在大肠杆菌中高效表达人Ⅰ型免疫缺陷病毒p24蛋白

为深入研究人Ⅰ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ—１）衣壳蛋白ｐ２４的结构与功能,制备抗Ｐ２４单克隆抗体及其诊断抗原,将编码ＨＩＶ－１ｐ２４蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段,克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游,构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４,并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达,其产物为３０ｋＤａ的ｓ１０－ｐ２４融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组Ｐ２４蛋白均抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ—１阳性血清发生特异性反应,具有较好的抗原性,对研究开发ＡＩＤＳ诊断试剂和基因工程疫苗具有重要意义。     

恶性疟原虫疫苗研究X.MSP1中类表皮生长因子1与PfCMR基因？…

目的 克隆并表达恶性疟原虫重组复合抗原，为疟疾疫苗研究奠定基础。方法 将恶性疟原虫ＭＳＰ１中类表皮生长因子１（ＥＧＦ－１）基因与人工化学合成的抗原复合基因ＰｆＣＭＲ串接，插入高效非融合型蛋白表达载体ｐＢＶ２２０，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，转化菌经４２℃热诱导表达，表达产物用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ分析。结果 构建成功重组质粒ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＥＧＦ－１，经热诱导后表达出含外     

赖型钩体重组质粒及表达保护性抗原,p68的研究

目的　寻找钩体病基因工程疫苗保护性抗原候选。方法　 （１） 鸟枪法构建赖型钩体０１７ 株基因库; （２） α互补、 Ｄ Ｎ Ａ 原位杂交筛选重组质粒; （３） Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交行 Ｄ Ｎ Ａ 同源性分析; （４） 双脱氧链中止测重组 Ｄ Ｎ Ａ 序列及与外膜蛋白基因 （ｏｍｐ） 匹配; （５） Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导重组子表达; （６） 免疫印迹、 Ｍ Ａ Ｔ、 Ｅ Ｉ Ａ、 Ｍ Ｔ Ｔ 检测表达蛋白抗原特性及 Ｉ Ｌ—２ 、 Ｉ Ｌ—６ 活性; （７） 纯化表达蛋白ｐ６８ 进行豚鼠主动免疫 攻击实验, 观免疫保护性。结果　 （１） 重组质粒ｐ Ｄ Ｊ Ｈ２ （ 亚克隆ｐ Ｄ Ｊｔ） 插入片段１９ｋｂ , 与各致病钩体不同片段 Ｄ Ｎ Ａ 高度同源; （２） 序列测定插入片段实际１８１１ｂｐ , 推测有２ 个读框 （ Ｏ Ｒ Ｆ） , 各有启动子、终止密码。查 Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ｅ Ｍ Ｂ Ｌ 无类似序列; （３） 表达蛋白分子量６８ｋ Ｄ （ｐ６８） ; （４） ｐ６８ 是胸腺依赖性 （ Ｔ Ｄ） 抗原,有良好抗原特性, 抗血清效价１ ： ５２４２８８ , （ Ｅ Ｉ Ａ） 具很强的动物免疫保护作用。结论　 （１） ｐ６８ 编码基因是致病钩体保护性抗原基因; （２） ｐ６８ 是致病钩体外膜保护性抗原,     

结核分枝杆菌热休克蛋白HtpG基因的原核表达与鉴定

目的 克隆并表达结核分枝杆菌 ＨｔｐＧ 分子，并鉴定其免疫反应性。 方法 采用聚合酶链式反 应扩增结核分枝杆菌 Ｈ３７Ｒａ ＨｔｐＧ 基因，并克隆至 ｐＥＴ２２ｂ 质粒，测序筛选到重组成功的质粒。 重组质粒 ｐＥＴ２２ｂ － ＨｔｐＧ 转化大肠埃希菌 ＢＬ２１（ＤＥ３），表达的 ＨｔｐＧ 重组蛋白通过镍柱纯化。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定表达 蛋白，并使用 ＨｔｐＧ 重组蛋白经 ＥＬＩＳＡ 法检测肺结核患者血清特异性抗体水平。 结果 成功构建了 ｐＥＴ２２ｂ － ＨｔｐＧ 重组质粒； 在大肠埃希菌中表达出分子质量约 ７３ｋＤａ 的重组蛋白。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定该重组蛋白具 有良好免疫反应性，ＥＬＩＳＡ 法检测肺结核患者血清中存在特异性抗 ＨｔｐＧ 抗体。 结论 在大肠埃希菌内成功 表达 ＨｔｐＧ 重组蛋白，为将该蛋白用于结核免疫诊断试剂的研制奠定了基础。     

恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ抗原基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白的活性鉴定研究

