TRAIL真核表达治疗肝细胞癌作用的研究

目的：构建鼠源TRAIL（mTRAIL）真核表达质粒。研究其体内、外表达对肝癌细胞的诱导凋亡作用，抑制肝癌生长作用及与重组人FN多肽真核表达质粒pCH510协同抑制肝癌生长作用。方法：采用RTPCR及重组DNA技术构建mTRAIL真核表达质粒；体内、外进行基因转染；用流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡率，用TdTmediated dUTP nick end labeling (TUNEL)法及免疫组织化学技术检测肝癌细胞凋亡；小鼠实体瘤块模型研究基因转染抑制肝癌生长作用。结果：用RTPCR方法自小鼠脾细胞RNA扩增出TRAIL基因的全长cDNA，并克隆至真核表达载体pcDNA3.1中获重组质粒pX1；以pX1转染BHK细胞株后攻击肝癌细胞株H22细胞，可检测到肝癌细胞凋亡；肌肉内注射转染质粒DNA pX1，通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肝癌生长；pX1与FN多肽真核表达质粒pCH510有协同抑制肝癌生长作用。结论：质粒pX1可在细胞及小鼠体内表达；体内、外表达可诱导肝癌细胞凋亡并可通过该机制抑制肝癌生长；与FN多肽真核表达质粒pCH510有协同抑制肝癌生长作用。     

肝癌患者A-LAK细胞与苯乙酸协同抗瘤的观察

目的：构建重组人FN多肽的真核表达载体,研究体内表达对免疫细胞的趋化作用及抑制肿瘤的生长的作用。方法：采用重组DNA技术构建表达质粒;体内外进行基因转染;用Western blot方法鉴定表达产物;肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用;小鼠实体瘤模型研究基因转染抑制肿瘤生长的作用。结果：将人FN cDNA5'端非编码区及信号肽编码区、CH50多 编码区cDNA、人FN cDNA的3'端非编码区重组连接并插入pcDNA3.1质粒,构建出pCH510。以pCH510转染小鼠NIH3T3细胞,可以表在产生CH50多肽。肌肉内注射转染pCH510可对免疫细胞产生趋化作用,抑制实体肿瘤的生长。结论：质粒pCH510可在细胞中及小鼠体内表达;体内表达可对免疫细胞产生趋化作用,并可抑制实体瘤生长。     

重组FN多肽真核表达载体pCH510衔接化疗治疗小鼠肿瘤的研究

目的：研究肿瘤化疗后转pCH510质粒是否提高疗效,以及二者衔接是否需要特定的条件。方法：采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型：通过基因转染,观察pCH510对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH510转染的抑瘤效果;采用细胞培养技术,观察小鼠体内注射化疗药物后,其对小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞激活功能的影响;采用细胞计数的方法,观察化疗药物所致小鼠腹腔巨噬细胞和外周血免疫细胞数量变化的动力学;另外小鼠肿瘤化疗后第5天进行pCH510转染,观察抑瘤效果。结果：转染pCH510对不同接种量形成的小鼠肿瘤生长都有抑制作用,并呈负相关。化疗药物可使免疫细胞代谢降低,活化受阻,在化疗后第3天免疫细胞数降至最低,约10d左右恢复正常;化疗后立即连续10d转染pCH510质粒,疗效没有增强;化疗5d后,再连续15d转染pCH510质粒,则疗效明显增强。结论：化疗后转染pCH510质粒,对小鼠肿瘤治疗效果更好,但由于化疗既降低免疫细胞数量,又抑制其功能,化疗后立即转染pCH510质粒是不恰当的,并且转染治疗时间不宜过短。pCH510、化疗和化疗 pCH510三者对肿瘤不同抑制特点的比较显示化疗具有两面性,既抑瘤又捉瘤。     

