应用骨髓间充质干细胞复合关节软骨脱细胞基质修复兔软骨缺损的实验研究

目的研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合关节软骨脱细胞基质修复兔关节软骨缺损的效果。方法选取36只3~4个月龄的健康新西兰兔,分离其骨髓间充质干细胞(BMSCs),并在体外进行培养扩增。将BMSCs与关节软骨脱细胞基质在体外培养瓶中进行复合培养约3 d。将实验对象随机分为3组,分别进行3种不同的处理,实验结果用关节软骨组织学评分标准进行评分。结果移植手术后12周,移植培养好的骨髓间充质干细胞和关节软骨脱细胞基质复合物的实验组修复组织和周围组织整合良好,且修复效果显著优于移植单独的关节软骨脱细胞基质组和空白对照组。结论应用骨髓间充质干细胞和关节软骨脱细胞基质的复合物能有效的修复兔关节软骨缺损。     

体外组织工程软骨的构建及其对关节软骨损伤的修复

目的探讨体外组织工程软骨的构建及其对关节软骨损伤治疗的可行性。方法①体外分离、培养、扩增骨髓基质干细胞,诱导分化培养为软骨样细胞;②以胶原膜为支架在体外构建组织工程软骨;③建立兔髋关节软骨缺损动物模型16只,对照组8只,实验组8只;应用组织工程软骨修复兔股骨头关节软骨缺损,8、16周后观察修复效果。结果8周后大体标本显示关节软骨缺损为白色软骨样组织填充,组织切片显示缺损处有新生软骨形成,阿新兰染色和Ⅱ型胶原免疫组化检测有GAG和Ⅱ型胶原强阳性表达;16周后关节软骨缺损仍为软骨样组织修复,部分见表面粗糙,镜下见软骨细胞排列紊乱。结论体外构建的组织工程软骨可用于修复兔股骨头关节软骨缺损,较长期的观察结果显示有退变倾向。     

模拟微重力环境对小鼠成纤维细胞增殖和创伤修复相关蛋白基因表达的影响

目的：研究微重力细胞培养系统( RCCS)模拟微重力环境下小鼠成纤维细胞( L929细胞)增殖及创伤修复相关蛋白基因表达的变化。方法将L929细胞随机分为微重力组和正常重力对照组,分别在RCCS中培养3、5、7天,流式细胞仪检测细胞周期,实时荧光定量聚合酶链反应检测创伤修复蛋白mRNA表达水平。培养第7天取两组细胞-微载体悬液观察细胞微丝结构形态变化。结果微重力组L929细胞的G1期细胞在第3、5、7天明显少于正常重力对照组(P<0．05);与正常重力对照组相比,微重力组S期细胞在第3、5天有所增加,第7天减少,G2/M期细胞在培养第3、7天升高,培养第5天下降(P<0．05)。培养第3天微重力组Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ)、β转化生长因子( TGF-β) mRNA表达低于正常重力对照组( P<0．05);培养第5天微重力组Caspase-3 mRNA表达低于正常重力对照组,ColⅠ、TGF-β及Bcl-2 mRNA表达均高于正常重力对照组(P<0．05);培养第7天微重力组创伤修复相关蛋白mRNA表达均高于正常重力对照组( P<0．05)。模拟微重力环境下培养7 d对L929细胞微丝结构有影响但两组间差异无明显差别。结论模拟微重力环境能改变L929细胞周期转化、增强细胞增殖能力,并影响创伤修复相关蛋白的表达。     