目的恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｒｉｃｈｐｒｏｔｅｉｎⅡ,ＨＲＰⅡ）是疟原虫红内期生活史过程中从感染红细胞分泌至血浆中的水溶性抗原,是重要的诊断用抗原。本文通过实现恶性疟原虫ＨＲＰⅡ在大肠杆菌中的表达,为研制用于疟疾诊断的抗ＨＲＰⅡ单克隆抗体奠定基础。方法将含有ＨＲＰⅡ抗原基因的重组表达质粒ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ用钙法转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,重组子经聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＢａｍＨＩ与ＢｇｌⅡ双酶切鉴定。重组子ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ／ＢＬ２１（ＤＥ３）在２８℃条件下,用１ｍＭＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析表达产物。结果成功构建ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ重组质粒,在低温条件下经ＩＰＴＧ诱导,ＨＲＰⅡ呈可溶性、非融合性表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明表达产物的分子量约３３ｋＤａ,薄层扫描显示表达蛋白占菌体总蛋白的２０．７６％。Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹表明,表达产物能被抗ＨＲＰⅡ人工合成九肽单克隆抗体特异识别。结论恶性疟原虫ＨＲＰⅡ在原核表达系统ｐＥＴ８ｃ／ＢＬ２１（ＤＥ３）中获得成功表达,为基因工程大规模制备生产ＨＲＰⅡ抗原奠定基础     

重组质粒pGEX—6P—1／Sj—FABPc的构建及在大肠杆菌中的表达

目的 构建基因工程菌株、获得重组蛋白Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ（日本血吸虫脂肪酸结合蛋白）。方法 用ＰＣＲ法从日本血吸虫ｃＤＮＡ文库中扩增Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ基因片段，再将该片段重组于ｐＧＥＭ－Ｔ中并进行ＤＮＡ测序鉴定，经酶切后将目的片段构建成重组质粒ｐＧＥＸ－６Ｐ－１／Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ，转化于大肠杆菌ＢＬ２１，ＩＰＴＧ诱导表达。用Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ＾ＴＭ ４Ｂ亲和层析柱对表达产物进行纯     

日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S—转移酶DNA疫苗的研究及其保 …

本文对大陆株日本血吸虫２６ｋＤａ谷胱甘肽Ｓ－转移酶（Ｓｊ２６ＧＳＴ）的ＤＮＡ疫苗进行研究，并观察了其免疫保护效果。分别构建含Ｓｊ２６ＧＳＴ基因的重组质粒ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６，采用脂质体介导的基因转移将ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６分别导入ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞，用免疫荧光法（ＩＦＡ）证实Ｓｊ２６ＧＳＴ在真核细胞中的表达。分别将ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６及ｐＢＫ－ＣＭＶ肌注     

编码弓形虫ROP1蛋白基因的体外扩增、克隆及在E.coli中的表达

目的构建弓形虫棒状体蛋白（ＲＯＰ１）基因重组质粒并在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达。方法用ＲＨ株接种小鼠,收集腹水,纯化速殖子,抽提基因组ＤＮＡ;据ＲＯＰ１基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从ＲＨ株基因组ＤＮＡ中扩增编码ＲＯＰ１的基因片段,插入ｐＢＶ２２０质粒,转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞,于氨苄阳性ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,酶切鉴定;经温度诱导在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果ＲＯＰ１基因体外扩增产物大小与预期值相符,约７５６ｂｐ;构建成功ｐＢＶ２２０－ＲＯＰ１重组质粒;ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹显示特异蛋白条带的分子量约４３ｋＤ,表达产量约占菌体蛋白１３．２３％。结论从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取ＲＯＰ１基因,并成功构建ｐＢＶ２２０－ＲＯＰ１重组质粒,诱导表达ＲＯＰ１非融合蛋白,为进一步分离纯化、用于对弓形虫侵入机制及免疫特性的研究做好准备。     

我国首例HIV—2感染者的确认

目的 ＨＩＶ－２抗体的确认。方法 用多种血清学检测方法测定一份可疑ＨＩＶ－２抗体，并用ＨＩＶ－２特异性免疫印迹试剂盒确认。结果 从一个科特迪瓦回国人员采集的血液标本经ＧＡＧＴ（）ＧＢＣ，ＨＩＶ－１＋２）和ＥＬＩＳＡ（Ｖｉｒｏｎｏｓｔｉｃａ，ＨＩＶ－１＋２）检测为ＨＩＶ抗体阳性，使用ＨＩＶ－１＋２免疫印迹试验（ＷＢ）证实该血清衾 ＨＩＶ－２特异性抗体，其中Ｌｉａ ＴｅｋⅢＷＢ出现ＨＩＶ－１ｐ２４和Ｈ     

