从Cohn法组份Ⅳ中分离纯化人血浆蛋白C

目的探索建立1种串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化蛋白C的方法 ,降低纯化蛋白C的成本,并实现血浆的综合利用。方法 4℃条件下,将Cohn法组份Ⅳ用PBS缓冲液抽提5h,离心(6500g)40min,上清液依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤后,超滤透析;再通过串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析,对蛋白C进行纯化。通过SDS-PAGE鉴定蛋白C的纯度;用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;通过WHO指定的发色底物法和凝固法(一期法)测定蛋白C活性。结果纯化的蛋白C在SDS-PAGE图谱上呈现1条62kD左右的蛋白带;经过离子交换层析,蛋白C的活性回收率为(48.19±9.22)%,纯化倍数为(3.75±0.56)倍;固相化金属螯合亲和层析后,蛋白C活性回收率为(59.61±5.59)%,纯化倍数为(36.79±3.72)倍;蛋白C总活性回收率为(28.77±9.45)%,纯化倍数为(136.64±6.82)倍,比活性为(11.70±0.89)IU/mg。结论串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析可以从Cohn法组份Ⅳ中获得比活性较高的蛋白C浓缩物。     

重组人凝血因子Ⅶ的纯化与鉴定

目的建立重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ)的纯化方法。方法首先将制备并纯化的单克隆抗体与CNBr-Sepharose 6B Fast Flow介质偶联,制备单克隆抗体亲和层析柱,并用rhFⅦ标准品验证层析柱的层析效果;采用DE-AE-Sephadex A-50吸附细胞表达的上清,对吸附产物用Sephadex G-25脱盐柱做脱盐处理;然后用单克隆抗体亲和层析柱做亲和层析;通过SDS-PAGE、Western Blot等试验测定纯化产物的纯度;通过凝血酶原时间(PT)测定纯化产物的促凝活性。结果制备出rhFⅦ单克隆抗体亲和层析介质;细胞表达产物经DEAE-Sephadex A-50、Sephadex G-25脱盐和亲和层析纯化后,经SDS-PAGE鉴定获得了分子量为50kD的单一蛋白洗脱峰;纯化所获得的重组蛋白具有促凝活性,促凝时间(DT)为52s。结论建立了纯化rhⅦ的亲和层析方法 ,为rhFⅦ的研制奠定了基础。     

人D-二聚体分离纯化及鉴定

目的 分离纯度较高和人D-二聚体(D-dimer),为制备抗人D-二聚体单克隆抗体提供可靠抗原.方法 以凝血酶、凝血因子Ⅻ等处理人纤维蛋白原,得到交联纤维蛋白,经纤溶酶消化,得到交联纤维蛋白降解产物(FDP);对FDP作Sephacryl S-300凝胶过滤层析和聚焦层析,分离纯化得到D-dimer.采用免疫比浊法测定D-dimer 含量、染料结合法测定纯化蛋白含量,以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察D-dimer的纯化情况,Weston Blot法确认D-dimer的存在.结果 制备得到的FDP SDS-PAGE图谱显示有多条蛋白条带,1条分子量为180 ～250kD蛋白条带在Western Blot图谱中显示可以被D-dimer单克隆抗体特异性地识别.FDP经Sephacry S-300凝胶层析和聚焦层析后得到纯度较高的D-dimer(n=3):总蛋白含量比为(77.82±7.98)％,蛋白回收率(25.27±6.35)％;SDS-PAGE图谱显示:经过两步层析得到的终产物为分子量180～250 kD的蛋白;Westem Blot证实:经过Sephacryl S-300凝胶层析和聚焦层析处理,最终得到分子量为180～250 kD的终产物可被D-dimer单克隆抗体特异性识别.结论 采用Sephacryl S-300凝胶层析和聚焦层析能够分离纯化获得较高纯度的D-dimer,可作为制备D-dimer单克隆抗体的抗原.     