VI-28胶囊辅助环磷酰胺治疗荷载LLC肿瘤小鼠的实验研究

目的:探讨经化疗药物作用后的H22细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性,观察TRAIL、纤黏连蛋白及内皮抑素的真核表达质粒pTRAIL,pCH510,pES联合化疗抑制小鼠肿瘤生长的作用。方法:pTRAIL转染BHK细胞后,加入分别经MMC,ADM,5-FU处理的H22细胞,MTT法检测pTRAIL对H22细胞的生长抑制作用,流式细胞仪分析H22细胞凋亡。在小鼠种植瘤体内注射MMC与pTRAIL,pCH510,pES,观察其对肿瘤生长的抑制作用。结果:pTRAIL能抑制H22生长并诱导细胞凋亡,与MMC,ADM及5-FU联合,H22的凋亡百分数分别为28.1%(P<0.01),22.5%(P<0.01)及47%(P>0.05)。体内,MMC+pTRAIL+pES+pCH510联合能有效抑制肝细胞肿瘤生长,肿瘤生成率为37.5%。结论:MMC或ADM作用后的残存H22肿瘤细胞对pTRAIL敏感,MMC+pTRAIL+pES+pCH510具有协同抑瘤效应,能将小鼠肝细胞肿瘤抑制在组织学水平。     

重组多肽CH50抑制肿瘤细胞侵袭生长和血管形成能力

目的观察纤连蛋白重组多肽CH50对小鼠肝癌细胞侵袭和肿瘤血管形成能力的影响,探讨CH50多肽治疗肿瘤可能的分子机制。方法接种H22肝癌细胞建立小鼠肿瘤模型,采用裸DNA-尾静脉注射方法在小鼠体内表达CH50多肽,进行基因治疗。HE染色观察治疗后肿瘤细胞侵袭能力和血管形成的改变;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和明胶电泳检测肿瘤组织边缘基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA和蛋白表达及活性;体外培养H22细胞,检测CH50多肽对相关基因表达和细胞黏附能力的影响。结果小鼠体内非定位转染表达CH50多肽,对肿瘤生长具有明显的抑制作用,接种后第16天,治疗组瘤重为(0．78±0．18)g,低于质粒对照组和空白对照组(P＜0．05);从组织水平观察,CH50多肽治疗导致肿瘤细胞大量坏死,可抑制肿瘤细胞侵袭生长和肿瘤血管生成,抑制肿瘤血管建立侧支循环。pCH510治疗组的肿瘤边缘组织中,活性型MMP-9的含量为3．2±0．7,显著低于空白对照组和质粒对照组,且活性型MMP-9占总MMP-9的比例也显著降低,是空白对照组和质粒对照组的1/4左右,但对MMP-9 mRNA表达没有明显影响。CH50多肽可下调H22细胞的αv、β3、cdc2基因的表达水平,降低H22细胞整合素αvβ3的活性。结论CH50多肽可以通过影响MMP-9和整合素αvβ3的功能起到抑制肿瘤生长、侵袭和肿瘤血管形成的作用。     

IL-24对B16细胞生长抑制作用的体内外实验研究

目的:构建白细胞介素24(Interleukin24,IL24)真核表达质粒,研究其体内外表达对肿瘤细胞的生长抑制作用。方法:采用重组DNA技术构建IL24真核表达质粒pEGFPIL24。用脂质体法将重组质粒及空载体体外转染B16细胞,再经激光扫描共聚焦显微镜(LSM)观察其表达,用MTT法检测B16细胞的体外增殖能力,用流式细胞仪检测细胞周期。小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤的体内生长抑制作用。结果:pEGFPIL24转染B16细胞后,LSM可观察到IL24在细胞中的表达。转染IL24基因的B16细胞体外增殖能力明显受到抑制,细胞被阻滞在G2/M期。与对照组相比,IL24基因治疗组肿瘤在体内的生长受到明显抑制,P<0.05。结论:IL24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑。于荷瘤小鼠的瘤内注射pEGFPIL24可抑制肿瘤生长,提示IL24具有明显的体内外抗肿瘤作用。     

siRNA表达载体介导的RNA干扰对肝癌细胞周期蛋白E1表达抑制研究

目的探讨经载体介导的RNA干扰对肝癌细胞周期蛋白E1表达抑制效率。方法针对周期蛋白E1基因设计并合成特定的RNA干扰模板片段，连接到pSilencer1．0-U6载体上构建siRNA真核表达载体；脂质体转染法将上述重组质粒转人BEL-7402肝癌细胞株。RT—PCR分析周期蛋白E1表达抑制率；流式细胞术测细胞周期S期和凋亡细胞比率；MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线。结果重组载体介导肝癌细胞BEL-7402周期蛋白E1抑制率达62％；转染重组质粒32h测得S期细胞为19％，空载体转染对照为27％；转染重组质粒96h流式细胞术测得凋亡细胞为13．1％，高于空载体对照的6．6％；细胞生长曲线作图表明，重组载体转染组细胞生长明显减缓。结论肝癌细胞周期蛋白E1的表达可被载体介导诱发的RNA干扰成功抑制，进而导致细胞生长受抑并诱导凋亡；本研究为探索肝癌的RNAi治疗提供了初步的实验依据。     

