CXCL12-KDEL 融合基因绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建CXCL12-KDEL 融合基因绿色荧光蛋白表达载体并鉴定其在人舌癌细胞株Tb3.1（以下简称Tb3.1）中的表达。方法:设计特定引物,以人基因组DNA为模板,PCR 扩增目的基因CXCL12-KDEL,经纯化的目的基因连接19T 载体,插入pIRES 2-EGFP 表达载体中,使用Bgl Ⅱ/Sal I 进行双酶切,酶切初步鉴定后,测序鉴定。测序正确的重组质粒经脂质体（Lipofectamine TM2000）介导体外转染Tb3.1,转染48h 及72h 在倒置荧光显微镜下观察。利用Western-blot检测重组质粒CXCL12-KDEL表达情况。结果:经酶切及测序鉴定证实目的基因(CXCL 12-KDEL)已成功扩增并插入重组质粒;重组质粒转染Tb3.1细胞,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,Western-blot检测转染可见E-tag蛋白表达。结论:成功构建了CXCL12-KDEL融合基因绿色荧光蛋白表达载体,为进一步完成CXCL12-CXCR4 生物学轴的阻断实验奠定了基础。      

Nucleostemin基因荧光真核表达载体构建及表达特性

目的:构建Nucleostemin(NS)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法: 设计引物在肺癌细胞株(LTEP-a-2)中扩增NS全长cDNA片段,插入pMD-18T 质粒中得pMD-18T-NS载体,并测序;再将pMD-18T-NS质粒经酶切后导入真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP质粒中,构建pcDNA3.1(+)-GFP-NS载体,并检测其真核表达情况.结果: 经RT-PCR扩增得到1 650 bp的全长NS cDNA片段,酶切及测序后鉴定证明pMD-18T-NS构建成功.pcDNA3.1(+)-G-FP-NS载体转染COS-7细胞经蛋白印迹及激光共聚焦显微镜检测显示,该GFP-N-S融合基因在COS-7细胞中获得较好表达.转染后见该基因定位于核仁,细胞逐渐失去黏附贴壁的特性,细胞的增殖受阻;稳定表达(4～20周)后,细胞形态发生改变,体积增大,核增多,细胞成瘤细胞样改变.结论: 成功构建pcDNA3.1(+)-GF-P-NS真核表达载体,并在COS-7细胞中有效表达;NS基因在COS-7发生瘤样改变过程中发挥着重要作用,可能与肿瘤发生密切相关.     

脂质体介导入钠/碘同向转运体基因转染肺癌A549细胞及其蛋白表达

目的:研究人钠/碘同向转运体(NIS)基因转染肺癌细胞及其蛋白表达。方法:将体外培养的肺癌A549细胞分为实验组和对照两组:以脂质体Lipofectamihe2000为载体,分别介导转染重组质粒pcDNA3-hNIS和空质粒pcDNA3。NIS基因重组质粒pcDNA3-hNIS进行扩增、纯化,并经酶切鉴定和DNA测序。采用Western Blot法和免疫组化法分别检测转染肺癌细胞中NIS蛋白表达。结果:酶切鉴定和DNA测序结果表明重组质粒pcDNA3-hNIS中插入的hNIS基因片段大小、方向正确。WesternBlot法和免疫组化染色结果显示实验组有NIS蛋白表达,其阳性率达70.6%且主要分布于细胞膜而对照组无表达。两组比较有显著性差异(P=0.000)。结论:脂质体Lipofectamine 2000介导转染人钠/碘同向转运体基因pcDAN3-hNIS肺癌细胞能够成功地表达NIS蛋白。     

Fascin真核表达载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的:构建fascin基因的pcDNA3.1(+)表达载体pcDNA3.1(+)-fascin,将其转染肺癌A549细胞,观察其表达,并检测转染前后细胞内F-肌动蛋白(F-actin)的变化。方法:应用RT-PCR从Hela细胞中扩增fascin基因,酶切后和真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,获得重组表达载体pcDNA3.1(+)-fascin。经酶切、电泳,DNA测序鉴定后,将其及对照空载体转染肺癌A549细胞,采用Western blotting检测fascin在A549细胞中的表达情况;免疫荧光染色后采用激光共聚焦显微镜观察fascin对F-actin的影响。结果:成功克隆fascin基因片段,并将其重组到pcDNA3.1(+)载体中,经酶切及DNA测序鉴定正确。pcDNA3.1(+)-fascin转染A549细胞,Western blotting鉴定转染后fascin在A549细胞中高表达。激光共聚焦显示fascin基因能够在A549细胞内促进F-actin形成丝状突出。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-fascin真核表达载体,并将其转染肺癌A549细胞;激光共聚焦观察显示fascin能够促进A549细胞内F-actin形成丝状突出,可能是促进A549细胞转移的结构基础之一。     