在重组痘苗病毒中共表达HIV一1 env与hIL一6基因

本实验以ＨＩＶ－１ｅｎｖ与ｈＩＬ－６基因在重组痘苗病毒中的共表达研究为目的,将痘苗病毒复制非必需区血凝素（ＨＡ）基因作为侧翼,把编码人白细胞介素６的基因片段克隆真核表达质粒ｐＪ３８ｅｎｖ的下游,构建成含有ＨＩＶ－１ｅｎｖ与ｈＩＬ－６两种外源基因因的重组表达质粒ＰＪ３８Ｅ－ＩＬ６,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选,获得了重组痘苗病毒ｖＪ３８Ｅ－ＩＬ６、经间接免疫荧光试验,Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅ     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1-17区基因的原核表达、纯化及表达产物鉴定

目的　为进一步研究和应用恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１ 的１７区基因（ＭＳＰ１－ １７）,本文原核表达了ＦＵＰ株ＭＳＰ１ 的１７ 区基因,并纯化及鉴定了表达蛋白。方法　将ＭＳＰ１－ １７ 基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １,形成ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７。ＩＰＴＧ诱导ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７ 转化的ＢＬ２１菌,纯化并用ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体鉴定表达产物。结果　成功地构建了ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７,转化菌经诱导表达出与ＧＳＴ融合的蛋白（约４０ＫＤ）,纯化后纯度达７２％ ,ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体可识别表达蛋白。结论　成功表达并纯化了ＭＳＰ１－ １７ 蛋白,为深入研究和应用ＭＳＰ１－ １７ 打下基础     

弓形虫主要表面抗原基因（P30）大肠杆菌中以融合蛋白形 …

根据已发表的弓形虫主要表面抗原（Ｐ３０）的基因的序列,设计合成了一对引物,通过聚合酶链反应,扩增出Ｐ３０基因,将Ｐ３０基因克隆入表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１中,经酶切鉴定后,阳性重组质粒转化宿主菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）,宿主菌经ＩＰＴＧ诱导表达后,产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析。结果显示,Ｐ３０基因以融合蛋白的形式表达,实物具有特异的免疫反应性。     

人乳头瘤病毒16型晚期基因L1的原核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建人类乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型晚期基因Ｌ１的原核表达质粒,以期从中选出能够高效表达ＨＰＶ１６Ｌ１的重组子,为进一步表达Ｌ１蛋白奠定基础。方法 应用定向克隆策略,将ＨＰＶ１６Ｌ１基因分别克隆到原核表达载体ｐＴｒａｃ９９Ａ和ｐＥＴ－２１ｃ中。结果 通过酶切鉴定选出了重组子ｐＴｒｃ９９Ａ－ＨＰＶ１６Ｌ１和ｐＥＴ－２１ｃ－ＨＰＶ１６Ｌ１。结论 ＨＰＶ１６Ｌ１的原核表达质粒构建成功。     

弓形虫主要表面抗原基因( P30)大肠杆菌中以融合蛋白形式的初步表达(英文)

根据已发表的弓形虫主要表面抗原（ Ｐ３０）的基因序列,设计合成了一对引物,通过聚合酶链反应,扩增出 Ｐ３０ 基因,将 Ｐ３０ 基因克隆入表达质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｅ Ｘ１ 中,经酶切鉴定后,阳性重组质粒转化宿主菌 Ｊ Ｍ １０９（ Ｄ Ｅ３ ）,宿主菌经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导表达后,产物进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ和 Ｗ ｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果显示, Ｐ３０ 基因以融合蛋白的形式表达,表达产物具有特异的免疫反应性。     

结核分支杆菌katG蛋白的高表达与纯化

目的 表达与纯化结核分支杆菌ｋａｔＧ蛋白,为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础。方法 将含有ｋａｔＧ基因的;ｐＥＴ２４ｂ－ｋａｔＧ表达载体转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,在异丙基硫代β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导下表达,分别对不同诱导时间的表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ以及考马斯亮蓝染色。获得稳定的高表达菌株后采用Ｘｐ;ｒｅｓｓ＾ＴＭ蛋白纯化系统对超声破菌液进行纯化。     

HBV反义全基因真核细胞表达载体的构建及在肝癌细胞内的表达

１．材料与方法：乳哺动物细胞表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ,长约４．５ｋｂ,带有Ｔ_７公用序列。ｐＣＰ１０是ｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ位点中插入双拷贝头尾相接的ＨＢＶａｙｗ亚型全基因ＨＢＶＤＮＡ重组质粒。ＰＣＲ引物ＸＩ１：１４２８－１４４８ｎｔ５'ＣＧＴ　ＣＣＣＧＴＣ　ＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣＣ３',ＸＩ_２：１６７２－１６５３ｎｔ５'ＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴＡＡＧ３'。人肝癌细胞系ＳＭＭＣ－７７２１,出上海细胞所提供。将ＥｃｏＲＩ酶切后回收的全基因ＨＢＶ片段。在Ｔ_４ＤＮＡ连接酶作用下,与ＥｃｏＲＩ酶切…     