蝮蛇毒蛋白C激活物的纯化与活性分析

目的探索从国产蝮蛇毒中分离纯化人血浆蛋白C激活物(PCA)的方法及其用于蛋白C的鉴定。方法以国产蝮蛇毒为原料,通过溶解、离心、透析,利用Q Sepharose Fast Flow离子交换层析和Superdex G75凝胶过滤法分离纯化PCA组份。通过SDS-PAGE观察PCA组份的分子量,用发色底物法和凝固法分别测定活化PC(APC)的酰胺酶活性和抗凝活性。结果经两步层析,从蝮蛇粗蛇毒中纯化出PCA组份,SDS-PAGE图谱显示在分子量51 kD左右呈现1条蛋白带;经生物学活性鉴定:该组份在体外能迅速将PC激活为APC,APC的酰胺酶活性(A405)最高约为Protac(唯一商品化的PC激活剂产品)作用的2.8倍,抗凝活性(秒值)最高约为Protac作用的1.4倍,比活性2.20 IU/mg;不同浓度组份激活PC的酰胺酶活性和抗凝活性均随组份浓度的增大而升高,有明显的量效关系。结论采用离子交换层析和凝胶过滤法,可以从国产蝮蛇粗蛇毒中分离纯化出PCA组份,该组份具有较强的激活PC的能力,其生物活性与浓度呈正相关。     

人α1微球蛋白基因的质粒载体构建和表达

目的构建表达人α1-微球蛋白(α1-microglobulin,1α-MG)的重组质粒并纯化目的蛋白。方法从正常人肝脏中提取cDNA,RT-PCR扩增α1-mg基因,将扩增产物用NdeI/BamHI消化,切下目的基因片断克隆到质粒pET-15b中,构建重组pET-15b,转化入E.coliDH5α中,经酶谱分析和测序,鉴定出正确的重组质粒pET-15b。将重组pET-15b转化入宿主菌E.coliBL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达。提取细菌总蛋白质进行SDS-PAGE分析和蛋白印迹鉴定。利用重组蛋白中的6个组氨酸(His)组成的“标签”进行亲和层析,纯化重组蛋白。结果筛选到携带有α1-mg基因的正确重组质粒pET-15b,重组蛋白在BL21(DE3)pLysS中得到了诱导表达,含量达20mg/L细菌培养液。经一步金属螯合亲和层析纯化后,重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出均一的单一条带。结论重组质粒pET-15b的构建和有活性的酶蛋白的表达成功说明,PCR扩增获得的α1-mg基因具有完整的阅读框架,亲和层析纯化后可得到活性和纯度均较高的目的蛋白,为研制国产免疫比浊法试剂盒打下基础。     

HAC70抗原肽复合物诱导的对艾氏腹水瘤细胞杀伤活性的实验研究

目的观察从艾氏腹水瘤小鼠瘤细胞中提取的热休克蛋白70-抗原肽复合物(HAC70)诱导的抗肿瘤免疫效应,探讨其临床应用。方法提取热休克后的小鼠艾氏腹水瘤细胞经肝素-琼脂糖亲和层析纯化,制成热休克蛋白-肽复合物疫苗,以体内免疫法检测HAC70的抑瘤作用,3H-TdR掺入释放法检测脾细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果经HAC70免疫的荷瘤小鼠皮下肿瘤结节平均重1.26±0.4 g,较对照组(3.14±0.56 g)明显减轻(P<0.05);当效靶比为200:1时,免疫组脾细胞杀伤活性为49.25±11.25%,显著高于对照组(18.50±9.95%,P<0.01)及荷瘤组(25.75±8.38%,P<0.01)。结论经肝素-琼脂糖亲和层析纯化的HAC70可通过诱导机体产生特异性杀伤艾氏腹水瘤细胞的活性,明显抑制荷瘤小鼠艾氏腹水瘤的生长。     