SET基因shRNA慢病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达鉴定

目的： 构建SET基因shRNA慢病毒表达载体,为研究SET在三氯乙烯毒性机制中的作用提供技术支持。 方法：通过NCBI检索SET序列,设计合成5对shRNA片段,退火后连接到慢病毒载体pLVX-shRNA1 vector。挑取筛选的单菌落,经PCR和测序鉴定后提取质粒。将质粒共转染到293T细胞,收集病毒上清,转导入L-02肝细胞中,利用嘌呤霉素筛选得到SET缺陷型细胞,最后利用荧光定量PCR和Western blot鉴定干扰效果。结果：PCR和测序结果证明双链shRNA正确插入慢病毒载体pLVX-shRNA1 vector,共转染293T细胞得到高滴度病毒,转导L-02细胞筛选出SET基因缺陷型细胞。结论：利用慢病毒介导的RNAi技术成功构建了SET基因缺陷型细胞。     

Fascin真核表达载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的：构建fascin基因的pcDNA3.1（＋）表达载体pcDNA3.1（＋）-fascin,将其转染肺癌A549细胞,观察其表达,并检测转染前后细胞内F-肌动蛋白（F-actin）的变化。方法：应用RT-PCR从Hela细胞中扩增fascin基因,酶切后和真核表达载体pcDNA3.1（＋）重组,获得重组表达载体pcDNA3.1（＋）-fascin。经酶切、电泳,DNA测序鉴定后,将其及对照空载体转染肺癌A549细胞,采用Western blotting检测fascin在A549细胞中的表达情况;免疫荧光染色后采用激光共聚焦显微镜观察fascin对F-actin的影响。结果：成功克隆fascin基因片段,并将其重组到pcDNA3.1（＋）载体中,经酶切及DNA测序鉴定正确。pcDNA3.1（＋）-fascin转染A549细胞,Western blotting鉴定转染后fascin在A549细胞中高表达。激光共聚焦显示fascin基因能够在A549细胞内促进F-actin形成丝状突出。结论：成功构建了pcDNA3.1（＋）-fascin真核表达载体,并将其转染肺癌A549细胞;激光共聚焦观察显示fascin能够促进A549细胞内F-actin形成丝状突出,可能是促进A549细胞转移的结构基础之一。     

分泌型核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建分泌型核心蛋白聚糖(decorin)真核表达载体,并在肝癌细胞HepG2中表达,为研究核心蛋白聚糖的抗肿瘤作用奠定基础。方法利用特异性引物,应用PCR技术扩增核心蛋白聚糖全长基因cDNA片段,与pcDNA3.1载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染HepG2,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和westernblot检测其表达。结果获得了约1080bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型核心蛋白聚糖cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中。RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和westernblot方法可见转染组细胞decorin蛋白表达明显增高。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染decorin的HepG2细胞株。     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法:应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1(+)载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1(+)-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论:重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

C端带His标签重组MT1G真核表达载体构建及其在EC9706中的表达

目的:构建含MT1G cDNA的重组真核表达载体,并观察在人食管癌细胞EC9706中表达情况.方法:用PCR法从含MT1G基因cDNA质粒pACT2-MT1G中扩增获得目的基因片段,正向克隆入C端带Myc和6×His标签的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(-)中.经酶切及测序鉴定后,以脂质体法转染EC9706细胞,经G418加压筛选获得阳性单克隆细胞,用RT-PCR和蛋白质印迹法技术检测MT1G mRNA和蛋白的表达.结果:成功构建了真核表达载体pcDNA3 1/Myc-His(-)-MT1G,转染pcDNA3.1/Myc-His(-)-MT1G的EC9706细胞内有带His标签MT1G融合蛋白表达.结论:获得了人MT1G重组载体和稳定表达带His标签MT1G融合蛋白的EC9706细胞株,为进一步研究MT1G的功能奠定了基础.     

