汉滩病毒S片段基因cDNA3‘端非编码区对核蛋白在…

为了探讨汉滩病毒Ｓ片段ｃＤＮＡ３‘端非编码区基因对核蛋白表达的影响，先后构建了两个核蛋白的表达质粒，其中ｐＢＶＳ２２不含非编码区基因，ｐＢＶＳＸ含有３’端非编码区基因，比较两者在大肠杆菌中表达核蛋白的水平后发现３‘端非码区对核蛋白的表达有明显的负调控作用，表达量下降近５０％，可能的原因是非编码区中含有非常丰富的ＡＴ碱基。该研究结果为进一步提高汉滩病毒核蛋白的表达量积累了经验，也为高效表达其它病毒结     

携带人多药抗性基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

从ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ质粒用ＸｈｏⅠ和ＳａｃⅡ将ｍｄｒｌ基因切下后克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ质粒的相应酶切位点获得测序质粒ｐＢＳｍｄｒｌ，测定了ｍｄｒｌ基因的两端序列。用ＥｃｏⅠＣＲＩ和ＸｈｏⅠ从ｐＢ－Ｓｍｄｒｌ切下ｍｄｒｌ基因，定向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ和ｐＭＳＣＶ２．１，得到携带ｍｄｒｌ基因的逆转录病毒载体ｐＬｍｄｒｌＳＮ和ｐＭＳＣＶｍｄｒｌ。用ＰＡ３１７病毒包装细胞包装后三种携带ｍｄｒｌ基因的病毒具有相似的滴度。用此三种病毒分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞后，以ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ载体ｍｄｒｌ基因产物表达量最高。提示Ｈａｒｖｅｙ肉瘤病毒的启动子可能具有较高的强度。     

构建HBV同源启动子断裂X基因质粒

由乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）引起的重症肝炎、肝硬化或肝癌而死亡者高达１００～２００万例／年。在自然宿主中仅有少数几种病毒与场症有关，ＨＢＸ蛋白致癌性较强。ＨＢＶＸ基因是ＨＢＶ４个开架阅读框中最小的一个，对应于１３７４～１８３８位核苷酸之间，编码１５４个氨基酸。该基因表达的ＨＢＸ蛋白为一种反式激活子。ＨＣＣ病人的肿瘤和肿瘤周围组织常可发现断裂Ｘ基因和完整长度Ｘ基因。本文报道利用含有同源启动子质粒ｐ４ａｌｘ和含有断裂ｘ基因质粒ｐＭＴ９Ｔ４１Ａ均建含有同源启动子的中间质粒ｐＸＰ再加上断裂Ｘ基因构建含有同源启动和断裂Ｘ基因的质粒ｐＸＰ９Ｔ４１Ａ，约４．１ｋｂ。并用该质粒与ＳＶ４０Ｌｕｃ共同转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，表明构建的质粒ｐＸＰ９Ｔ４１Ａ能表达ＨＢＸ蛋白，并与含异源启动子和断裂Ｘ基因的质粒ｐＭＴ９Ｔ４１Ａ的反式激活作用相类似。含有同源启动子更类似于ＨＢＶ感染者体内状况。进一步研究该质粒转基因动物中可能的病理变化与肿瘤抑制因子Ｐ５３蛋白的相互关系，与宿主细胞的整合以及细胞转化能力等，可望为ＨＣＣ的发病机理的研究提供一种有用的工具。     

计算机辅助设计使重组ricin—A链在E.coli中的高效表达

基于对螺旋区随机堆积的ＲＮＡ二级结构的预测和密码子偏性计算，建立了ｐＢＶ２２０载体中外源基因高效表达的判别模型。该模型认为，外源基因的表达水平，与其５′端３０３９区域，以及３′端３０３９区域的二级结构自由能具有显著的统计学意义；其次与３′端９ｂｐ的局部密码子偏性相关。据此模型，我们设计了用于克隆表达ｒｉｃｉｎＡ链的引物。将ＰＣＲ扩增的基因克隆入ｐＢＶ２２０载体中，在ＤＨ５α宿主中获得了高效表达（表达水平在２０％以上），而且在ｐＥｘＳｅｃＩ载体系统中亦获得了高效表达。     

