Spyda基因过表达转基因小鼠品系的建立

目的建立Spyda基因过表达转基因小鼠品系用于深入研究Spyda基因的功能。方法利用Gateway技术构建Spyda表达载体,通过DNA显微注射的方式获得Spyda基因过表达的首建鼠。首建鼠与野生型鼠杂交,所得子代中的阳性鼠同窝交配,已传3代以后的阳性小鼠经SYBR Green实时荧光定量PCR方法检测外源基因的起始模板量,通过与杂合子比较来预测小鼠的基因型,再用传统育种方式验证SYBR Green实时荧光定量PCR的结果。结果获得7只首建鼠,通过与野生型鼠杂交获得阳性子代,进行同窝交配,传至第3代,经实时荧光定量PCR方法筛选出4只纯合子的小鼠,经测交验证,其与正常小鼠交配所生的后代均为阳性,证明实时定量PCR的结果是正确的。建立了2个独立的Spyda转基因小鼠纯合子品系。结论建立了稳定遗传的纯合子Spyda基因过表达转基因小鼠品系,可作为工具鼠进一步深入研究Spyda基因的功能。     

包含UI的人衰变加速因子重组基因在转基因鼠高效表达的研究

目的建立血管内皮细胞高效表达人衰变加速因子（hDAF）基因的转基因小鼠。方法采用受精卵显微注射法，将包含杂合内含子（UI）的人hDAF导入昆明白小鼠受精卵的雄原核内，然后将注射后仍健康的受精卵植入假孕母鼠输卵管内，待其自然分娩。应用聚合酶链反应（PCR）和Southern杂交检测G0代小鼠hDAF基因的整合情况，应用流式细胞计数（FCM）检测小鼠外周血单核细胞（PBMCs）表面hDAF的表达，应用逆转录（RT）-PCR检测转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏和肺脏人hDAF基因mRNA的表达。结果注射后卵的存活率和幼鼠出生率分别为83．8％（941／1123）和9．5％（89／941），外源基因的整合率为22．5％（20／89），FCM检测发现其中有7只转基因小鼠PBMCs有人hDAF表达，表达强度为人PBMCs的152％～243％，并且相应小鼠的心、肝、肾及肺组织均有人hDAFmRNA表达。结论UI可以使hDAF在转基因鼠各主要脏器高效表达。     

骨髓间充质干细胞向“类精子”分化的动物实验鉴定

目的:鉴定骨髓间充质干细胞(MSCs)异体移植后是否分化为“类精子”。方法:①制作睾丸去势的动物模型:取4周龄雄性白色BALB/c小鼠40只,用环磷酰胺腹腔注射法制作睾丸绝育的动物模型,随机分成实验组和对照组各20只;②制备种子细胞(MSCs):取5~6周龄雄性灰色129小鼠10只,以Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法分离、培养、纯化MSCs。待细胞生长至数量足够多时,用生理盐水制备成浓度为1×106/ml的细胞悬液;③异种系小鼠MSCs睾丸异体移植:实验组用盲打法给每只小鼠睾丸注射上述制备的129小鼠的MSCs悬液。对照组睾丸注射生理盐水;④移植后的观察:另取8~10周龄雌性白色BALB/c小鼠40只,分别与实验组和对照组的40只雄性小鼠按雌雄1∶1合笼,观察雌鼠受孕情况。结果:实验组:有8只雌鼠分别于合笼后31~46(平均38.5)d怀孕,受孕率为40%,产下的小鼠皆为白色。对照组:1只雌鼠怀孕,受孕率为5%,产下的小鼠为白色。子代鼠皆为白色,提示129小鼠的MSCs未能分化为有功能的“类精子”,使BALB/c小鼠的子代携带129小鼠的基因而呈现预想中的黑白相间的“花色”。两组受孕率差异有显著性(P<0.05),提示MSCs对睾丸损伤有促进愈合作用。结论:异品系的MSCs睾丸移植后未能分化为有功能的“类精子”,但对睾丸损伤有促进愈合作用。     

