p,p'-DDE对大鼠睾丸支持细胞细胞外信号调节激酶转导通路影响的机制研究

目的 研究p,p'-DDE对离体培养大鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell)内的细胞外信号调节激酶(ERK)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路影响机制.方法从大鼠睾丸组织中分离支持细胞进行离体原代培养,分别以0、10、30、50μmol/L的p,p'-DDE染毒,用MTT比色法、SABC法和Western ...     

p,p’-DDE对大鼠睾丸支持细胞抑制素B表达的影响

目的研究p,p’-DDE对离体培养的大鼠睾丸支持细胞细胞内抑制素B的影响。方法从大鼠睾丸组织中分离支持细胞进行离体原代培养,在细胞毒性试验的基础上确定受试物的剂量,以RT-PCR方法定量抑制素B在不同剂量受试物作用下的变化情况。结果p,p’-DDE中、高浓度组与溶剂对照组和低浓度组比较差异均有显著性(P<0.05)。抑制素B的灰度值随着p,p’-DDE浓度的增高逐渐降低,呈剂量依赖关系。结论p,p’-DDE对大鼠睾丸支持细胞分泌抑制素B表达可能存在着抑制作用。     

p,p'-DDE对离体培养的大鼠睾丸支持细胞内钙离子的影响

目的 研究p,p'-DDE对离体培养大鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell)细胞内钙离子的影响.方法从大鼠睾丸组织中分离支持细胞并进行离体原代培养,设空白对照组、溶剂对照组和低、中、高剂量p,p'-DDE染毒组(10、30、50 μmol/L),然后以Fura-2/AM为钙探针,用细胞内双波长钙荧光系统通过测定荧光值计算细胞内钙离子浓度的变化.结果 高剂量组支持细胞中Ca2+浓度高于溶剂对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 p,p'-DDE可干扰支持细胞内钙离子稳态,造成钙的超负载.钙离子稳态失衡可能诱导支持细胞凋亡,最终可能导致生殖功能障碍.     

p,p’-DDE对离体培养支持细胞DNA损伤与FasL基因表达的影响

目的研究p,p’-DDE对离体培养支持细胞DNA损伤与FasL基因表达的影响。方法从大鼠睾丸组织中分离支持细胞进行离体原代培养3天,加入不同浓度p,p’-DDE继续培养24h,应用单细胞凝胶电泳(SCGE)和反转录聚合链式反应(RT-PCR)研究p,p’-DDE诱导支持细胞DNA损伤和FasL基因表达。结果发现支持细胞DNA迁移度随着p,p’-DDE剂量的增高而增高,同时FasL的基因表达水平也随之增高。结论p,p’-DDE可诱导支持细胞DNA损伤和FasL基因表达,pp’-DDE可能是通过Fas/FasL途径诱导支持细胞损伤,破坏生精过程的动态平衡,最终导致精子减少。     

p,p'-DDE对离体培养大鼠睾丸支持细胞转铁蛋白表达的影响

目的研究P,P'-DDE对离体培养大鼠睾丸支持细胞转铁蛋白表达的影响.方法对大鼠睾丸支持细胞离体原代培养,运用一步法RT-PCR检测给与P,P'-DDE后24 h支持细胞转铁蛋白mRNA水平.结果睾丸支持细胞转铁蛋白mRNA水平随P,P'-DDE所给剂量的增高而降低,且与对照组差异存在显著性(P＜0.05),呈剂量依赖关系.结论P,P'-DDE 可抑制睾丸支持细胞转铁蛋白的基因转录,从而抑制其合成,导致精子发生障碍和生殖功能紊乱.     

p,p'-DDE和β-BHC对大鼠支持细胞卵泡刺激素受体的影响

目的 研究p,p'DDE、β-BHC单独及其联合作用对离体培养大鼠睾丸支持细胞卵泡刺激素受体(FSHR)表达的影响.方法 取6只18～20日龄清洁级雄性SD大鼠支持细胞原代培养2d后,调整细胞密度为10<'3>～10<'4>个/孔.分别加入终浓度为0(DMSO,溶剂对照)、10、30、50、70μmoL/L的p,p'-...     