HFRSV核蛋白pEF—BOS真核表达载体的构建及表达

本文构建了编码肾综合征出血热病毒核蛋白基因的真核表达载体ｐＥＦ－ＢＯＳ／ＨＴＶ－ＮＰ，经限制性酶切及部分序列分析验证其插入正确。采用ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法瞬时转染ＮＩＨ３Ｔ３２４ｈ后，经间接免疫荧光染色证实，ＮＰ基因可在细胞浆内高水平表达，此结果为进一步研究ＨＦＲＳＶ ＮＰ诱导特异性ＣＴＬ的产生打下了基础。     

托斯卡那病毒核蛋白的表达及纯化

采用聚合酶链反应方法从含托斯卡那病毒Ｓ片段全序列的ｃＤＮＡ质粒ｐＧＥＭ３ＺＳ中获得核蛋白基因片段，通过多克隆接头与５’端含有６个组氨酸残基的ｐＱＥ３０表达载体连接，在大肠杆菌中高效表达核蛋白。     

乙型肝炎病毒表面抗原S基因在人5型重组腺病毒中…

从美国Ｗｙｅｔｈ公司引进ｐＡｄ５△Ｅ３载体，将乙型肝炎病毒表面抗原基因（ＨＢＶＳ）ＰｒｅＳ２＋Ｓ，腺病毒晚期表达盒＋ＨＢＶＳ基因插入Ｅ３区，与ＥｃｏＲＩ消化的Ａｄ５ＤＮＡＡ片段共转染细胞获得重组腺病毒，相应命名为ｒＡｄ５Ｓ，ｒＡｄ５ＭＳ，ｒＡｄ５Ｓ２Ｓ。对所获得的重组病毒进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）分析，证实重组病毒中含有目的基因，用ＥＬＩＳＡ分析ｒＡｄ５ＭＳ的表达量，其病变细胞和上清液滴度均为１：     

应用痘苗病毒体表达猴轮状病毒VP4抗原基因

把编码猴轮状病毒Ｖｐ４抗原的第４基因片段插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｐ７．５启动子下游，构建成在痘苗病毒Ｐ７．５启动子调控下表达猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因的重组质粒ｐＪＳＡ１１７５－Ｖｐ４。应用磷酸钙沉淀技术将ｐＪＳＡ１１７５－Ｖｐ４ＤＮＡ转入ＴＫ－１４３细胞，在ＢＵＤＲ和Ｘ－ｇａｌ 存在下筛选蓝色蚀斑。     

一种N端缺失的rhGM—CSF（7～127）在大肠杆菌中的表…

在ｈＧＭ－ＣＳＦ结构与功能研究的基础之上，通过应用ＰＣＲ介导的缺失与突变和基因重组等技术，构建了ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的三种原核表达载体ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＧＡ，ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＡＡ和ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ。在三种载体内，ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）ｃＤＮＡ的５′端块缺失６个氨基酸，３′端则分别为天然终止密码ＴＧＡ，突变终止密码ＴＡＡ和ＴＧＡ加３′ＵＴＲ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表     

弓形虫P30基因在昆虫杆状病毒载体体系中的初步表达

将弓形虫主要表面抗原（Ｐ３０）基因插入转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３中，然后将重组质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３－Ｐ３０ＤＮＡ与粉纹夜蛾核形多角体病毒ＴｎＮＰＶＤＮＡ共转染培养的草地夜蛾细胞（Ｓｆ），通过同源重组和空斑纯化，得到重组病毒ＴｎＮＰＶ－Ｐ３０．对重组病毒感染的Ｓｆ细胞及银纹夜蛾幼虫进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果显示：Ｐ３０基因在Ｓｆ细胞及虫体中得到了表达，表达产物具有特异的免疫反应性。     

突变和修饰IFN—α 2b基因的5‘和3’端对其在E.coli表达的调控作用

目的 对人ＩＦα２ｂ基因进行突变和修饰,从翻译水平上调控ＩＦα２ｂ基因在大肠杆菌中的表达。方法 采用ＰＣＲ技术,人工合成寡核苷酸引物,对人ＩＦＮ－α２ｂ基因进行了改造;在不改变氨基酸的前提下,将５‘端编码区的四个Ｇ、Ｃ位点突变为Ａ,Ｔ;去除３’端非编码区,将突变和修饰后的基因片段分别克隆入原核表达载体ｐＢＶ３２１;在大肠杆菌中进行表达,对表达产物进行活性效价测定。结果 ３‘端删除非编码区,表达水平     