快速构建组织工程化骨修复骨缺损的研究

目的探讨不同条件下所构建组织工程化骨对兔颅骨骨缺损修复的影响。方法制备兔双侧颅骨标准性骨缺损,并将动物分为3组,A组:两侧分别植入旋转式细胞培养系统(RCCS)培养8h(用R8表示)和静态培养8h(用S8表示)所构建组织工程化骨;B组:两侧分别植入RCCS培养24h(R24)和静态培养24h(S24)所构建组织工程化骨;C组:两侧分别植入RCCS培养72h(R72)和静态培养72h(S72)所构建组织工程化骨。分别于4、8和12周取材行大体和组织学观察,并对12周标本进行新骨形成面积定量分析和生物力学测试。结果与静态培养组相比,RCCS培养组,胶原和骨痂形成更多,骨小梁更厚,板层骨排列更规则。新骨形成面积定量分析,RCCS组成骨面积显著大于静态培养组(P<0.01)。生物力学测试也显示,RCCS培养组抗压强度显著高于静态培养组(P<0.01)。但R24组与R72组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论RCCS是快速构建组织工程化骨的理想方案,培养24h是较可行的选择。     

自体软骨细胞修复关节软骨缺损的实验研究

目的：探讨自体软骨细胞修复兔关节软骨缺损的技术和方法。方法：取兔自体关节软骨细胞，经体外扩增、^3H-TdR标记后与生物材料PluronicF127结合，修复人为造成的兔关节软骨缺损。结果：8周后关节软骨缺损由白色透明样软骨组织充填；12周后缺损修复，表面较光滑，组织切片显示软骨陷窝、基质均匀；放射自显影显示修复组织带放射活性。结论：组织工程技术是修复关节软骨缺损的较好方法。     

不同面积同种异体兔关节软骨移植的实验研究

目的观察不同面积同种异体兔关节软骨移植后的成活情况,评价其可行性并确定适宜的移植面积。方法60只成兔分为3组,分别造成双膝关节直径3 mm（A组）、5 mm（B组）、9 mm（C组）的圆形、全层软骨缺损。15只幼兔作为移植供体,将相应大小的幼兔关节软骨移植于成兔关节软骨缺损处,术后2、4、12、24周取标本行大体、光镜、电镜组织学动态观察并进行质量评估。结果3个实验组不同时期均能获得不同程度透明软骨修复,小面积软骨移植修复组织更接近正常软骨组织,大块软骨移植能较好地保持关节面的平整,但细胞退变明显。三组间组织学和组织化学评分比较,差异有统计学意义（P＜0．01）。结论不同面积软骨移植均可成活,大块软骨移植是可行的。     

壳聚糖/磷酸甘油复合浓缩自体骨髓修复关节软骨的实验研究

目的探讨壳聚糖/磷酸甘油（C/GP）复合浓缩自体骨髓修复兔关节软骨缺损的效果。方法选择3个月龄新西兰大耳白兔24只,双下肢髁关节面上共制作3个直径4mm、深2mm的全层软骨缺损,自左到右为：壳聚糖/磷酸甘油复合浓缩自体骨髓组（A组）,壳聚糖/磷酸甘油组（B组）,空白对照组（C组）。分别于术后4,8,12周各处死8只,应用大体观察、组织学观察及组织学评分评估缺损软骨的修复情况。结果 C/GP复合浓缩自体骨髓组术后12周、组织切片显示新生组织中可见大量类透明软骨细胞出现,修复组织和周围软骨整合良好。A组各个时间点组织学评分均低于于其他2组（P〈0.05）。结论 C/GP复合浓缩自体骨髓提高了对兔关节软骨缺损的修复效果。     