p,p'-DDE和β-BHC联合染毒对大鼠离体支持细胞脂质过氧化的影响

目的 研究p,p‘-DDE和β-BHC联合染毒对大鼠离体支持细胞脂质过氧化的影响.方法 通过离体培养SD大鼠支持细胞的四甲基偶氮唑盐(MTT)实验,确定后续实验的染毒剂量,p,p‘-DDE和β-BHC的染毒浓度均为10、30、50μmol/L,p,p‘-DDE β-BHC联合染毒浓度为10μmol/L p,p‘-DDE 10μmol/L β-BHC,30μmol/L p,p‘-DDE 30μmol/L β-BHC,50μmol/Lp,p‘-DDE 50μmol/L β-BHC,检测染毒后支持细胞乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率、总超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量的变化.结果 50μmol/L的p,p‘-DDE、β-BHC均可使支持细胞的吸光度(A)值显著下降(P＜0.05).睾丸支持细胞LDH的漏出率随染毒浓度的增加而明显增加(P＜0.05),二者以不同浓度联合染毒时支持细胞LDH的漏出率均显著高于对应浓度的单独染毒(P＜0.05).不同浓度的p,p‘DDE、β-BHC及二者联合染毒均可使细胞内总SOD活力显著降低(P＜0.05)、MDA的含量增加(P＜0.05),且联合染毒时MDA的含量与二者单独染毒时相比均有显著增加(P＜0.05).结论 p,p‘-DDE、β-BHC单独和联合作用均可以引发睾丸支持细胞脂质过氧化,p,p‘-DDE和β-BHC对支持细胞的联合毒性作用具有一定的协同效应.     

p，p＇-DDE、β-BHC对大鼠支持细胞FasL mRNA表达及NF-κB活性的影响

[目的]研究有机氯农药DDT和六六六的代谢产物（p，p＇-DDE）和β-BHC及联合染毒对离体培养大鼠支持细胞（sertoli cell）FasL mRNA表达及NF—κB活性的影响。[方法]分离大鼠睾丸支持细胞进行原代培养2d，以DMSO为溶剂对照，分别以终浓度为10、30、50μmol／L的p，p＇-DDE、β-BHC及联合染毒支持细胞24h，应用RT-PCR法研究支持细胞FasL mRNA的表达；用激光共聚焦显微镜检测NF—κB的转位激活状况。[结果]10、30、50μmol／L的p，p＇-DDE、β-BHC及其联合染毒支持细胞后，FasL mRNA表达升高，50μmol／L剂量组与对照组差异有统计学意义（P〈0．05），各组内低、中剂量组与高剂量组差异有统计学意义（P〈0．05）；NF-κB活性明显增强。[结论]支持细胞经p，p＇-DDE、β-BHC及其联合染毒后，FasL mRNA表达明显升高，NF—κB的活性随染毒剂量的增加而增强，且联合作用比单独作用更加明显。     

双酚A对大鼠睾丸支持细胞P38丝裂原活化蛋白激酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3表达的影响