一种N端缺失的rhGM-CSF(7～127)在大肠杆菌中的表达与调控

在ｈＧＭ－ＣＳＦ结构与功能研究的基础之上，通过应用ＰＣＲ介导的缺失与突变和基因重组等技术，构建了表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的三种原核表达载体ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＧＡ，ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＡＡ和ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ。在三种载体内，ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）ｃＤＮＡ的５′端均缺失６个氨基酸，３′端则分别为天然终止密码ＴＧＡ，突变终止密码ＴＡＡ和ＴＧＡ加３′ＵＴＲ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明三种载体表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的水平分别为２１％，１８．８％和２５％。经过用ＰＣｇｅｎｅ软件和Ｚｕｌｃｅｒ算法分析ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）－３′ＵＴＲｍＲＮＡ的二级结构，表明３′ＵＴＲ在终止密码ＴＧＡ附近形成两个茎－环结构，它可能与ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ载体高表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）有关。表达产物ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）经弱阴离子ＤＥＡＥ交换层析纯化后，纯度达到９２％，比活性为８×１０７Ｕ／ｍｇ。     

应用痘苗病毒载体表达猴轮状病毒VP4抗原基因

把编码猴轮状病毒（Ｒｈｅｓｕｓｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＲＲＶ）Ｖｐ４抗原的第４基因片段插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｐ７．５启动子下游，构建成在痘苗病毒Ｐ７．５启动子调控下表达猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因的重组质粒ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４。应用磷酸钙沉淀技术将ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４ＤＮＡ转入ＴＫ－１４３细胞，在ＢＵＤＲ和Ｘ－ｇａｌ存在下筛选蓝色蚀斑。经３代以上纯化和病毒增殖，获重组病毒Ｒ－ＶＪＳＡ１１７５－Ｖｐ４。蚀斑滴定其满度达到１５×１０１１ＰＦＵ／Ｌ。经核酸杂交试验证明所获得的重组痘苗病毒带有猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因。用重组病毒感染ＴＫ－１４３细胞（或Ｖｅｒｏ细胞），在感染后４８ｈ，用酶免疫法（ＥＩＡ）检测受染细胞上清液和细胞裂解液中表达的猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因均呈阳性反应。本试验为本研究室轮状病毒基因工程疫苗的一部分，为深入了解轮状病毒基因结构及其功能在方法学上奠定了必要的基础。     

中国甲型肝炎病毒毒龙甲株全基因序列的cDNA克隆及序列分析

甲型肝炎是我国主要传染病之一 ,经粪 -口途径传播。甲型肝炎病毒(ＨＡＶ)在组织培养中生长缓慢 ,滴度低 ,限制了甲型肝炎疫苗及诊断试剂的生产。因此有必要克隆我国自己的ＨＡＶ基因 ,为体外表达ＨＡＶ抗原打下基础。ＨＡＶ属小ＲＮＡ病毒科肝病毒属 ,为无包膜的单链ＲＮＡ病毒 ,含有长约 7 5ｋｂ的正链ＲＮＡ ,5′端有长的非编码区 ,3′端有ｐｏｌｙＡ的尾巴。基因组含有一个长的开放读码框架 ,编码 2 2 2 7个氨基酸的大蛋白。基因排列顺序为 :5′ -ＮＣＲ -ＶＰ4-ＶＰ2 -ＶＰ3-ＶＰ1- 2Ａ - 2Ｂ - 2Ｃ - 3Ａ - 3Ｂ- 3Ｃ - 3Ｄ - 3′ＮＣ…     

乙型肝炎病毒pre S基因真核表达质粒诱导小鼠特异性？…

本文构建了含有ＨＢｓＡｇ ｐｒｅ Ｓ区基因的真核表达载体ｐＣＭＶ４－ｐｒｅ Ｓ，经大量提取质粒并纯化后，肌肉注射Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，共免疫３次，间隔两周，结果有３／７的小鼠血清抗ｐｒｅ Ｓ２抗体呈阳性。     