阳离子脂质体介导的小鼠白细胞介素2基因修饰肝癌细胞瘤苗

目的 研究阳离了脂质体介导的小鼠白细胞介素2基因修饰肝癌细胞瘤苗的抗肿瘤作用。方法 利用阳离子脂质体Transfectam,将携带小鼠白细胞介素2（IL－2）基因的真核表达南粒VR1110,导入小鼠肝癌细胞H22;采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测转染后经放射线照射、末经放射线照射和冻融后的细胞培养上清液中白细胞介素2的浓度;并研究转染后经放射线照射而制成的瘤苗的抗肿瘤效应。结果 转染后经放射线照射和末经放射线照射的H22细胞均持续分泌IL－2达30天以上;转染细胞在冻融后也能分泌IL－2;制备的瘤苗对小鼠肝癌模型肿瘤的生长有明显的抑制作用,并能明显提高荷瘤小鼠的生存率。结论 阳离了脂质体介导的小鼠细胞介素2基因转染后,能在肝癌细胞中有效表达,所制备的瘤苗可诱导有效的抗肿瘤效应。     

慢病毒载体介导端粒酶逆转录酶小干扰RNA治疗肝癌的实验研究

目的 探讨慢病毒介导的端粒酶逆转录酶(hTERT)小干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞生长的影响.方法 构建携带hTERT siRNA的慢病毒表达载体,在体外转染人肝癌HepG2细胞系,以MTT法测定细胞生长变化,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTERT mRNA的表达.将转染hTERT siRNA的HepG2细胞,接种于裸鼠腋窝皮下,观察移植瘤生长情况.取移植瘤组织,常规HE染色,行组织学观察,应用原位末端标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡情况.结果 hTERT siRNA转染HepG2细胞后,随着时间的延长,对细胞增殖的抑制作用逐渐增强,到第8天,干扰组细胞抑制率为57.5%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01).RT-PCR产物凝胶电泳图显示,hTERT siRNA转染后,肿瘤细胞的端粒酶活性明显下降.转染后72 h,干扰组hTERT mRNA的表达水平为0.035±0.007,明显低于空载体对照组(0.151±0.016)和空白对照组(0.155±0.014,均P<0.01).转染细胞皮下接种后,干扰组的肿瘤生长速度明显慢于两个对照组,随着时间的延长,差异越来越明显.移植瘤组织常规HE染色显示,组织坏死增多,周围炎性细胞浸润.TUNEL检测结果显示,细胞凋亡增多,增殖减慢.结论 慢病毒介导的hTERT siRNA转染能明显抑制肝癌细胞的生长.     

Cationic lipid-based delivery system for systemic cancer gene therapy

A cationic lipid-based gene delivery system composed of N-[(1-(2,3-dioleyloxy)propyl)]-N-N-N-trimethylammonium chloride and cholesterol, at a 4:1 molar ratio, was developed for systemic administration. Plasmid biodistribution and expression were characterized in syngeneic mouse tumor model squamous cell carcinoma VII cells. A reporter gene expression plasmid was used for biodistribution of plasmid and expression. The results showed that lungs and primary tumors were transfected. Fluorescence microscopy showed that fluorescent-labeled transfection complexes were passively targeted to the tumor vasculature and that the endothelial cells internalized the plasmid. Transgene expression was characterized based on duration of expression and dosing schedule. In vivo gene transfer with an interleukin-12 expression plasmid yielded protein levels in blood, lungs, and primary tumor after intravenous administration. Efficacy studies showed that 15 microg of interleukin-12 plasmid was sufficient to produce a gene-specific inhibition of primary tumor growth. These results characterize the vascularity of the tumor model, characterize the in vivo gene transfer properties of the plasmid-based gene delivery system, and show that the transgene expression level was sufficient to elicit a biological response by inhibiting tumor growth.     