目的 研究双酚A (bisphenol A,BPA)对离体培养青春前期大鼠睾丸支持细胞P38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)及相关凋亡基因表达的影响.方法 将睾丸支持细胞分别暴露于0(溶剂对照)、30、50、70 μmol/L的BPA.采用MTT法检测离体培养细胞活力,采用RT-PCR的方法检测p38 MAPK、caspase-3、FasL、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α) mRNA的相对表达情况,采用western-blotting的方法检测细胞中P38 MAPK、磷酸化P38 MAPK和caspase-3酶原蛋白的表达情况.结果 与溶剂对照组相比,30 μmol/L BPA组支持细胞p38 MAPK mRNA的相对表达量升高,而50 μmol/L BPA组p38 MAPK的表达明显降低(P＜0.05);各浓度BPA染毒组caspase-3mRNA的相对表达量均较高(P＜0.05);仅50 μmol/L BPA组TNF-α mRNA的相对表达量增加(P＜0.05);50、70 μmol/LBPA组FasL mRNA的相对表达量增加(P＜0.05);各剂量BPA染毒组总P38MAPK蛋白的相对表达量无显著变化;50和70 μmol/LBPA组磷酸化P38 MAPK蛋白的相对表达量均明显升高(P＜0.05);仅70 μmol/L BPA组caspase-3酶原蛋白的相对表达量下降(P＜0.05).结论 BPA可激活离体培养青春前期大鼠睾丸支持细胞p38 MAPK,并诱发caspase-3活化,导致细胞凋亡,这可能是通过FasL凋亡途径介导的.     

TGF-β1通过p38MAPK信号通路调节大鼠睾丸支持细胞闭锁蛋白表达的研究

目的探讨TGF-β1介导的p38MAPK信号通路对大鼠睾丸支持细胞闭锁蛋白表达的作用及意义。方法体外分离培养大鼠睾丸支持细胞,随机分为空白对照组、刺激组、受体阻滞剂组、受体阻滞剂+刺激组、抑制因子组和抑制因子+刺激组6组;测定各组细胞增殖情况、p38MAPK mRNA和闭锁mRNA的表达水平以及各组细胞闭锁蛋白和P-p38MAPK蛋白表达水平。结果组间比较差异有统计学意义(F=4.86,P0.05)。刺激组细胞增殖活性升高,差异有统计学意义(P0.05);刺激组闭锁蛋白mRNA表达比空白对照组降低,p38MAPK mRNA表达升高;抑制因子组p38MAPK mRNA表达降低,差异均有统计学意义(P0.05)。受体阻滞剂+刺激组闭锁蛋白mRNA表达比刺激组升高,p38MAPK mRNA表达降低;抑制因子+刺激组闭锁蛋白mRNA表达升高,p38MAPK mRNA表达降低,差异均有统计学意义(P0.05)。刺激组闭锁蛋白表达比对照组降低,P-p38MAPK蛋白表达升高;抑制因子组P-p38MAPK蛋白表达降低,差异有统计学意义(P0.05)。受体阻滞剂+刺激组闭锁蛋白表达比刺激组升高,P-p38MAPK蛋白表达降低;抑制因子+刺激组闭锁蛋白表达升高,P-p38MAPK蛋白表达降低差异均有统计学意义(P0.05)。结论 TGF-β1可能通过p38MAPK信号通路调控大鼠睾丸支持细胞闭锁蛋白的表达。     

大鼠子宫内膜异位症的细胞外信号调节激酶信号通路参与机制及来曲唑的改善作用

目的分析大鼠子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路参与机制及来曲唑的改善作用。方法将40只雌性SD大鼠随机分为4组,每组10只,即假手术(Sham)组、子宫内膜异位症模型(EMs)组、PD98059(PD)组及来曲唑(LE)组。自体移植法手术建立EMs模型,PD98059组及来曲唑组进行对应灌胃治疗。采用Western Blotting分析各组大鼠异位组织中ERK信号通路的关键蛋白甲基乙基酮(Methyl Ethyl Ketone,MEK)、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)、p MEK(extracellular regulated protein kinase)及p ERK1/2蛋白的表达及参与细胞外基质重构的基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase,MMP2)及细胞凋亡蛋白Caspase3的表达。结果 EMs模型大鼠的ERK信号通路关键蛋白MEK、p MEK、ERK1/2及p ERK1/2的表达均增高(分别为123.6%、136.4%、144.7%、141.2%);MMP2及Caspase3的表达增强(分别为187.6%、134.7%);来曲唑组大鼠的上述蛋白的异常表达得到显著恢复,且较子宫内膜异位症模型组降低(P0.05)。结论激活的ERK信号通路及其所诱导的细胞外基质重构和细胞凋亡参与了大鼠EMs的发生过程,来曲唑通过抑制激活的ERK通路改善EMs的异常。     