自体游离骨膜移植修复关节软骨大面积缺损的实验研究

目的 采用自体游离骨膜移植修复关节软骨大面积缺损，并对其组织形态学进行观察。方法 24只新西兰幼兔随机分成两组，用利刀切除股骨头全层关节软骨达关节软骨表面积的1/3，制成关节软骨大面积缺损模型。实验组取股骨全层游离骨膜，移植修复股骨头关节软骨缺损，对照组关节软骨缺损不作任何处理，于术后第4、8、12、24周取股骨头关节软骨进行大体，光镜观察，Wston-blot法检测关节软骨缺损的修复组织中Ⅱ型胶原蛋白。结果 骨膜移植24周后，肉眼下实验组关节软骨缺损区被透明，光滑的软骨覆盖，与周围正常关节软骨组织已难以区分，而对照组软骨缺损区在24周后仍清晰可见，基底部少量暗红色纤维结缔组织，光镜下，实验组移植4周后软骨缺损区被骨膜再生组织完全填充，为幼稚透明软骨；12周后新生软骨细胞明显增多，逐渐成熟，但排列紊乱；24周后新生软骨排列趋于规则，与周围正常透明关节软骨结构相似，甲苯胺蓝呈异染性。对照组24周后软骨缺损区由纤维样结缔组织覆盖，与周围正常组织分界清晰，边缘可见少量幼稚软骨细胞，甲苯胺蓝异染性不明显，通过Wston-blot法检测证实自体骨膜移植后第4周起关节软骨缺损的修复组织中Ⅱ型胶原蛋白呈持续高度表达。结论 自体游离骨膜移植于受损关节软骨，在一定条件下能演化形成关节透明软骨，可用于修复关节软骨大面积缺损。     

Matrigel凝胶和壳聚糖/磷酸甘油凝胶两种支架体外构建组织工程软骨的比较

目的 探讨适合构建组织工程软骨的细胞支架材料.方法 将体外分离培养的兔关节软骨细胞种植于Matrigel凝胶和壳聚糖/磷酸甘油(C/GP)凝胶两种支架上体外培养3周,对组织工程软骨进行大体标本、HE染色,ELISA检测培养上清液中透明质酸和Ⅱ型胶原的含量.结果 软骨细胞在两种支架内均生长良好,Matrigel凝胶中软骨细胞培养3周后仍能维持软骨细胞的表型,其分泌透明质酸和Ⅱ型胶原的能力较C/GP凝胶中软骨细胞强,并可更好的促进受损的软骨细胞增殖.结论 Matrigel凝胶和C/GP凝胶均可作为软骨细胞载体修复关节软骨缺损.Matrigel凝胶支架更适合软骨细胞的贴附生长,有利于维持软骨细胞的表型,是较好的软骨组织工程细胞支架.     

康复新液对兔膝关节炎软骨缺损模型的修复作用及机制研究

目的:探讨康复新液对兔膝骨性关节炎(KOA)软骨缺损模型的修复作用及其机制。方法:取雄性新西兰兔72只,随机分为模型对照组和康复新低、中、高剂量组,每组18只。采用麻醉后手术钻孔的方式造成兔右膝关节股骨内侧髁软骨缺损模型,然后立即在软骨缺损处进行关节腔注射给药,康复新低、中、高剂量组分别给予体积分数为20%、40%、80%的康复新液,模型对照组给予等体积生理盐水,0.2 mL/kg,每3天1次持续给药。于给药后第4、8、12周时,观察兔软骨缺损伤口修复情况;于给药完毕即刻和给药后第4、8、12周时,结合Wakitani评分标准对兔软骨缺损处修复组织进行组织学评分;于给药后第12周,采用Masson染色法观察兔关节软骨缺损处修复组织的病理学变化;采用酶联免疫吸附法检测兔关节液中一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化脂质(LPO)和尿液中吡啶酚(PYD)水平。结果:给药后第4、8、12周时,与模型对照组比较,康复新低、中、高剂量组兔软骨缺损区修复情况较好;给药后第4、8、12周时,与给药完毕即刻及同时间点的模型对照组比较,康复新低、中、高剂量组兔膝关节软骨缺损处修复组织形态学评分均显著降低(P<0.05);给药后第12周时,与模型对照组比较,康复新低、中、高剂量组兔膝关节软骨缺损处组织病理学程度明显减轻;给药后第4、8、12周时,与模型对照组比较,康复新低、中、高剂量组兔关节液中NO、LPO和尿液中PYD水平均有不同程度地降低,SOD水平均有不同程度地升高,到给药第12周时,各指标差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:康复新液对KOA软骨缺损模型兔的软骨损伤具有明显的修复作用,其作用机制主要与提高SOD表达并介导NO抑制软骨细胞凋亡有关。     

