或宿主细胞杀死Mtb有一定影响,是有发展潜力的药物靶向分子。     

重组蛋白Rv2346c抑制巨噬细胞对结核分枝杆菌的免疫灭活效应

目的探讨重组蛋白Rv2346c对卡介苗(BCG)感染鼠巨噬细胞(RAW264.7)后的免疫效应的影响及其机制。方法通过DNA合成、基因扩增、载体构建、诱导表达、纯化等过程制备重组蛋白Rv2346c;利用Cell Counting Kit-8(CCK8)方法检测RAW264.7增殖水平;采用菌落形成试验评估BCG生长情况;运用ELISA方法检测BCG和RAW264.7共培养上清中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL)-6的浓度;采取Western blot方法检测RAW264.7细胞中核转录因子κB(NF-κB)p65的表达水平。结果 DNA测序及Western blot检测证实成功制备重组蛋白Rv2346c;BCG可以抑制RAW264.7细胞增殖(P0.05),而RAW264.7细胞对BCG有灭活作用(P0.05);重组蛋白Rv2346c可以增强BCG对RAW264.7细胞增殖的抑制作用(P0.05),并降低RAW264.7对BCG的灭活效应(P0.05);Rv2346c还可以抑制RAW264.7分泌TNF-α和IL-6(P0.05),并抑制NF-κB p65的表达(P0.05)。结论重组蛋白Rv2346c可以抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7对BCG的免疫灭活效应,该作用可能与抑制细胞因子分泌和NF-κB p65活化有关,具体机制值得进一步深入探讨。     

反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌抑制作用的研究

目的研究反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌生长的抑制作用,探讨其潜在的抗结核作用。方法在7H9培养基中接种5&#215;10^5耻垢分枝杆菌MC^2 155,同时加入20μmol／L针对结核分枝杆菌中必须基因RV3806c在耻垢分枝杆菌中的同源基因MSMEG_6401的反义寡脱氧核苷酸。以耻垢分枝杆菌MC^2 155单独培养作为对照。观察和绘制细菌生长曲线;测定细胞膜MSMEG_6401编码的磷酸核糖转移酶的生物活性;应用高压气相色谱测定耻垢分枝杆菌细胞壁中糖的含量。结果与对照组相比,试验组耻垢分枝杆菌增殖速度平均降低0.45 OD（P〈0.01）;CFU计数平均延缓0．67Log;在应用等量的膜蛋白的情况下,实验组磷酸核糖转移酶的生物活性降低约40％,试验组和对照组细菌反应细胞壁的糖含量的指标甘露糖-半乳糖,阿拉伯糖比率没有明显差异（2组实验组分别为63％和69．4％;2组对照组分别为66．6％和69．1％）。结论针对MSMEG_6401的反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌的增殖有一定程度的抑制作用,推测反义寡脱氧核苷酸技术有一定抗结核价值;结核分枝杆菌的RV3806c基因或者是其编码产物可能是一个好的抗结核药物作用靶位。