镉诱导大鼠腺垂体细胞凋亡及与p38 MAPK&ERK1/2途径介导机制关系的初步研究

目的了解CdCl2对腺垂体的损伤以及细胞凋亡发生与p38MAPK、ERK12表达的关系,为了解镉致腺垂体毒作用的分子机制提供科学依据。方法采用健康雄性SD大鼠进行整体试验(n=12),分别每天经口灌胃给予0、1.0、2.0、4.0mgkgbwCdCl2,6周后取腺垂体进行指标检测;离体试验采用酶解分离大鼠之原代腺垂体细胞,分别以0、1.56、3.12、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μmolLCdCl2处理,收获细胞进行检测;特异性阻断剂阻断凋亡效应的试验采用2.65μmolLp38MAPK的特异阻断剂SB203580或10μmolLERK12激酶的特异阻断剂U0126处理细胞,然后以3.12μmolL或100.00μmolL的CdCl2处理细胞后进行相应的检测。检测指标包括:TUNEL法和流式细胞术等检测凋亡。结果整体实验和离体实验结果均显示CdCl2以剂量依赖方式诱导腺垂体细胞发生凋亡(P<0.05);特异性阻断剂效应的研究结果显示2.65μmolLSB203580和10μmolLU0126对TUNEL阳性细胞的相对灰度和凋亡细胞率均有一定的影响。结论在一定的剂量条件下,CdCl2影响腺垂体激素分泌水平,并导致发腺垂体细胞凋亡,MAPKs家族成员p38MAPK和ERK12激酶通路在凋亡发生过程中可能发挥一定的作用。     

香烟烟雾提取物对MIN6细胞JNK及p38MAPK表达影响

目的探讨体外香烟烟雾提取物(CSE)对胰岛MIN6细胞形态及活力的影响,及对胞内丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号转导通路ERK、JNK、p38MAPK表达的影响。方法体外培养MIN6细胞至生长对数期后,设不同浓度CSE(20、50、100和200μg/m L)实验组,同时设对照组,48 h后,镜下观察MIN6细胞形态学改变,并应用CCK-8法检测CSE对MIN6细胞的增殖抑制率;同时应用蛋白印迹法(WB)检测细胞内ERK、JNK、p38M APK蛋白及磷酸化程度。结果与对照组比较,100和200μg/m L剂量下的细胞形态出现明显异常,胞核固缩,细胞呈梭形样改变;与对照组比较,MIN6细胞活力出现下降,20、50、100、200μg/m L各组细胞活力分别为(97.32±2.67)%、(94.67±5.33)%、(87.71±12.3)%和(74.23±25.8)%;与对照组相比,ERK、JNK、p38MAPK蛋白表达变化不大,但随着CSE剂量的增加,p-JNK和p-p38MAPK磷酸化程度明显增加(与对照组相比,P0.05),并呈一定的剂量-效应关系。结论 CSE能够导致M IN6细胞形态异常、抑制其细胞增殖活力,其机制可能与JNK和p38MAPK信号通路的激活相关。     