人免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp120基因在大肠杆菌中的高效表达

目的提高人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）包膜糖蛋白ｇｐ１２０基因在原核系统中的表达量。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增出５６０ｂｐ的ＨＩＶ－１ＬＡＶ株ｇｐ１２０Ｎ端基因片段，经ＥｃｏＲⅠ及ＳａｌⅠ酶切后插入高效表达载体ｐＥＴ２８ａ，得到重组质粒ｐＥＴ１２０，并转化表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经诱导高效表达出ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因片段。结果间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验表明，表达产物具有良好的抗原性及特异性。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析结果表明，ｇｐ１２０表达量占总菌体蛋白的５０％。结论在原核系统中高效表达了ＨＩＶ－１ｇｐ１２０基因     

携带人多药抗性基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的…

从ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ质粒用ＸｈｏⅠ和ＳａｃⅡ将ｍｄｒｌ基因切下后克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ质粒的相应酶切位点获得测序质粒ｐＢＳｍｄｒｌ，测定了ｒｄｒｌ基因的两端序列。用ＥｃｏⅠＣＲＩ和ＸｈｏⅠ从ｐＢＳｍｄｒｌ切下ｍｄｒｌ基因，定向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ和ｐＭＳＣＶ２．１，得到携带ｍｄｒｌ基因的逆转录病毒载体ｐＬｍｄｒｌＳＮ和ｐＭＳＣＶｍｄｒｌ。用ＰＡ３１７病毒包装细胞包装后三种携带ｍ     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIv-1)gag前体蛋白片段在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）核心抗体的检测对于ＨＩＶ－１感染者的筛选及确证分析，感染病人的预后分析都具有重要的意义。为此需要获得大量重组核心蛋白。本文利用新型原核表达载体ｐＤＯＧ，在大肠杆菌中高效表达了人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）ｇａｇ基因片段。表达载体利用ＬＰＲ启动子以及Ｔ７噬菌体基因１０（ｇ１０）的核糖体结合位点（ＲＢＳ）来有效起始表达基因的翻译。表达片段ＰＧ１包括ｐ１７Ｃ－端１３ａａ、整个ｐ２４以及ｐ１５Ｎ－端７４ａａ。与ＰＧ１相比ＰＧ２片段不含有ｐ１７序列，并缺失了ｐ２４Ｎ－…     

杆状病毒splt MNPV S1136基因的克隆，表达及其产物功能

计算机分析斜纹夜蛾核多角体病毒 (ＳｐｌｔＭＮＰＶ)基因组序列 ,发现第 136个读码框基因表达产物具有病毒囊膜蛋白的基本特征 .计算机预测的ＳＬ136蛋白氨基酸序列Ｎ端具有信号肽 ,Ｃ端具有跨膜区 ,Ｎ端区还有一个许多病毒融合蛋白共有的卷曲螺旋结构 .通过ＰＣＲ扩增 ,我们克隆了Ｓ1136基因并分别构建了原核表达载体ｐＢＶＳ1136及重组病毒表达载体 .ＳＤＳ -ＰＡＧＥ结果表明Ｓ1136基因在大肠杆菌和昆虫细胞中均获得了较高的表达 .另外 ,我们还构建了一个瞬时表达载体ｐＵＣＳ1136 ,单独转染Ｓｌ-ｚｓｕ - 1细胞后 ,低ｐＨ值环境可诱导…     

表达HBsAg和HBeAg小鼠成纤维胞膜型的建立

目的：建立表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）主要基因产物的细胞克隆，为研究ＨＢＶ的生物学性状及其致病机制提供细胞模型；方法：应用磷酸钙沉淀技术将环化的３．２ｋｂ ＨＢＶＤＡＮ和携带新霉素抗药基因的真核细胞表达载体ｐＣＮＣＸ，导入体外培养的小鼠成纤维ＮＩＨ３Ｔ３细胞；结果：成功地获得表达ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的小鼠成纤维ＮＩＨ３Ｔ３细胞克隆；结论：将ＨＢＶ基因组ＤＮＡ导入体外培养的非肝细胞，ＨＢＶ病毒的ＨＢ