小鼠骨髓间充质干细胞移植异体睾丸的研究

目的:研究小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)移植异体睾丸。方法:①分离5~6周龄的BALB/c小鼠胫骨、股骨,冲出骨髓,用Percoll密度梯度离心法和贴壁法分离、培养、纯化MSCs。②取第3代MSCs,用Hoe-chest33342标记并观察,制备细胞悬液。③用睾丸网注射法将标记的MSCs移植入异体小鼠睾丸内,于各时相点取睾丸组织,在3个位点连续制作快速冰冻切片,镜下观察。结果:①传至3代即可得到数量较多的纯化的MSCs。②在荧光显微镜下,标记的MSCs细胞核呈亮黄色。③用睾丸网注射法行小鼠MSCs移植异体睾丸成功,未见免疫排斥反应发生。移植后1、3d,只在中间的切片上见到MSCs,细胞核呈亮黄色,两侧的切片未查到MSCs,移植后1d细胞较集中,移植后3d细胞散在分布;移植后6、9、12d,3个位点的切片均见MSCs,部分MSCs排列呈管状;移植后15、18d,MSCs的核荧光有所减弱;移植后21d,荧光消失。结论:用睾丸网注射法将小鼠MSCs移植异体睾丸获得成功,未见免疫排斥反应发生,移植后的MSCs存活。     

SHG-44绿色荧光裸鼠原位模型的建立

目的 建立SHG-44绿色荧光裸鼠原位模型.方法 将C57BL/6J-增强绿色荧光蛋白(ECFP)转基因小鼠与裸小鼠进行交配,在继代时严格挑选都表达EGFP基因的无毛雄鼠(♂)与有毛母鼠(♀)交配,通过肉眼、荧光显微镜和分子生物学等方法观察EGFP基因在裸小鼠全身各组织中的表达;将胶质瘤细胞株SHG-44(15μl,含1×106个细胞)注射于绿色荧光裸鼠的脑内制成原位模型.结果 每只种鼠平均产仔7～8只,其中纯合裸仔鼠有3～4只,比例接近1∶1;每代仔鼠通过小动物活体成像系统出生后2d就可鉴别其是否表达EGFP基因;器官及组织冰冻切片荧光显微镜下观察均见有绿色荧光;聚合酶链反应(PCR)结果表明脑组织、皮下肌肉、鼠尾和脚趾全部表达EGFP基因;原位模型的成瘤率达100％,瘤细胞依然具有人脑胶质瘤的基本特征.结论 表达EGFP基因的裸小鼠可用于肿瘤移植实验.     

川楝子油附睾注射对雄性大鼠的抗生育作用

将证明有生育力的成年ＳＤ大鼠５５只随机分为２组：实验组３０只，川楝子油两侧附睾尾部注射，１００μｌ／侧。对照组２５只，茶油附睾注射１００μｌ／侧，１０后，分别与证明有生育力的ＳＤ雌鼠交配，连续观察２月，生育率分别为２．１５，９／１０，而不影响性作交配，ＦＣＭ检查：川楝子油注射鼠睾丸生精细胞１Ｃ ＤＮＡ含量降低，２Ｃ含量明显升高，说明川楝子油可抑制ＤＮＡ合成，增强间质细胞的功能，有可能作为一种节育药     

转基因动物在肝癌研究中的应用

1982年，英国《自然》除志的一期封面上刊登了一幅体积硕大的小鼠照片，这就是一只转基因小鼠。由于小鼠基因组中转入了生长激素基因，使得体内生长激素分泌旺盛，导致体积增大。这在全世界引起轰动。目前，转基因动物主要是转基因小鼠，它的模型建立包括以下几个步骤：首先构建所要研究的转基因片段，然后给雌性小鼠体内注射激素，使雌鼠处于超排卵状态，并与雄性小鼠自然交配，取出受精卵在佩特里平碟上培育后，将转基因片段用微玻璃针注入未分裂受精卵的精原核内，培育该受精卵至两细胞阶段，再移植入雌性小鼠的生殖系统内，从而生育出转…     