Molecular functions of FSTL1 in the osteoarthritis

Follistatin-like protein 1 (FSTL1) showed overexpression in the inflammatory synovial pannus, serum, and synovial tissues of osteoarthritis (OA) patients. However, FSTL1 knock out (KO) embryos exhibited reduced vertebral cartilage cellularity, extensive skeleton defects and reduced MSCs proliferation. Thus, the role of FSTL1 in chondrocyte proliferation is not completely understood. In vitro studies revealed that Human recombinant FSTL1 (hFSTL1) promoted chondrogenic signals in the MSCs and cell viability only at low concentrations. Recent reports suggest that high levels of FSTL-1 are proposed to enhance inflammatory signals which suppress chondrogenesis leading to cartilage destruction. Altogether, FSTL1 has the potential to promote MSC proliferation and chondrogenic differentiation in a low concentration-dependent manner. However, the mechanism by which FSTL-1 affects MSCs chondrogenic differentiation and chondrogenesis remains unknown. Therefore, this review introduces a deep discussion of FSTL1′s molecular functions in the OA pathophysiology, which will contribute to the deep understanding of FSTL1 molecular activity in the OA pathogenesis.     

瘦素对大鼠关节软骨细胞转化生长因子-β1表达的影响

目的探讨瘦素对大鼠关节软骨细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法培养大鼠关节软骨细胞,按实验方法将瘦素(浓度为10ng/ml)作用条件下培养的软骨细胞作为实验组、将单纯培养的软骨细胞作为对照组;于不同时间(12、24、36、48、72h)检测2组TGF-β1水平。结果 (1)采用细胞体外培养方法成功培养出大鼠关节软骨细胞,并通过形态观察和特殊染色得到证实。(2)实验组TGF-β1基因表达明显高于对照组,最佳时间为作用24～48h;继续瘦素刺激细胞增殖不明显,并有抑制作用的趋势。结论 (1)低浓度瘦素可显著提高软骨细胞的活性;(2)低浓度瘦素能有效维持大鼠关节软骨细胞的表型,抑制软骨细胞"去分化"和退变,并通过上调TGF-β1的mRNA表达促进细胞外基质II型胶原和蛋白多糖的合成分泌;(3)瘦素可加强TGF-β1的mRNA表达,以防止细胞外基质降解,有修复软骨的潜能。     

两种猪自体骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的比较猪应用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合直接贴壁法两种方法分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养效率,为临床应用提供理论依据和实验方法。方法取滇南小型猪的骨髓液用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合贴壁培养法两种方法分离猪骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,绘制其生长曲线,通过显微镜观察培养细胞的生物学形状。结果直接贴壁法收集到的细胞扩增速度较慢,密度梯度离心法收集到的细胞扩增速度较快,细胞培养后成梭形。结论密度梯度离心结合贴壁培养法较单纯的直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高。体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长稳定,增殖力较强。     

Tissue engineering strategies to study cartilage development,degeneration and regeneration

Cartilage tissue engineering has primarily focused on the generation of grafts to repair cartilage defects due to traumatic injury and disease. However engineered cartilage tissues have also a strong scientific value as advanced 3D culture models. Here we first describe key aspects of embryonic chondrogenesis and possible cell sources/culture systems for in vitro cartilage generation. We then review how a tissue engineering approach has been and could be further exploited to investigate different aspects of cartilage development and degeneration. The generated knowledge is expected to inform new cartilage regeneration strategies, beyond a classical tissue engineering paradigm.     