人凝血因子V的纯化

目的 分离纯化人血浆中凝血因子V(FV),为研制FV单克隆抗体提供抗原.方法 在1 L新鲜冰冻血浆中加入酶抑制剂Benzamidine hydrochloride、二异丙基氟磷酸(DFP)和胰蛋白酶抑制剂,使其终浓度分别达到2mmol/L、1 mmol/L和50 mg/L;采用柠檬酸钡吸附、聚乙二醇6000分级沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换层析和Sephacryl-S300凝胶过滤层析,对血浆中FV进行分离纯化;采用凝血测定一期法检测FV活性;采用紫外分光光度法测定纯化FV的蛋白含量;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察FV的纯化情况.结果 经过对血浆前处理和两步层析后,FV活性回收率为(11.21±3.54)%,比活性为(30.46±0.31)U/mg,浓缩倍数为(2 538.33±25.83)倍(n=3);SDS-PAGE图谱显示:原料血浆添加DFP的离子交换层析样品较之未加DFP的样品在330 kD处有更粗更清晰的蛋白条带,最终纯化的FV样品仅在330 kD附近有1条较深的蛋白条带.结论 本FV纯化方法能够较有效地浓缩血浆中的FV.     

免疫亲和层析法纯化蛋白C

研制一种蛋白 C(PC)的特异单克隆抗体(McAb),它可以识别在钙离子存在与否的条件下呈现不同构象的 PC 抗原,将其偶联至 Sepharose 4B 凝胶上,组成亲和层析柱。凝胶上的 McAb 能连接无钙离子血浆中的 PC,这种免疫纯化法一步即可达到12000倍的纯化。PC 成品的比活性为180～230U/mg,在非还原的 SDS-PAGE 图谱上呈现两条带(α-PC 和β-PC),在还原的 SDS-PAGE 图谱上呈现5条带(α-SC-PC,β-SC-PC,α-HC,β-HC 和 LC)。     

CRIF1基因的克隆表达

目的克隆表达CRIF1基因蛋白,为进一步研究该基因在骨髓微环境诱导白血病细胞G0/G1期阻滞过程中作用以及相关机制奠定基础。方法自HL60细胞中提取总RNA、逆转录,并与pET32a构建融合蛋白表达载体、蛋白原核表达载体;优化蛋白表达诱导条件,蛋白纯化;SDS-PAGE、Western Blot检测目的蛋白的表达。结果克隆并经测序获得全长744bp的CRIF1基因,成功构建融合蛋白表达载体和原核表达载体,优化并纯化蛋白;SDS-PAGE在42.5 kD处获得目的条带,Western Blot检测确定为CRIF1表达蛋白。结论成功克隆表达出CRIF1基因蛋白。     

激动样活性抗α1-肾上腺素受体胞外第二肽段抗体的制备

目的:制备提纯抗α1-肾上腺素受体抗体,并对其生物学活性进行鉴定。方法:实验于2003-02/12在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。①选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只,取4只用于抗α1-肾上腺素受体抗体的制备。将合成肽用戊二醛与牛血清白蛋白偶联,透析除去未结合的多肽,与等体积的弗氏佐剂混匀后于0,2,4,6,8周对大鼠进行免疫处理,4只/次。另2只作为未免疫对照。免疫前后鼠尾采血并用ELISA法检测抗体的滴度,α1-肾上腺素受体抗原的包被浓度50mg/L,血清稀释度从1∶40开始倍比稀释,辣根过氧化物酶酶标抗体稀释度为1∶2000。用阳性血清与阴性血清的吸光度之比来判定,比值≥2.1为阳性。免疫结束后采血,离心取上清,与等体积的生理盐水混合后逐滴加入饱和硫酸铵至浓度达50%,于磷酸盐缓冲液中透析。②以合成的α1-肾上腺素受体胞外第二肽段多肽为抗原,采用免疫亲和层析的方法,纯化用合成肽免疫大鼠产生的抗α1-肾上腺素受体多克隆抗体,用Bradford对抗体进行定量,十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳检测抗体纯度,以ELISA法、免疫组化、免疫印迹方法进行抗体免疫活性分析,用激光共聚焦测量细胞内游离钙浓度变化以检测抗体的激动样活性。结果:实验选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只,全部进入结果分析。①抗α1-肾上腺素受体抗体的产生和纯度:抗α1-肾上腺素受体抗体在大鼠免疫后2周开始产生,8周后达到很高滴度。提纯的抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定有较高的纯度。②纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的免疫学活性:抗体浓度为0.1g/L时滴度约1∶2560,并可结合培养平滑肌细胞及心肌组织上的α1-肾上腺素受体,具有较好的反应原性。③纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的生物学活性:抗α1-肾上腺素受体抗体可显著升高分离的成年大鼠心肌细胞游离钙离子浓度,高达(139.6±15.5)%。该抗体的作用可被Prazosin阻断,降至(28.9±12.64)%,具有特异性及激动样活性。结论:采用自制的免疫亲和层析柱可将合成肽免疫产生的具有激动样活性的抗α1-肾上腺素受体抗体纯化。     