恶性疟原虫海南FCC1/HN株环子孢子蛋白(CSP)基因的克隆与表达

目的　为疟疾疫苗的研制提供靶抗原。方法　根据恶性疟原虫ＩＭＴＭ２２ 株７Ｇ８ 克隆环子孢子蛋白基因编码区序列, 设计一对引物, 采用ＰＣＲ技术从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央重复区和Ⅱ区片段, 全长１－０８ｋｂ; 纯化扩增产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后, 定向克隆入ｐｃＤＮＡ３ 载体, 转化大肠杆菌ＴＧ１ 株, 重组克隆经筛选后, 用ＰＣＲ 扩增和ＨｉｎｄⅢ＋ ＢａｍＨ Ⅰ双酶切进行鉴定： 用磷酸钙贴壁细胞转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＳＰ导入ＨｅＬａ细胞, 用Ｇ４１８ 筛选出稳定分泌ＣＳＰ抗原的阳性细胞克隆; 将阳性细胞克隆系扩大培养并用Ｇ４１８ 加压, 以表达重组ＣＳＰ, 分离细胞培养上清和培养细胞, 进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。结果　（１） 从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出ＣＳＰ基因Ⅰ区, 中央重复区和Ⅱ区编码序列;（２） 将扩增的目的片段正向插入ｐｃＤＮＡ３ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点; （３） 在人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ 细胞中表达重组ＣＳＰ抗原, 其分子量为３８－３ｋＤａ, 蛋白扫描分析表达量占细胞培养上清液中蛋白总含量的１５－７７％ 。结论　成功构建真核表达系统ｐｃＤＮＡ３     

重组日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶蛋白质表达、纯化及特性分析

磷酸丙糖异构酶（ＴＰＩ）是已被公认的血吸虫病疫苗候选分子之一,本研究将日本血吸虫中国大陆株ＴＰＩ分子基因ＤＮＡ片段定向克隆到表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３（编码２６ｋＤａ的ＧＳＴ蛋白）中,构建重组表达质粒,然后转化大肠杆菌ＢＬ２１感受态细胞,阳性克隆用ＩＰＴＧ诱导,阳性菌株可表达分子量约５５ｋＤａ的融合蛋白（ＧＳＴ－ＴＰＩ）,此融合蛋白可与ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ结合成复合物,用凝血酶切割融合蛋白复合物,获得分子量约２８ｋＤａ的重组表达ＴＰＩ分子。重组ＴＰＩ分子具有磷酸丙糖异构酶活性,并能被日本血吸虫重感染兔血清,血吸虫病人血清所识别。重组ＴＰＩ免疫家兔产生抗体的效价最高可达１∶２５６００,该血清抗体能识别日本血吸虫中国大陆株成虫抗原中分子量约２８ｋＤａ的蛋白条带。     

HIV抗体ELISA阳性标本蛋白印迹确证试验的研究

用获ＦＤＡ准许的美国ＣａｍｂｒｉｄｇｅＢｉｏｔｅｃｈ公司ＨＩＶ－１蛋白印迹试剂盒（ＷＢ）对ＨＩＶ－１／２抗体诊断试剂盒（ＥＬＩＳＡ）初筛阳性的６２份血清标本做确证试验。一次性确证ＨＩＶ抗体阳性者８名；阴性者１２名；不确定者４２名。对８名ＨＩＶ抗体不确定者做追访采样监测，其中１人１２天后ＷＢ血清ＨＩＶ抗体由不确定性转为阳性，另７人在６～１５个月经２～３次采样检测，ＷＢ区带反应无变化或略有变化。本研究证实ＷＢ不确定者，若有ＨＩＶｅｎｖ（ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１）区带反应，ＨＩＶ血清抗体可能转阳；若仅ＨＩＶｐｏｌ（ｐ３１、ｐ５１、ｐ６６）和／或ｇａｇ（Ｐ１７、Ｐ２４、Ｐ５５）区带反应，很大可能是非特异性反应。虽ＥＬＩＳＡ阳性，而ＷＢ不确定者血清主要呈ｐ２４抗体反应（４２．９％，１８／４２）与ｐ２４、ｐ１７抗体反应（２８．６％，１２／４２）。     

重组人肝再生增强因子原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 用聚合酶链反应法（ＰＣＲ）和基因重组技术构建重组人肝再生增强因子原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法 利用ＰＣＲ方法从我们构建的ＰＵＣ１９－ｈＡＬＲ质粒中扩增出带ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切位点的ｈＡＬＲ编码区ＤＮＡ。ＰＣＲ产物和质粒ｐＥＴ１１ａ分别被相应内切酶消化,然后被Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接以获取重组表达质粒。重组表达质粒ｐＥＴ１１ａ－ｈＡＬＲ经电转化入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,在Ｉ