斑蝥酸钠逆转K562/AO2细胞多药耐药的机制初探

目的 观察斑蝥酸钠(SCA)对多药耐药的白血病细胞(K562/AO2)细胞是否有逆转作用,并初步探讨其逆转机制.方法 应用 MTT测定多柔比星(阿霉素,ADM)对K562/AO2细胞的半数抑制浓度(IC50);应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测K562、K562/AO2细胞表达mdr1基因水平;用流式细胞术(FCM)检测其P-gp蛋白表达的水平.结果 MTT结果显示,无毒剂量的SCA与ADM联合应用比单纯加ADM(同等剂量)对K562/AO2细胞的IC50降低了1.51倍;耐药细胞(K562/AO2)经SCA处理后mdr1基因与P-gp蛋白表达均下降(P＜0.05).结论 SCA对K562/AO2有一定的逆转作用,其机制可能与下调mdr1基因和P-gp蛋白表达有关.     

斑蝥酸钠维生素B6注射液对人白血病K562/AO2细胞的逆转作用及机制的研究

目的研究斑蝥酸钠维生素B6注射液(SCA)体外对K562/AO2细胞多柔比星(ADM)耐药的逆转作用及机制.方法应用MTT法测定SCA作用人白血病K562/AO2细胞后对ADM敏感性的变化.采用流式细胞术(FCM)法测定SCA对K562/AO2细胞内ADM的影响及Bcl-2、P-gp蛋白表达的影响.结果SCA作用K562/AO2细胞前后,对ADM的IC50分别为(40.85±0.40)和(27.09±0.63) μg/mL,逆转倍数为1.51倍;FCM发现SCA能明显增加K562/AO2细胞内ADM的浓度,并使Bcl-2、P-gp蛋白表达下调.结论SCA能部分逆转K562/AO2对ADM的耐药性,机制可能与增加MDR细胞内的ADM浓度,抑制Bcl-2和P-gp蛋白表达有关.     

β-榄香烯逆转K562/ADM细胞MDR机制的探讨

目的:探讨β-榄香烯(β-elemene)对多药耐药细胞株K562/ADM的耐药逆转及作用机制。方法:MTT法检测抗药性逆转,免疫组化检测Bcl-2及P-gp蛋白的表达,流式细胞术对凋亡百分率及Bcl-2、P-gp蛋白的表达进行定量检测。结果:非细胞毒性浓度的β-elemene(4.0μg/ml)可显著降低ADM对K562/ADM细胞的IC50(P<0.01),逆转倍数为2.18倍;明显增强ADM对K562/ADM细胞的凋亡诱导作用,凋亡率由(1.88±0.11)%上升至(3.93±0.06)%(P<0.01);降低耐药细胞Bcl-2及P-gp的表达,Bcl-2的表达率由(94.8±1.9)%降至(66.7±0.9)%,P-gp的表达率由(98.7±2.1)%降至(76.8±1.4)%。结论:β-榄香烯可部分逆转K562/ADM细胞的耐药性,其逆转机制具有异质性,主要以抑制Bcl-2的表达从而诱导细胞凋亡来逆转MDR,同时兼具降低P-gp表达的作用。     

盐酸千金藤素逆转K562／ADR细胞的多药耐药性及其与bcl-2的关系

目的 研究盐酸千金藤素(CEP)对K562／ADR细胞多药耐药性的逆转作用及逆转机制。方法 采用MTT法测定阿霉素(ADR)单用及与CEP，维拉帕米(VER)合用对K562，K562／ADR细胞的直接细胞毒作用；采用免疫组织化学(IHC)法测定K562细胞，K562／ADR细胞内bcl-2的表达，以及药物对bcl-2表达水平的影响。结果 联合应用ADR和4μmol／LCEP使K562／ADR细胞对ADR的IC50由13．5μmol／L降至1．73μmol／L，其逆转倍数为7．8倍，但对K562细胞无明显影响；联合应用ADR和4μmol／LVER使K562／ADR细胞对ADR的IC50降至7．50／μmol／L，其逆转倍数为1．8倍，但对K562细胞也无明显影响。用IHC法检测bcl-2的表达，K562／ADR细胞中bcl-2的表达量为26．79％，远高于K562细胞中表达量4．98％，而联合应用ADR和4μmol／LCEP使K562／ADR细胞中bcl-2的表达量降至13．16％。结论 CEP可部分逆转K562／ADR细胞的耐药性，其机制可能与降低bcl-2的表达有关。     