亲和层析法分离纯化人心肌肌钙蛋白Ⅰ

目的从人心肌组织提取纯化心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）。方法采用离子交换层析和疏水层析从兔骨骼肌中提纯肌钙蛋白C（TnC）,制备连接有TnC的亲和层析介质,通过亲和层析法从人心肌组织中直接提纯cTnI。纯化的cTnI采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹法进行鉴定。结果从10 g人心肌组织中共提纯2.44 mg cTnI,SDS-PAGE图上显示为单一条带,表观相对分子质量约为29000。免疫印迹法结果表明cTnI单克隆抗体能够特异性识别提纯的cTnI,纯化的cTnI SDS-PAGE和免疫印迹法结果均与商品化cTnI结果一致。结论具有免疫活性的天然cTnI的获取有助于急性心肌梗死诊断试剂盒的研制。     

亲和层析法分离纯化人心肌肌钙蛋白Ⅰ

目的从人心肌组织提取纯化心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)。方法采用离子交换层析和疏水层析从兔骨骼肌中提纯肌钙蛋白C(TnC),制备连接有TnC的亲和层析介质,通过亲和层析法从人心肌组织中直接提纯cTnI。纯化的cTnI采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法进行鉴定。结果从10 g人心肌组织中共提纯2.44 mg cTnI,SDS-PAGE图上显示为单一条带,表观相对分子质量约为29000。免疫印迹法结果表明cTnI单克隆抗体能够特异性识别提纯的cTnI,纯化的cTnI SDS-PAGE和免疫印迹法结果均与商品化cTnI结果一致。结论具有免疫活性的天然cTnI的获取有助于急性心肌梗死诊断试剂盒的研制。     

应用层析法从冷沉淀制备一种治疗用高纯vWF浓缩物

本文介绍了一种以冷沉淀为原料通过三步层析过程制备高纯度的(?)WF 浓缩物的方法。冷沉淀重溶后通过氢氧化铝吸附和溶剂净化剂(SD)病毒灭活后,进行第一步DEAE-fractogel TSK 650M 层析,收集0.15M NaCl 的洗脱组份,得到去掉F■Ⅷ和纤维蛋白原等杂蛋白的vWF 粗制品,再进行第二步DEAE—fractogel TSK 650M 层析,以进一步提纯vWF,收集0.17M NaCl 的洗脱组份,其vWF 瑞斯托霉素副因子(vWF:RCo)活性超过100U/ml,最后进行Gelatin-Sepharose 层析,去掉纤维结合蛋白,进一步提纯vWF。冷沉淀的抗原和胶原结合活性(CBA)回收率分别为18%和40%,提炼出来的vWF的纯化倍数为血浆的10000倍以上,免疫比浊法和SDS-PAGE 分析未发现纤维蛋白原、纤维结合蛋白、免疫球蛋白和白蛋白等杂蛋白,其高分子量和中等分子量组份含量与血浆相似或高于血浆,CB 活性(CBA)与抗原之比率为1.69,在灌流系统中促血小     

人血小板第4因子和P—选择素的纯化

目的用单克隆抗体亲和层析方法从人血小板破碎液中纯化血小板因子4和P-选择素.方法将单克隆抗体SZ-95-IgG和SZ-51-IgG分别与溴化氰活化的Sepharose4B凝胶连接成SZ-95-IgG-Sepharose4B和SZ-51-IgG-Sepharose4B亲层析柱,人血小板破碎液经此亲和层析柱上样后,再经FPLC系统获得的所要的产品,产品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度,用点杂交鉴定其生物学活性.结果SZ-95-Sepharose4B和SZ-51-Sepharose4B亲和层析柱的偶联率分别72%和68%,每1ml(约1×109个血小板)血小板破碎液中可以纯化到18μgPF4和12μgP-selectin,所得产品经SDS-PAGE,在分子量约为12kD和140KD处各显单一的蛋白区带,经点杂交印迹显示产品分别与单抗SZ-95和SZ-51反应显带.结论用单克隆抗体亲和层析柱纯化的PF4和P-selectin产品得率高、纯度高、活性好.     