HuR基因克隆及其在肝癌细胞中的表达

目的:克隆人抗原R基因（HuR）的cDNA,构建重组真核表达载体pEGFP-HuR,并稳定转染肝癌细胞株。方法:应用逆转录聚合酶链反应技术,从肝癌细胞中扩增得到人HuR基因的cDNA序列,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体中,经Xho I和EcoR I双酶切和DNA测序鉴定后,将重组真核表达载体通过脂质体法导入肝癌细胞中,利用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-HuR的肝癌细胞株,并用Western blot技术检测HuR基因的表达。结果:Xho I和EcoR I双酶切和PCR结果证实真核表达载体pEGFP-HuR构建成功。Western blot结果显示,在稳定转染重组真核表达载体的肝癌细胞中HuR基因表达水平上调。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-HuR,并筛选获得其稳定转染后HuR表达上调的肝癌细胞株,作为进一步研究HuR基因生物学功能的前期工作。     

PCNA的shRNA的真核表达载体的构建及对子宫颈癌细胞的干预性研究

目的构建PCNA的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在Hela细胞表达,同时观察PCNA的shRNA对人Hela细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法将PCNA的cD-NA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil-1,构建真核表达质粒pGenesil-1-PCNA1-4,并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil-1-PCNA1-4转染子宫颈癌细胞,运用Westernblot检测PCNA的蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果PCNA的shRNA能显著抑制人Hela细胞的生长,阻滞细胞G0/G1—S期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论PCNA的shRNA能显著抑制人Hela细胞的生长,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PC-NA的shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。     

miR-125a表达对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响分析

目的 探讨microRNA-125a（miR-125a）对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测人肝癌HepG2细胞及人正常肝细胞7702中的miR-125a水平,同时采用真核表达载体pGenesil-1质粒制备过表达miR-125a的重组质粒pGenesil-miR-125a及表达随机序列的阴性对照pGenesil-NC,根据实验设计将HepG2细胞分为3组：空白对照组、阴性对照组和过表达组,其中空白对照组未进行转染,阴性对照组和过表达组分别成功转染pGenesil-NC和pGenesil-miR-125a,待3组转染24、48、72及96 h后采用qPCR法检测各组的miR-125a水平,噻唑盐比色法检测各组转染24、48、72及96 h的细胞增殖率,分别采用Hoechst染色和流式细胞术检测转染24、48 h后的凋亡指数和caspase-3活化率来评价凋亡情况,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测各组转染48 h后的细胞周期,同时采用免疫印迹法检测转染48 h后对凋亡相关基因（Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3）表达的影响。结果 HepG2细胞中miR-125a水平为（0.24±0.06）,低于正常肝细胞7702细胞（P<0.05）;与阴性表达组相比,过表达组转染24、48、72及96 h的miR-125a水平升高,增殖率降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与其余两组相比,过表达组转染后的凋亡指数、caspase-3活化率、G0/G1期细胞比例及Bax和Cleaved caspase-3水平均升高,S和G2/M期细胞比例及Bcl-2水平均降低,以上差异有统计学意义（P<0.05）。     

Cyclin D1基因沉默对K562细胞增殖及凋亡的影响

[目的]利用RNA干扰（RNAi）技术观测其对白血病K562细胞cyelin D1基因的沉默效应及对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。[方法]体外构建靶向cyclin D1基因的小发夹RNA（shRNA）表达质粒．通过壳聚糖介导转染K562细胞，Western blot分析检测转染前后cyclin D1蛋白表达变化；集落形成实验检测细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况。[结果]构建靶向cyclinD1基因的shRNA表达质粒（pshRNA-419和pshRNA-575）经壳聚糖转染后，能显著抑制cyelin D1基因表达；抑制K562细胞增殖，影响其集落形成能力；细胞阻滞于G0／G1期，细胞凋亡明显。而m—pshRNA-790质粒并无上述生物学效应：[结论]cyclinD1基因表达下调可抑制K562细胞生长影响细胞周期分布并诱导细胞凋亡提示，因可能是白血病治疗的一个有效靶点。     

Knockdown of HBx by RNAi inhibits proliferation and enhances chemotherapy-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cells