维生素E琥珀酸酯下调mdr1/P-gp表达逆转K562/ADM耐药细胞的凋亡抑制

目的研究维生素E琥珀酸酯(VitaminEsuccinate,VES)诱导多药耐药K562/ADM细胞凋亡的分子机制。方法采用四氮唑蓝比色法(MTT)检测K562/ADM增殖活性;细胞形态学和AnnexinV/PI双标记法检测细胞凋亡;RT-PCR检测mdr1基因和Caspase-3基因mRNA的表达;流式细胞法(FCM)测定P-gp蛋白表达水平和Caspase-3活性。结果VES显著抑制K562/ADM细胞的增殖;经VES处理后细胞形态上出现典型的凋亡改变;AnnexinⅤ/PI双染检测凋亡细胞明显增加;mdr1mRNA表达和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)合成明显降低,Caspase-3mRNA表达和Caspase-3活性显著增强;VES增加K562/ADM细胞对ADM的敏感性。结论VES诱导mdr1/P-gp高表达的K562/ADM耐药细胞凋亡,其主要机制为下调mdr1/P-gp表达而逆转P-gp介导的细胞凋亡抑制和耐药性。     

川芎嗪与β-榄香烯联合应用诱导K562/ADM细胞凋亡及逆转其MDR的实验研究

目的:探讨不同作用机制的川芎嗪(Tetrainethylpyrazine,TMP)与β-榄香烯(β-elemene)联合应用,从多环节逆转耐药细胞K562/ADM的多药耐药(multidrug resistance,MDR),以期进一步提高逆转效果.方法:采用MTT法检测细胞的药敏性及抗药性逆转,流式细胞术及透射电镜检测细胞凋亡,应用SPSS(10.0 Production Pacility)软件包对实验结果进行统计学处理.结果:1)非细胞毒性浓度的TMP(350μg/ml)及β-榄香烯(4.0μg/ml)可显著降低ADM对K562/ADM细胞的IC50(P＜0.01),逆转耐药倍数分别为2.03倍及2.18倍.β-榄香烯(4.0μg/ml)具有诱导该细胞凋亡的作用.2)上述两种药物以非细胞毒性浓度联合应用,对ADM的逆转倍数为4.65倍,明显高于二者单独应用,而且也高于两者单独应用之和.其主要逆转机制是两药的联合应用通过升高细胞内ADM的浓度,诱导该细胞凋亡的途径,实现提高逆转效果的目的.结论:TMP和β-e榄香烯联合应用能明显逆转K562/ADM细胞对ADM的耐药性和诱导该细胞的凋亡.     

2-甲氧基雌二醇对白血病K562细胞凋亡相关基因表达的影响及其机制

 目的　探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）对白血病K562细胞凋亡的影响及其作用机制。方法　实验分为3组,对照组：培养基中不含2-ME;实验组：分别用1、2、4、8、16μmol／L的2-ME处理K562细胞36 h后观察各项指标的变化;阴性对照组：培养液中以无RNase蒸馏水代替K562细胞。应用原位细胞凋亡法（TUNEL）、流式细胞术（FCM）、半定量RT-PCR及黄嘌呤氧化酶法分别检测K562细胞凋亡率、Caspase-3、性连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）及其基因表达、超氧化物歧化酶（SOD）与活性氧（ROS）水平。结果　不同浓度的2-ME与K562细胞作用36 h后,2-ME在一定的浓度范围内以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡;2-ME通过上调促凋亡因子Caspase-3和（或）下调抗凋亡因子XIAP的表达,降低SOD及增加ROS水平等途径促进K562细胞凋亡,这可能是2-ME诱导K562细胞凋亡的机制之一。结论　2-ME能够以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡,显示了其在慢性粒细胞白血病（CML）治疗中的潜在价值。     