P,P''''-DDE对睾丸支持细胞雄激素结合蛋白表达的影响

[目的]研究雄激素结合蛋白在P,P'-DDE致雄性大鼠生殖内分泌干扰过程中的作用机制。[方法]对大鼠睾丸支持细胞离体原代培养4-5 d;设溶剂(DMSO)及阴性对照,以终浓度为30、50、80、100 μmol／L的P,P'-DDE作用于支持细胞24h,计数200个细胞,计算支持细胞存活率;分别以浓度为10、30、50 μmol/LP,P’-DDE作用于支持细胞24h, 运用一步法RT-PCR检测支持细胞内雄激素结合蛋白基因mRNA水平。[结果]P,P'-DDE在50μmol／L及以下浓度作用 24 h后,支持细胞存活率>90％,而80μmol/L组仅45％;染毒24 h后,对照组及10、30、50 μmol/L的P,P’-DDE组支持细胞内雄激素结合蛋白mRNA灰度比值分别为0．3140±0．1020、0．3920±0．0949、0．5837±0．1221、0．6490±0．1718,随 p,p'-DDE所给浓度的增高而逐渐升高,且30、50 μmol/L组与对照组差异存在显著性(P<0．05),呈剂量依赖关系。[结论] p,p'-DDE作用于睾丸支持细胞后,雄激素结合蛋白基因转录水平可明显升高,从而表达增强,促进雄激素结合蛋白的生成,代偿性地维持生精过程。     

DEHP对大鼠睾丸支持细胞间隙连接蛋白43表达和间隙连接通讯功能的影响

目的 通过对原代培养的大鼠睾丸支持细胞进行邻苯二甲酸二乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)染毒,探讨DEHP体外对大鼠睾丸支持细胞间隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)表达及间隙连接通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)功能的影响.方法 体外分离和原代培养大鼠睾丸支持细胞,应用不同浓度的DEHP(10、50、100nmol/L)作用于支持细胞24h,应用荧光定量PCR法检测Cx43基因mRNA表达,用Weastern blot方法检测Cx43蛋白表达,划痕标记荧光染料示踪方法检测GJIC功能.结果 与对照组相比,DEHP各组支持细胞Cx43基因mRNA和蛋白表达均下降(P＜0.05),呈浓度依赖关系,同时支持细胞GJIC功能降低.结论 DEHP在体外可通过抑制大鼠睾丸支持细胞Cx43基因表达而抑制GJIC功能,进而影响支持细胞功能.     

活性氧在P，P’-DDE诱导大鼠睾丸支持细胞凋亡中的作用

[目的]研究活性氧在2,2-双-（对氯苯基）-1,1-二氯乙稀（P,P’-DDE）诱导大鼠睾丸支持细胞凋亡中的作用。[方法]从大鼠睾丸组织中分离支持细胞进行离体原代培养3d,用0、10、30、50μmol／L的p,p＇-DDE及加有300μmol／L的抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）的P,P’-DDE（50μmol／L）继续培养24h,应用流式细胞仪测定细胞内活性氧（ROS）水平、线粒体膜势能（Aym）、凋亡发生率。[结果]50μmol／L的P,P’-DDE可以诱导支持细胞ROS显著升高,10、30、50μmol／LP,P’-DDE处理组的线粒体膜势能下降,30、50μmol／L的P,P’-DDE可以诱导支持细胞凋亡,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0．05）;NAC有效抑制了ROS升高,削弱线粒体膜势能下降,减少了凋亡发生率,与50μmol／L的P,P’-DDE处理组相比,差异有显著意义（P〈0．05）。[结论]P,P’-DDE可以诱导大鼠睾丸支持细胞凋亡,ROS产生可能是其重要原因之一。     

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶在p,p’-DDE致青春期雄性大鼠生殖功能障碍中的作用