The present study was designed to research on RNA interference hepatitis B virus x gene approach to hepatocellular carcinoma (HCC) therapy. Previously, we constructed and identified shRNA eukaryotic expression vectors (pshRNA-X220) specific to HBx gene, pshRNA-MOCK (control); and established HCC cell lines with stable expression shRNA eukaryotic vector targeting HBx gene—21543 cell lines (MHCC97-H of expressing shRNA against HBx), HK3 cell lines (MHCC97-H by transfected with pshRNA-MOCK). We examined the expression of HBx gene after RNA interference by semi-quantitative RT-PCR and assessed the effect of HBx knocked down on cell growth by proliferation assay using kit-8 (CCK8). As well as, we analyzed cell cycle distribution by flowcytometry and examined cell apoptosis using TUNEL assay. The HBx mRNA expression level is reduced, and cells growth was significantly stopped in 21543 cell lines. Cells with HBx knockdown were more sensitive to 5-fluorouracil/cisplatin. RNA interfering HBx induced an obvious time and dose-dependent inhibitory in comparison with the control cells. Meanwhile, RNA interferenced targeting HBx, in combination with chemotherapy can effectively induce apoptosis in hepatocellular carcinoma cells and restricts cell proliferation.     

以AFP为靶点的肝癌树突状细胞免疫治疗的实验研究

目的探讨AFP作为肝癌基因治疗和免疫治疗靶点的可行性以及AFP基因转染的树突状细胞（AFP-DC）疫苗对表达AFP肝细胞癌的免疫治疗作用.方法构建AFP-cDNA 真核表达载体,体外转染DC,制备AFP-DC瘤苗,诱导针对表达AFP的肝癌细胞株HepG2的特异性免疫反应,MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率.结果 AFP-DC瘤苗能够分泌AFP抗原,培养上清中AFP含量为0.8805 IU/ml,与空载体组和空白对照组相比,差异显著（P〈0.05）.免疫荧光检测可见AFP-DC胞浆及胞膜有AFP抗原分子表达;活化的CTL能够对表达AFP肝癌细胞起特异性杀伤作用,杀伤效率可达84.05%,与空载体组和空白对照组比较,差异显著（P〈0.05）.结论 AFP作为靶点治疗肝癌具有可行性,AFP可作为肝癌靶向治疗的新的突破点;AFP-DC疫苗可以作为表达AFP肝癌的一种免疫治疗手段,为DC瘤苗的临床应用奠定了基础.     

The soluble form of human leukocyte antigen class I antigen causes apoptosis on hepatocellular carcinoma cell lines

A soluble form of human leukocyte antigen class I antigen (sHLA-I) has been reported to cause apoptosis on cytotoxic T cells and inhibit killer activity of natural killer cells via killer-cell inhibitory receptors. However, its effect on cancer cells has not yet been elucidated. We examined the direct effect of sHLA-I on human liver cancer cell lines, HepG2, HLE and HLF. The effects of sHLA-I on cell growth, DNA synthesis, and apoptosis induction were evaluated. To elucidate the mechanisms, cDNA expression arrays were also examined. sHLA-I caused cell growth inhibition, resulting in apoptosis on human hepatocellular carcinoma, dose-dependently. In this process, caspase-3 was activated. sHLA-I also inhibited in vivo growth of hepatocellular carcinoma in severe combined immunodeficient mice. sHLA-I caused apoptosis on human hepatocellular carcinoma.     

TSLC1基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

Objective： To construct the eukaryotic expression vector for human TSLC1 gene, and to express TSLC1 in HepG2 cells for investigating its effect on HepG2 cell growth. Methods： Full length of TSLC1 cDNA was amplified from RNA of normal human liver by RT-PCR, and cloned into pCI-neo expression vector. The recombinant plasmid pCI-TSLC1 was identified with restriction enzyme and sequenced, and then was stably transfected into HepG2 cells with lipofectamine 2000. The positive clones were examined by western-blotting and immunofluorescence, cell growth was analyzed with MTT assay. Results： The eukaryotic expression vector pCI-TSLC1 was successfully constructed and the stable cell line highly expressing TSLC1 protein was obtained. The growth of TSLCl-transfected cells was significantly suppressed in vitro. Conclusion： The HepG2 stable cell line could highly express TSLC1 protein, which provided a basis for further exploring the roles of TSLC1 in hepatocellular carcinoma.