氧化苦参碱逆转多药耐药细胞系K562/A02耐药性的研究

目的:观察非细胞毒性浓度(生长率>95%)氧化苦参碱对耐阿霉素的人白血病细胞系K562/A02多药耐药性的逆转作用,并探讨其逆转机制.方法:采用MTT法测定氧化苦参碱的细胞毒性及其时K562/A02细胞敏感性的影响,用流式细胞仪检测非细胞毒性浓度的氧化苦参碱处理后K562/A02细胞膜表面糖蛋白P170表达的变化与细胞内柔红霉素的浓度,应用SPSS13.0软件包对实验结果进行统计学处理.结果:氧化苦参碱对K562/A02细胞有一定的细胞毒作用,其非细胞毒性浓度为50μg/ml,低细胞毒性浓度(生长率为85%～90%)为135μg/ml,把非细胞毒性剂量的氧化苦参碱作为最佳逆转浓度,非细胞毒性浓度氧化苦参碱可显著降低阿霉素对K562/A02细胞的IC50,使K562/A02细胞的IC50由原来的(34.9±0.21)μg/ml降低至(13.3±0.21)μg/ml,其逆转倍数为2.62倍;氧化苦参碱作用于K562/A02细胞后,细胞膜糖蛋白P170的表达从90.22%下调至44.24%(P<0.01);柔红霉素外渗试验显示,氧化苦参碱作用于K562/A02细胞后,细胞内化疗药物的浓度明显增加.结论:氧化苦参碱可部分逆转人白血病K562/A02细胞对阿霉素的耐药性,氧化苦参碱通过下调K562/A02细胞膜糖蛋白P170的表达,使其将化疗药物泵出细胞外的功能受到了抑制,使化疗药物在白血病细胞内能达到有效浓度,从而可以杀灭耐药的白血病细胞,达到逆转白血病细胞耐药性的目的.     

雷公藤红素逆转K562/A02细胞多药耐药的实验研究

目的探讨雷公藤红素逆转人慢性粒细胞白血病红白血病急变细胞株K562/A02多药耐药的效果。方法采用CCK-8法测定细胞的药敏性及耐药逆转性,应用流式细胞术检测细胞内ADM浓度、P-gp蛋白表达。结果雷公藤红素对K562/A02、K562的半数抑制率浓度（IC50）分别为（295.58±23.288）μmol/L、（411.59±26.551）μmol/L。K562/A02细胞对ADM的耐药性是K562细胞的79.78倍。细胞毒剂量的雷公藤红素作用后,ADM对K562/A02细胞的IC50显著下降（P〈0.05）,逆转倍数为117.860倍。细胞毒剂量（IC50）和非细胞毒剂量（IC10）的雷公藤红素处理后的K562/A02细胞内的ADM浓度显著增加（P〈0.05）,增加倍数分别为1.537倍和1.102倍。雷公藤红素能明显下调K562/A02细胞的P-gp表达。结论雷公藤红素对逆转K562/A02细胞的耐药性有一定的作用,其机制可能与下调P-gp表达有关。     

5-溴汉防己甲素与汉防己甲素对K562/A02细胞多药耐药性逆转作用的比较

背景与目的:5-溴汉防己甲素(5-bromotetrandrine,BrTet)是汉防己甲素(tetrandrine,Tet)的溴化产物,具有逆转P-糖蛋白(P-glyeoprotein,P-gp)介导的肿瘤多药耐药(muhidrug resistance,MDR)的作用。本研究旨在比较BrTet与Tet对人白血病细胞K562/A02多药耐药的逆转作用。方法:采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)法检测不同浓度BrTet对K562细胞和K562/A02细胞的增殖抑制效应;检测阿霉素(adfiamycin,ADM)对K562细胞和K562/A02细胞增殖的抑制作用,以及加用BrTet、Tet时上述抑制作用的变化,并计算半数抑制浓度(IC50)及逆转倍数。Westernblot法检测各组细胞P-gp的表达,流式细胞仪检测各组细胞内ADM的蓄积。结果:K562/A02细胞对ADM的耐药倍数为49.51倍。2.0μmol/L及更低浓度的BrTet和1.5μmol/L及更低浓度的Tet对K562细胞和K562/A02细胞抑制率均小于10%,无明显细胞毒性作用。加入1.0μmol/L的Tet后,K562/A02细胞对ADM的耐药倍数为12.17倍。加入0.25、0.5和1.0μmol/L的BrTet后,K562/A02细胞对ADM的耐药倍数分别为17.88、9.97和4.24倍。1.0"mol/L的BrTet和Tet分别使K562/A02细胞内ADM浓度提高了69.0%和51.6%,使P-gp表达分别下调了51.1%和43.73%,其差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:BrTet及Tet均可逆转K562/A02细胞耐药,且前者较后者逆转作用更强,逆转机制与抑制P-gp的表达、增加细胞内抗肿瘤药物浓度有关。     