目的探讨磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)在p,p’-DDE对大鼠睾丸生精细胞脂质过氧化及诱导生精细胞凋亡中的作用。方法将20只健康清洁级50日龄雄性SD大鼠按体重随机分为4组,分别为对照(玉米油)组及低(20 mg/kg)、中(60 mg/kg)、高(100 mg/kg)剂量p,p’-DDE染毒组,每组5只。采用腹腔注射方式染毒,注射容积为10ml/kg,每隔1 d染毒1次,连续进行10 d。测定血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力和丙二醛(MDA)的含量。采用Western blotting方法和检测大鼠睾丸组织PHGPx蛋白相对表达情况,采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)测定大鼠睾丸组织PHGPx及B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bcl-2 associated protein X,Bax)、细胞色素C(Cyt C)、凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA的表达水平。结果与对照组相比,60 mg/kg p,p’-DDE染毒组血清SOD、GSH-Px活力和睾丸组织PHGPx蛋白表达水平均降低,100 mg/kg p,p’-DDE染毒组大鼠睾丸组织中PHGPx、Cyt C、Apaf-1 mRNA表达水平和60 mg/kg p,p’-DDE染毒组Caspase-3 mRNA表达水平较高,60 mg/kg、100 mg/kg p,p’-DDE染毒组Bax mRNA表达水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PHGPx在p,p’-DDE所致男(雄)性生殖功能紊乱中起拮抗作用。     

化学合成小干扰RNA体外转染大鼠支持细胞的实验研究

目的:观察化学合成siRNA阻断大鼠支持细胞内源性基因表达的可行性,并优化转染条件。方法:体外取SD大鼠睾丸,分离、培养支持细胞,应用化学合成的不同浓度siRNA在阳离子脂质体Lipofectamice TM 2000介导下转染原代支持细胞。RT—PCR检测大鼠支持细胞中GAPDH mRNA水平的变化,MTT法检测支持细胞的活性。结果:转染终浓度为150nmol/L的siRNA能特异性有效的阻断GAPDH基因的表达,细胞毒性随浓度提高而增强,终浓度为200nmol/L的siRNA对细胞有明显毒性。结论:siRNA能在大鼠支持细胞内启动RNA干扰,150nmol/L的siRNA能特异有效地阻断内源基因表达并保持较高的细胞活性。     

壬基酚对睾丸支持细胞类固醇生长因子-1mRNA表达的影响

目的 研究壬基酚(nonylphenol,NP)对离体培养大鼠睾丸支持(Sertoli)细胞类固醇生成因子-1(steroidogenic factor 1,SF-1)表达的影响.方法 大鼠Sertoli细胞经离体原代培养后,分别用0.08、0.40、2.00、10.00 μg/L浓度NP染毒24 h.运用实时荧光定量PCR检测不同剂量染毒后的Sertoli细胞的SF-1 tuRNA水平.结果 0.08、0.40、2.00、10.00 μg/L NP染毒剂量组的SF-1基因相对表达量分别是3.10±0.88,10.10±0.18,4.83±0.30,3.27±0.81,而阴性对照组、β-雌二醇组的值则分别为12.34±1.37,2.08±0.01.与阴性对照组比较,除0.4 μg/L组外的各NP染毒组及β-雌二醇组Sertoli细胞SF-1mRNA表达均降低,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 NP可以抑制大鼠Sertoli细胞SF-1的表达,并可能是影响生殖功能的机制之一.     

Vit B6对支持细胞乳酸分泌和体外培养睾丸碎块合成睾酮的影响

目的研究Vit B6对原代培养睾丸支持细胞分泌乳酸和体外对睾丸合成睾酮的影响,探讨Vit B6生殖毒性作用机制。方法胰蛋白酶和Ⅳ胶原酶两步分离法分离雄性SD大鼠睾丸支持细胞进行体外培养,分别加入不同浓度的Vit B6(0.1mg/ml,1mg/ml,10mg/ml和20mg/ml),24h后收集培养液测定乳酸含量。利用离体组织培养和放射免疫技术,观察不同浓度的Vit B6是否对大鼠睾丸睾酮的分泌有直接作用。结果与对照组相比,Vit B610mg/ml和20mg/ml剂量组乳酸含量减少。Vit B6各剂量组睾丸培养液中睾酮的含量与对照组相比均没有显著性差异。结论Vit B6可能通过减少了睾丸支持细胞乳酸的分泌而影响生殖细胞的功能。Vit B6对睾丸分泌睾酮没有直接的抑制作用,可能对间质细胞正常功能没有影响。