建立血管内皮细胞组织特异性表达人衰变加速因子的转基因小鼠

目的为了研究异种移植，建立血管内皮细胞组织特异性表达人衰变加速因子(DAF)的转基因小鼠。方法采用受精卵显微注射技术，将含有人内皮细胞粘附分子-2(ICAM-2)基因启动子、人DAF cDNA(插有人DAF基因第一个内含子)、SV40splice／polyA的外源基因导人小鼠受精卵的原核中；选取注射后仍健康的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。聚合酶链(PCR)技术及Southern印迹杂交法确定外源基因整合阳性转基因小鼠。RT-PCR方法和流式细胞术分别用于外源基因mRNA及蛋白质水平表达的检测。免疫组织化学方法观察人DAF在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏等器官的表达分布。采用Langendorff心脏灌流装置，用200g／L的稀释人血清灌注转基因小鼠离体心脏，检测其抗超急性排斥反应能力。结果共产仔鼠133只，21只整合有外源基因，整合率16％(21／133)。8只实现mRNA及蛋白质水平表达，蛋白质水平表达强度为人DAF基因在人白细胞表达强度的70％至95％，转基因效率60A(8／133)。免疫组织化学法显示人DAF在转基因小鼠器官组织切片上有较强表达，且表达限于血管内皮细胞。与普通鼠对比，转基因小鼠离体心脏存活时间明显延长，且60min灌注期间内做功仍维持在最大值20％以上。结论成功地建立了血管内皮细胞组织特异性表达人DAF的转基因小鼠。这种小鼠有一定的抗超急性排斥反应能力。     

成骨细胞特异性过表达h1 calponin转基因小鼠的建立

目的为从整体动物水平研究碱性调宁蛋白（h1-calponin）在骨形成过程中的直接作用，我们构建了成骨细胞中特异性过表达h1—calponin的转基因小鼠模型，并对其表型进行了初步分析。方法构建在成骨细胞特异性启动子（collagen I promoter）驱动下表达h1—calponin的载体（pColl-calponin），纯化DNA片段，再以显微注射的方法将转基因片段导人小鼠受精卵，经移植后得到小鼠。PCR法检测整合到小鼠基因组中的外源基因，提取F1代阳性小鼠原代成骨细胞RNA，RT-PCR检测h1-calponin在小鼠成骨细胞中的表达情况，并观察转基因小鼠表型及体重变化情况。结果PCR检测结果显示1只Go代转基因鼠中检测到阳性信号，RT-PCR显示F1代转基因小鼠成骨细胞中表达h1—calponin较野生对照小鼠明显增加，且转基因小鼠体重与野生小鼠相比有明显降低。结论成功构建了在成骨细胞特异性过表达h1—calponin的转基因小鼠，为深入研究h1—calponin在骨骼发育中的作用提供了良好的动物模型。     

自发性炎性疾病双转基因小鼠的研究

目的 通过建立强直性脊柱炎HLA－B2704和hβ2m双转基因动物模型,证实HLA－B2704和hβ2m基因在双转基因小鼠自发性炎性疾病发病过程中的作用,为研究B27相关性疾病的病因学、预防和治疗提供有力的工具。方法 将HLA－B2704和hβ2m转基因阳性小鼠交配后出生的子代,应用PCR、斑点杂交、Southern杂交、RT－PCR、流式细胞术和免疫组织化学等方法进行筛选鉴定和表达检测。同时隔日观察小鼠的发病情况,发病鼠行HE染色观察病理变化。结果 有8只高拷贝双转基因小鼠2周左右出现皮肤病变,关节炎和趾甲变化等自发性炎性疾病表现,正常小鼠、B27单转基因小鼠和HLA－B27／hβ2m双转基因小鼠流式细胞计的检测结果分别为0．63％、7．87％、35．87％,双转基因小鼠的细胞膜表面可见HLA－B2704高表达,而在B27单转基因小鼠表达不明显。结论 HLA－B2704重链可诱发转基因小鼠发生自发性炎性疾病,hβ2m可与B27形成稳定的复合体,从而稳定和增强HLA－B2704在细胞膜表面的表达。