RNAi对白血病细胞mdr-1基因和多药耐药表型的影响

目的:探讨RNA干扰技术(RNAi)对慢性粒细胞白血病急变细胞系K562/AO2细胞mdr1基因的抑制和耐药表型的逆转作用。方法:选择合成封闭mdr-1基因的小干扰序列(si-MDR1),以1个碱基突变的si-MDR1-mut为对照序列,在脂质体介导下转染至K562/AO2细胞系。RT-PCR和Western blot检测mdr1 mRNA及P-gp蛋白水平,流式细胞术分析细胞内柔红霉素(daunorubicin,DNR)积累量,并以四甲基唑蓝快速比色法(MTT)反映K562/AO2对阿霉素、长春新碱、足叶乙甙药物敏感性的变化。结果:实验证实该序列能高效封闭K562/AO2细胞内mdr-1基因表达,增加细胞内化疗药物DNR积累量,增强K562/AO2细胞对阿霉素、长春新碱、足叶乙甙的敏感性。结论:RNAi可以通过抑制mdr1基因表达,逆转K562/AO2细胞耐药表型。     

三唑类抗真菌药联合多柔比星逆转白血病细胞株耐药性研究

目的探讨三唑类抗真菌药伊曲康唑、氟康唑联合多柔比星逆转白血病细胞株耐药的作用。方法伊曲康唑、氟康唑或PSC833（阳性对照）分别联合多柔比星与人类慢性粒细胞白血病红白血病耐多柔比星细胞株K562／ADR共同培养,采用CCK-8法检测K562／ADR细胞增殖,流式细胞术检测K562／ADR细胞内多柔比星平均荧光强度,蛋白印迹法检测K562／ADR细胞7H2AX的表达。结果1μg／ml伊曲康唑及0．5μg／mlPSC833可将K562／ADR对多柔比星的J岛从38．30μg／ml降至8．59μg／ml和24．64μg／ml,且呈剂量依赖性。1Ng／ml伊曲康唑或0．5μg／mlPSC833联合多柔比星作用K562／ADR细胞3h和6h后,细胞内多柔比星平均荧光强度相对单加多柔比星组增加了1．54倍（3h）、1．50倍（6h）或5．97倍（3h）、5．83倍（6h）。伊曲康唑或PSC833联合多柔比星可显著增加K562／ADR细胞7H2AX的表达。结论伊曲康唑通过提高细胞内多柔比星浓度及协同增强细胞DNA的损伤,恢复K562／ADR对多柔比星的敏感性,而氟康唑则无作用。     

P13-K抑制剂LY294002逆转P-gP介导的白血病和胃癌细胞耐药

背景与目的：磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B[phosphatidylinositol-3-kinase（P13-K）／proteinkinaseB（Akt）,P13-K／Aktl通路是调控细胞生存的重要信号转导通路之一。本研究旨在探讨P13-K抑制剂LY294002对P-gP过表达的人类白血病K562／DNR和胃癌SGC7901／ADR细胞多药耐药性的逆转作用。方法：将细胞分为单纯药物组和LY294002预处理组,单纯药物组分别以柔红霉素（daunorubicin,DNR）、阿霉素（adriamycin,ADR）、长春新碱（vincristine,VCR）和依托泊甙（etoposide,VP-16）处理,LY294002预处理组在加药前以LY294002进行预处理。用台盼蓝拒染法及MTT法检测药物敏感性及LY294002对细胞耐药性的影响。Westernblot检测K562／DNR和SGC7901／ADR细胞中P．gP及p-Akt的表达。流式细胞术检测细胞内药物浓度。结果：2．5μmol／LLY294002预处理显著降低DNR、ADR、VCR和VP-16对K562／DNR细胞的IC50,相对逆转效率分别为72．4％、64．9％、60．4％和52．8％。此外,LY294002部分逆转SGC7901／ADR对ADR的耐药性,相对逆转效率为31．0％。LY294002预处理可部分抑制p-Akt和P-gP的表达。随着处理时间的延长．K562／DNR、SGC7901／ADR细胞内DNR、ADR的蓄积效应有增强的趋势。结论：LY294002通过抑制P13-K／Akt信号转导通路,部分逆转P-gp介导的白血病和胃癌细胞的多药耐药。     

环孢菌素A逆转白血病多药耐药机制的实验研究

目的：研究环孢菌素A（CsA)持续作用7天后,K562／AO2细胞多药耐药性的变化及其变化机制,方法：细胞毒性试验采用MTTI地,细胞内柔红霉素（DNR）浓度用流式细胞术检测,多药耐药基因（mdrl)的表达水平用RT－PCR方法检测,结果：K562／AO2耐药性降低2．2倍,K562／AO2细胞内DNR浓度明显升高,mdrl表达降低,佛伯酯（TPA）可拮抗CsA升高细胞的DNR浓度的作用,结论：CsA可下调mdrl的表达和细胞内DNR浓度进而逆转MDR,其作用可能与CsA抑制蛋白激酶D（PKC）活性有关。     