稳定干扰SET肝细胞株的生物学鉴定

目的:对稳定干扰SET(patient SE translocation)的肝细胞株进行生物学性状鉴定,为研究SET蛋白在肝细胞中的作用奠定基础。方法:培养人肝L-02细胞、慢病毒载体介导的稳定干扰(siRNA)SET L-02肝细胞及psiRNAc L-02肝细胞(空载体转染细胞),于倒置显微镜下观察细胞形态,利用MTT吸光度与细胞数目间关系绘制生长曲线,采用染色体畸变试验观察染色体有无结构异常,软琼脂克隆实验检测细胞的恶性转化。结果:与正常肝细胞比较,稳定干扰SET肝细胞及psiRNAc肝细胞的生长形态无明显变化,3组细胞的生长曲线趋于一致。染色体畸变分析表明SET基因沉默的人肝L-02细胞染色体结构与数目未发生明显改变。软琼脂克隆实验表明SET基因沉默的人肝L-02细胞未发生恶性转化。结论:SET siRNA的导入未引起细胞生物学特征的改变,遗传性状保持稳定,说明所构建的SE7基因沉默的人肝L-02细胞模型是稳定的,为后续的研究提供了工具细胞。     

三氯乙烯对L-02肝细胞中SET表达的影响

目的：研究不同剂量三氯乙烯（TCE）对L-02肝细胞中SETmRNA和蛋白水平表达的影响,为探索TCE致肝损伤的机制提供实验依据。方法：分别用0.5%二甲基亚砜（DMSO）、3mmol/LTCE及10mmol/LTCE处理L-02肝细胞24h后,采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）技术和蛋白印迹（Western blotting）技术分别检测L-02肝细胞中SETmRNA和SET蛋白的表达。结果：与DMSO对照组相比,TCE处理组SETmRNA、SET蛋白表达均显著上调（P均〈0.01）,其10mmol/LTCE处理组的SET蛋白表达高于3mmol/LTCE处理组（P〈0.05）,呈剂量依赖关系。结论：TCE可诱导L-02肝细胞中SET表达上调,提示SET可能在TCE对肝细胞毒性效应中起着重要作用。     

EGF对肝癌细胞及正常肝细胞内ras基因表达的影响

目的 揭示正常肝细胞和肝癌细胞对表皮生长因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ＥＧＦ）不同的应答能力,以及ＥＧＦ对两种不同细胞株内ｒａｓ基因表达的影响。方法 运用Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹技术对正常肝细胞株Ｌ－０２和肝部细胞株Ｈｅｐ－Ｇ２ｋ ｐ２１＾ｒａｓ的表达进行比较分析。结果 在两种细胞株Ｌ－０２和Ｈｅｐ－Ｇ２中以ｐ２１＾ｒａｓ的表达。Ｈｅｐ－Ｇ２细胞的ｐ２１＾ｒａｓ表达量在ＥＧＦ     

肝癌细胞 67kDa层粘连蛋白受体的表达

背景与目的:本实验室最近发现人肝癌细胞 SMMC-7721表达的 67kDa层粘连蛋白受体( 67kDa Laminin receptor,67LR)与层粘连蛋白的结合能力明显高于正常肝细胞 L-02表达的 67LR,而 67LR在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达水平尚不清楚.本研究旨在探讨 67LR在肝癌细胞中的表达,及其与层粘连蛋白结合能力的关系.方法:以人肝癌细胞 SMMC-7721、 HepG2和正常肝细胞 L-02为材料,采用 131I标记的层粘连蛋白测定其与细胞的结合能力;采用流式细胞术和 RT-PCR分析 67LR蛋白和 mRNA的表达水平. 结果: (1)相同条件下 SMMC-7721、 HepG2 细胞与层粘连蛋白特异结合量分别为 (17.54± 0.49) ng/105 cell、 (11.18± 0.53) ng/105 cell,而 L-02细胞的特异结合量为 (8.36± 0.48) ng/105 cell,表明肝癌细胞与层粘连蛋白的结合能力明显高于正常肝细胞( P< 0.01) ;(2)流式细胞术分析, SMMC-7721细胞的 67LR阳性表达率为 34.7%, L-02细胞的 67LR阳性表达率为 55.3%,而 HepG2 细胞则几乎不表达 67LR; (3)RT-PCR产物进行半定量分析发现,两株肝癌细胞的 67LR mRNA表达水平明显高于 L-02细胞.结论:肝癌细胞与层粘连蛋白的结合能力明显高于正常肝细胞 L-02,而细胞膜表面的 67LR水平却低于 L-02细胞,提示 SMMC-7721细胞 67LR的亲和力可能高于 L-02细胞,而且还涉及其它层粘连蛋白受体.     