组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原的原核表达及初步临床应用

目的 通过克隆人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,构建重组表达质粒,获得具有免疫活性的纯化重组蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)中的抗Jo-1抗体的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌DH5 α和BL21(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NTA树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(WB)进行免疫活性鉴定;应用表达蛋白建立间接ELISA法.同时用该方法检测30名正常献血者,30例SLE,30例类风湿关节炎(RA),10例原发性干燥综合征(SS),75例PM/DM患者血清中抗Jo-1抗体.结果 经重组质粒测序和酶切结果证实,Jo-1目的基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;经SDS-PAGE检测显示,表达产物在相对分子质量55 000处有一明显的蛋白表达条带;WB分析表明,重组蛋白具有人Jo-1抗原反应性;间接ELISA法检测标本血清结果显示,PM/DM组中抗Jo-1抗体的阳性率为28%,非PM/DM组(疾病对照组及正常对照组)均为阴性,其差异均有统计学意义(x2=31.84,均P＜0.01).结论 成功克隆了人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,其可在大肠杆菌中表达,且重组自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化融合蛋白建立的间接ELISA法检测PM/DM抗Jo-1抗体具有较好的特异性.     

激动样活性抗α1-肾上腺素受体胞外第二肽段抗体的制备

目的：制备提纯抗α1-肾上腺素受体抗体，并对其生物学活性进行鉴定。 方法：实验于2003-02／12在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。①选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只，取4只用于抗α1-肾上腺素受体抗体的制备。将合成肽用戊二醛与牛血清白蛋白偶联，透析除去未结合的多肽，与等体积的弗氏佐剂混匀后于0，2，4，6，8周对大鼠进行免疫处理，4只／次。另2只作为未免疫对照。免疫前后鼠尾采血并用ELISA法检测抗体的滴度，α1-肾上腺素受体抗原的包被浓度50mg／L，血清稀释度从1：40开始倍比稀释，辣根过氧化物酶酶标抗体稀释度为1：2000。用阳性血清与阴性血清的吸光度之比来判定，比值≥2．1为阳性。免疫结束后采血，离心取上清，与等体积的生理盐水混合后逐滴加入饱和硫酸铵至浓度达50％，于磷酸盐缓冲液中透析。②以合成的α1-肾上腺素受体胞外第二肽段多肽为抗原，采用免疫亲和层析的方法．纯化用合成肽免疫大鼠产生的抗α1-肾上腺素受体多克隆抗体，用Bradford对抗体进行定量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳检测抗体纯度，以ELISA法、免疫组化、免疫印迹方法进行抗体免疫活性分析，用激光共聚焦测量细胞内游离钙浓度变化以检测抗体的激动样活性。 结果：实验选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只，全部进入结果分析。①抗α1-肾上腺素受体抗体的产生和纯度：抗α1-肾上腺素受体抗体在大鼠免疫后2周开始产生，8周后达到很高滴度。提纯的抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定有较高的纯度。②纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的免疫学活性：抗体浓度为0．1g／L时滴度约1：2560，并可结合培养平滑肌细胞及心肌组织上的α1-肾上腺素受体，具有较好的反应原性。（3）纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的生物学活性：抗α1-肾上腺素受体抗体可显著升高分离的成年大鼠心肌细胞游离钙离子浓度，高达（139．6&;#177;15．5）％。该抗体的作用可被Prazosin阻断，降至（28．9&;#177;12．64）％，具有特异性及激动样活性。 结论：采用自制的免疫亲和层析柱可将合成肽免疫产生的具有激动样活性的抗α1-肾上腺素受体抗体纯化。     