Indomethacin overcomes doxorubicin resistance by decreasing intracellular content of glutathione and its conjugates with decreasing expression of γ-glutamylcysteine synthetase via promoter activity in doxorubicin-resistant leukemia cells

Drug resistance continues to be a serious problem in cancer therapy. We investigated whether indomethacin, which inhibits cyclooxygenases, is able to overcome doxorubicin resistance in K562/ADR leukemia cells. Indomethacin at 10 μM increased the cytotoxicity of doxorubicin and vincristine in K562/ADR cells. Intracellular glutathione content was elevated in K562/ADR cells. Indomethacin treatment decreased glutathione content and glutathione-conjugates in K562/ADR cells. Increased expression of γ-glutamylcysteine synthetase (γ-GCS) was observed in K562/ADR cells, but this expression was decreased by indomethacin treatment. The activity of the γ-GCS promoter from K562/ADR cells decreased after indomethacin treatment in MDA231 cells. These data strongly suggest that the cyclooxygenase inhibitor indomethacin increases the cytotoxicity of doxorubicin by decreasing the intracellular contents of glutathione and its conjugates with decreasing expression of γ-GCS by inhibiting γ-GCS promoter activity.     

2-甲氧基雌二醇对白血病细胞K562增生、凋亡及细胞周期的影响

 目的 探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）对体外培养的慢性粒细胞白血病（CML）急变期细胞系bcr-abl（+）K562细胞增生、凋亡及细胞周期的影响。方法 将不同浓度和作用时间的2-ME与K562细胞共同培养，采用相差显微镜观察细胞的形态学变化；四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测2-ME对K562细胞增生的抑制作用；流式细胞术分析2-ME对K562细胞凋亡及细胞周期的影响。结果 1~ 16μmol／L浓度的2-ME在24、36、48及60 h均可明显抑制K562细胞增生，并在一定范围内呈时间和剂量依赖性；2-ME作用后G0／G1期细胞增加，并伴随细胞凋亡峰和凋亡率的升高。结论 2-ME可抑制K562细胞增生，诱导其凋亡，为2-ME的临床应用提供实验依据。     

Indomethacin overcomes doxorubicin resistance with inhibiting multi-drug resistance protein 1 (MRP1)

Drug resistance continues to be a serious problem in cancer therapy. We investigated whether indomethacin, which inhibited cyclooxygenases, would overcome doxorubicin resistance in K562/ADR leukemia cells. Indomethacin at 10 μM increased the cytotoxicity of doxorubicin, as well as vincristine in K562/ADR. Both multi-drug resistant protein1 (MRP1) and P-glycoprotein were overexpressed in K562/ADR cells when compared with K562 parent cells (K562/P). Expression of MRP1 mRNA and protein, but not P-glycoprotein, was significantly decreased in K562/ADR cells after indomethacin treatment. Indomethacin treatment increased 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) efflux, as well as decreased accumulation in K562/ADR cells. The activity of the MRP1 promoter decreased after indomethacin treatment in Hela cells. These data strongly suggest that the cyclooxygenase inhibitor, indomethacin, increased the cytotoxicity of doxorubicin with decreasing expression of MRP1 through inhibition of MRP1 promoter activity.     

GCS induces multidrug resistance by regulating apoptosis-related genes in K562/AO2 cell line

We have previously shown that the expression of glucosylceramide synthase (GCS) gene in drug-resistant K562/AO2 human leukemia cell was higher than that in drug-sensitive K562 cell, and the sensitivity to adriamycin of K562/AO2 cell was enhanced by inhibiting GCS. It is concluded that the overexpression of GCS gene is one of the reasons which lead to multidrug resistance (MDR) of leukemia cell. Meanwhile, we also found that higher expression of Bcl-2 gene and protein were exhibited in K562/AO2 cell compared with K562 cell. Basing on this, we hypothesized that the high expression of GCS gene which results in MDR of leukemia cell is correlated with Bcl-2 signal transduction. In order to validate the hypothesis, the inhibition of GCS gene in K562/AO2 cell was observed by using chemical suppressor PPMP and siRNA targeted at GCS, and applying RT-PCR and flow cytometry, the expression levels of apoptosis-related gene Bcl-2 and Bax were analyzed before and after inhibiting GCS gene in K562/AO2 cell. The results demonstrated that the gene and protein of Bcl-2 in K562/AO2 cell were both down-regulated significantly after GCS gene being inhibited; however, the Bax mRNA expression had no apparent change in different groups. This suggested that GCS gene may contributed to MDR of human leukemia cell K562/AO2 by Bcl-2 signal transduction.