胰岛素对高糖所致鼠骨髓间充质干细胞增殖抑制的改善作用

目的研究胰岛素对高糖所致小鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)增殖抑制的改善作用并对其机制做初步探讨。方法首先鉴定MSCs纯度,然后给予25mmol/L葡萄糖干预,并分别给予不同浓度胰岛素予以干预,用MTT法检测细胞的增殖,并用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的改变,以期解释增殖的差异性。结果鉴定MSCs纯度>90%。胰岛素能够纠正高糖所致的MSCs增殖抑制作用(P=0.000),并且对细胞周期S期百分比没有影响(P=0.066),但是能够明显降低高血糖所致的细胞凋亡率(P=0.001)。结论胰岛素治疗对高糖所致的MSCs增殖抑制具有改善作用,凋亡率的变化可以部分解释这种作用。     

Proliferation and chondrogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells in sodium alginate beads with or without hyaluronic acid

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSCs) have attracted much interest as an alternative to autologous chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells for cell-based therapy to repair cartilage defects. Sodium alginate (SA) beads have been widely known as a conventional stem cell delivery system for cartilage repair. Hyaluronic acid (HA) has been known to induce cell proliferation and chondrogenic differentiation. Herein, we prepared AD-MSCs-encapsulating SA beads with HA (SA–HA beads) and without HA (SA beads). Then, the morphology, proliferation, and chondrogenic differentiation of AD-MSCs cultured in SA–HA beads or SA beads with a conventional chondrogenic media were evaluated. There was no discernible difference in the morphology of AD-MSCs between SA–HA and SA beads. However, the proliferation (MTT optical density and DNA contents) and chondrogenic differentiation (s-GAG contents and type II collagen staining) of AD-MSCs were significantly enhanced in SA–HA beads as compared to SA beads. The present results suggest that HA can be added to SA beads-based cell delivery systems of AD-MSCs in order to improve their chondrogenesis-inducing capacity for repair of cartilage defects.     

Effective gene delivery to mesenchymal stem cells based on the reverse transfection and three-dimensional cell culture system

Purpose

To enhance the level and prolong the duration of gene expression for gene-engineered rat mesenchymal stem cells (MSCs) using non-viral vector.

Methods

A novel transfection system based on reverse transfection method and three-dimensional (3D) scaffold was developed. The reverse gene transfection system was evaluated for transfection efficiency compared to conventional methods. Collagen sponge and polyethylene terephthalate non-woven fabric were introduced as scaffolds to perform 3D culture with reverse transfection. pDNA coding TGF??-1 was delivered to MSCs to assess its ability in inducing chondrogenesis with the 3D non-viral reverse transfection system.

Results

The reverse transfection method induced higher transgene levels than the conventional transfection in the presence of serum. The electric charge of the anionic gelatin plays an important role in this system by affecting the release pattern of the gene complexes and through the adsorption of serum protein to the substrate. During a long-time in vitro culture, MSCs cultured on 3D scaffolds exhibited a higher transgene expression level and more sustained transgene expression than those cultured and transfected on the two-dimensional substrate.

Conclusions

The combination of reverse transfection system with 3D cell culture scaffold benefits the cell proliferation and long-time gene transfection of MSCs.     

凝血酶-富血小板血浆复合物影响体外培养的人软骨细胞生长的实验研究

目的探讨凝血酶-富血小板血浆复合物对于体外培养的人软骨细胞生长的影响。方法制备凝血酶-富血小板血浆（PRP）复合物,取第三代软骨细胞,接种于96孔培养板,每组5孔,分为：阴性对照组、阳性对照组、实验组,用cck-8（细胞增殖）法检测各组OD值。结果实验组与阴性对照组、阳性对照组的软骨细胞增殖变化比较,均差异具有统计学意义（P〈0．05）;且实验组内,凝血酶为60U时对软骨细胞具有促增殖作用（P〈0．05）。结论凝血酶-富血小板血浆复合物能促进体外培养的人软骨细胞的增殖,以60U／ml为最适浓度,为进一步验证其可靠性,还有待于扩大样本或继续进行相应实验证实。