NADH对二乙基亚硝胺所致L02人肝细胞株p53基因突变和c-erbB2基因表达的影响

背景与目的:研究NADH对二乙基亚硝胺(DENA)所致L02人肝细胞株p53基因突变和c-erbB2基因表达的影响。材料与方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)及聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测DENA所致的L02细胞p53基因突变;Southern blot分析DENA对c-erbB2基因表达的影响;研究辅酶NADH的抗突变作用。结果:PCR-SSCP分析显示NADH保护的DL02-Ⅲ细胞和DL02-B细胞p53exon7突变率均较DENA致突变组降低,差异有统计学意义(P<0.01);PCR-RFLP分析结果显示NADH降低DENA所诱发的L02细胞p53基因第7外显子249位密码子点突变率(P<0.01)。Southern blot检测结果也显示NADH可抑制DENA所致的L02细胞c-erbB2基因的表达上调。结论:还原型辅酶NADH具有抗突变作用,可降低DENA所致的L02细胞p53基因的突变,并抑制c-erbB2基因的表达。     

CYP2E1基因过表达细胞株的建立及鉴定

目的： 应用分子克隆技术,构建CYP2E1基因过表达载体,转染L02肝细胞,建立CYP2E1过表达细胞株并进行鉴定,为深入研究环境和职业毒物的毒作用机制提供模型细胞。方法：根据GenBank提供的CYP2E1 基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒过表达载体pLVX-acGFP1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到转染CYP2E1基因的L02细胞,通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。结果：测序证明重组慢病毒过表达载体CYP2E1基因序列与GenBank提供的CYP2E1序列一致,荧光定量PCR检测转染CYP2E1基因的L02细胞比正常肝细胞CYP2E1 mRNA表达提高273倍,Western blot实验显示转染CYP2E1基因的L02细胞CYP2E1蛋白表达水平比正常肝细胞提高3.2倍。结论：成功构建了CYP2E1基因过表达细胞株,可应用于环境毒物和职业毒物的分子机制 研究。     

癌症高发区环境水样有机提取物诱导L-02细胞转化及其表观遗传学机制

目的:检测华中某癌症高发地区环境水样有机提取物诱导人肝细胞系L-02细胞转化的能力,并初步探讨其诱导细胞转化的表观遗传学机制。方法:分别采集研究地区河水、离河较近(约1 km)及离河较远(约20 km)的浅井水(约10 m),用固相萃取方法提取其中的有机物。用台盼蓝染色计数法和单细胞凝胶电泳试验检测受试物的细胞毒性和致DNA损伤效应,以受试物对L-02细胞进行长期染毒并利用软琼脂克隆形成试验和裸鼠皮下成瘤试验检测受试物诱导L-02细胞转化的能力。采用甲基化特异性PCR(methyrlation specific PCR,MSP)技术检测转化细胞中O~6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O~6-methylguanine-DNA methyhransferase,MGMT)基因启动子区甲基化状况,并分别用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测转化细胞MGMT mRNA和蛋白的表达水平。结果:河水、离河较近的井水、离河较远的井水的有机提取物处理L-02细胞24 h后,细胞存活率达70%的处理浓度分别为每毫升培养基30、150、200ml原水,且均含有致DNA损伤的物质。以此作为最高剂量对细胞进行长期染毒,12周以后各处理组细胞软琼脂克隆形成试验和裸鼠皮下成瘤试验均显示转化特性。MSP结果显示转化细胞中MGMT基因启动子区发生高甲基化,与DMSO溶剂对照组比较,转化细胞中MGMT mRNA和蛋白表达水平均下调(P0.05)。结论:研究地区环境水样有机提取物具有诱导L-02细胞转化的能力,MGMT基因启动子区的高甲基化可能参与有机物诱导的细胞转化过程。     

抗PSA单链抗体/p53四聚功能域融合基因的构建及表达

目的：构建抗人前列腺特异抗原（PSA）单链抗体（scFv)/人p53四聚功能域融合基因，并进行真核表达和活性测定。方法：利用递归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p53四聚功能域融合基因，克隆入pUC19载体中构建pUC19/IgG3/p53克隆载体。将抗PSA scFv克隆人UC19/IgG3/p53载体中，构建抗PSA scFv/人p53四聚功能域融合基因。经酶切鉴定及序列测定证实后。将融合基因克隆人真核表达载体pSecTag2-B中，转染HeLa细胞进行表达，表达产物纯化后利用流式细胞仪进行活性测定。结果：获得了抗PSA scFv/人p53四聚功能域融合基因，基因全长891bp，可编码297个氨基酸，与已发表的抗PSA，scFv,人IgG3上游铰链区和人p53四聚功能域基因cDNA序列一致。表达产物经SDS－PAGE和Western印迹实验证实为约35kD的特异蛋白条带，纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC－3细胞，亲和力高于scFv。结论：获得了可与PC－3细胞特异结合的抗PSA scFv四聚体，为进一步临床应用奠定基础。