重组人干扰素α8在大肠杆菌中高可溶性表达及纯化

目的:在大肠杆菌表达体系中获得产量较高且有活性的重组人干扰素α8蛋白.方法:重组人干扰素α8的cDNA通过基因合成和PCR获得,构建重组人干扰素α8表达菌株.结果:表达的目的蛋白多以可溶性形式存在,占总上清液的52%,表达蛋白带有组氨酸标签经SDS-PAGE及Western Blot分析证实为重组人干扰素α8,通过Ni2+螯合柱及Q Sepharose FF柱层析纯化,纯度可达95.6%.结论:通过对重组人干扰素α8的cDNA序列进行适优化组合及选择合适的载体,在大肠杆菌表达体系中可获得产量较高且有活性的重组人干扰素α8蛋白.     

幽门螺杆菌临床分离株尿素酶基因B的原核表达、纯化及免疫活性

目的:在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌临床分离株尿素酶B(UreB),纯化重组蛋白并分析其免疫活性.方法:将pGEX-4T-1-UreB重组菌BL21复舒,挑单菌落接种于含氨苄的LB培养基中.0.5 mmoL异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,使用纯化的重组蛋白免疫小鼠.ELISA检测血清抗体效价,并使用感染患者血清进行Western-blotting鉴定重组蛋白反应原性.结果:SDS-PAGE示在约87 kD相应分子量可见融合蛋白表达,产物主要在表达上清以可溶形式存在,纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答,ELISA检测特异性IgG效价为1:51 200.Western blotting示重组蛋白能被幽门螺杆菌感染患者血清识别.结论:UreB在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有较好的免疫原性及反应原性.     

HPV16型L1蛋白优势表位原核表达及其血清学验证

目的利用原核系统对人乳头瘤病毒(HPV)16型L1蛋白优势抗原表位进行重组表达与纯化,并检测血清学反应。方法对HPV16型L1蛋白优势抗原表位进行全基因合成,将核酸片段克隆至pET-DsbC原核表达载体,重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用亲和层析对表达产物进行纯化,采用免疫印迹法、酶联免疫吸附试验(ELISA)验证重组蛋白的免疫学活性。结果成功构建了pET-DsbC-HPV16 L1表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中实现了稳定的可溶性表达。重组DsbC-HPV16 L1蛋白经亲和层析进行纯化,相对分子质量为45 000,纯度为95%,重组蛋白纯化得率为22%。免疫印迹法结果显示,重组DsbC-HPV16 L1蛋白可与HPV16型阳性血清产生特异的抗原-抗体反应,与重组DsbC蛋白或健康人血清无交叉反应,具有良好的特异性。ELISA结果显示,重组DsbC-HPV16 L1蛋白与HPV16型阳性血清有较强的免疫反应性,A450 nm均值为0.56,高于健康人血清和磷酸盐缓冲液(PBS)阴性对照(A450nm均值分别为0.24和0.21)。结论采用原核表达系统实现了HPV16型L1蛋白优势抗原表位的可溶性高表达,获得的重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫学活性。     

KSHV ORF73C基因原核表达产物的纯化与免疫原性分析

目的 纯化卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏相关核抗原(LANA)羧基端编码基因ORF73C原核表达蛋白并分析其免疫原性。方法 含重组质粒pGEX-6p-1 ORF73C(pORF73C)的宿主茵BL21经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用glutathiones Sepharose 4B亲和层析柱纯化表达产物后，以重组3C蛋白酶对融合蛋白进行解离，SDS-PAGE对表达及纯化产物进行鉴定。以纯化的ORF73C蛋白免疫小鼠获得抗血清，建立ELISA检测其免疫原性。结果 SDS-PAGE显示蛋白条带大小分别为49000和23000，与预期的ORF73C融合蛋白及ORF73C蛋白分子量大小一致；ELISA检测显示，抗ORF73C多抗免疫反应性高于未免疫小鼠血清2倍以上。结论 成功获得了纯化的ORF73C蛋白，经ELISA显示其有较强免疫原性。