双歧杆菌、大肠杆菌菌体外多糖对iIEL激活作用的对比研究

目的：对比研究双歧杆菌、大肠杆菌菌体多糖对iIEL的激活作用。方法：采用Percoll非连续密度梯度离心法从小鼠小肠提取小肠上皮间淋巴细胞（iIEL）;应用有机溶剂提取扔双歧杆菌、大肠杆菌菌体多糖与iIEL细胞共同孵育作用后,检测iIEL细胞的自然杀伤活性、IFNγ和IL－2产生能力。结果：大肠杆菌、双歧杆菌菌体外多糖均能显著增强iIEL细胞的自然杀伤活性、IFNγ和IL－2的产生能力（P＜0．01）,双歧杆菌组的作用显著高于大肠杆菌组（P＜0．01）。结论：双歧杆菌和大肠杆菌菌体外多糖均对iIEL细胞具有免疫激活作用,但双歧杆菌菌体多糖的作用强。     

小鼠IL-17A-GST融合蛋白的克隆表达

目的: 构建含有小鼠IL-17A(mIL-17A)基因的重组原核表达载体,获得高效表达mIL-17A 的基因工程菌,以及较高产量的mIL-17A蛋白.方法:以PMA 活化后小鼠脾脏单个核细胞的总RNA 逆转录合成的cDNA为模板,PCR 法扩增mIL-17A的编码序列,并分别亚克隆至pMD18-T 载体和原核表达载体pGEX-4T-1 中,经酶切和DNA测序鉴定后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶切鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出可溶性IL-17A-GST融合蛋白. E3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶 鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出     

双歧杆菌、大肠杆菌总DNA对小鼠免疫功能影响的对比研究

目的提取双歧杆菌、大肠杆菌DNA,与iIEL细胞共同孵育,观察它们对IEL细胞的激活作用,并用DNA免疫小鼠,观察小鼠免疫功能的变化,探讨双歧杆菌、大肠杆菌DNA对免疫功能的影响,并作对比研究。方法以自然杀伤细胞（NK）活性,白细胞介素-2（IL-2）产生能力为指标,测定小鼠上述各项指标变化。结果小鼠以上两项指标与对照组相比有明显提高（P＜0.05）。双歧杆菌DNA提高小鼠NK活性与IL-2水平程度大于大肠杆菌DNA的作用（P＜0.01）。结论表明双歧杆菌DNA可快速激活NK活性,提高体内IL-2水平。其效能优于大肠杆菌DNA。     

双歧杆菌脂磷壁酸延缓脾脏衰老的研究

目的　研究双歧杆菌表面分子脂磷壁酸 (LTA)在D 半乳糖诱导的衰老小鼠体内 ,对脾脏指数和脾细胞DNA损伤的影响。方法　在建立D 半乳糖诱导的衰老小鼠模型的同时 ,注射双歧杆菌LTA ;然后测定模型对照组、正常对照组、试验组小鼠的脾脏指数 ,并以单细胞凝胶电泳试验检测脾脏淋巴细胞DNA氧化损伤的情况。结果　与正常对照组相比 ,模型对照小鼠的脾脏指数显著升高 (P <0 .0 5 ) ,脾淋巴细胞DNA受到了较严重的损伤 (P <0 .0 5 ) ;用双歧杆菌LTA处理后 ,试验小鼠的脾脏指数明显下降 (P <0 .0 5 ) ,脾淋巴细胞DNA的损伤程度显著降低 (P <0 .0 5 )。结论　双歧杆菌LTA能显著抑制衰老小鼠脾脏淋巴细胞DNA的氧化损伤 ,这可能与双歧杆菌抗衰老有关。     

青春型双歧杆菌脂磷壁酸对巨噬细胞的免疫活性影响

双歧杆菌的脂磷壁酸 (ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃａｃｉｄ ,ＬＴＡ)有较强的免疫活性作用 ,能激活巨噬细胞以及增强单核细胞的呼吸暴发。作者观察了青春型双歧杆菌的ＬＴＡ刺激小鼠腹腔巨噬细胞后分泌的ＴＮＦ α活性以及ＩＬ 12、ＮＯ的含量 ,同时检测巨噬细胞的体外杀瘤活性 ,旨在探讨它对巨噬细胞的免疫调节作用。材料与方法ＬＴＡ :按照文献从青春型双歧杆菌中提取ＬＴＡ。提取的ＬＴＡ分别经紫外扫描和化学组分分析证实无明显蛋白质以及核酸污染。被动血球凝集试验显示ＬＴＡ能自主粘附鸡红细胞。实验动物 :ＢＡＬＢ/ｃ小鼠 ,雌雄各半 ,…     

幽门螺杆菌全长hpaA基因克隆和在大肠杆菌中高效表达

为了构建幽门螺杆菌（H.pylori)全长hpaA基因表达质粒,在大肠杆菌中表达重组HpaA(reHpaA)蛋白,我们用PCR扩增全长hpaA基因,经适当的酶切－连接反应将其连入原核表达质粒pTrc99A,反应产物转化大肠杆菌JM105,用Amp( )培养基筛选,提取重组菌质粒,PCR和酶切鉴定,筛选阳性克隆,并用重组菌质粒进行hpaA基因测序。阳性克隆经IPTG诱导培养,用SDS－PAGE电泳和Western blot进行reHpaA表达分析和鉴定,用薄层扫描分析reHpaA含量。结果显示,重组质粒pTrc99A-hpaA经PCR和酶切后均产生783bp hpaA基因。重组菌能表达约30kD reHpaA蛋白,含量占全菌体蛋白量的51．99％,Western blot证实其有免疫反应性。重组H.pylori HpaA表达质粒的成功构建及在大肠杆菌中高效表达的实现,为探索制备H.pylori疫苗奠定了一定基础。     

葡萄糖6磷酸脱氢酶变异型基因研究——I.Gd(一)Taiwan-Hakka型部份基因克隆化分离和鉴定

本文从2例葡萄糖6磷酸脱氢酶变异型——台湾客家型[Gd(一)Taiwan-Hakka]患者基因组DNA中,回收经EcoRI完全酶解的3～5kb片段,与载体λgt10插入重组,用SMR10单菌种系统制备包装提取物,对重组的λgt10进行体外包装,构建成二个基因组基因丈库。用~(32)P标记的G6PD cDNA成功地从文库中初选出12个阳性克隆,挑选其中4个阳性克隆再次杂交予以证实,提取其中2个克隆DNA,经限制酶酶切电泳及斑点杂交鉴定,分离到该变异型基因的插入片段,并将其克隆到M13mp19噬菌体。在国内首次完成Gd(一)Taiwan—Hakka型部份基因克隆化分离与鉴定,为DNA序列分析寻找突变部位打下基础。     

一种从链霉菌和大肠杆菌提取大分子量总DNA的新方法

近年来,我们在进行基因工程试验中,探索建立了一种避免使用苯酚、简化操作程序的DNA提取方法。利用该法所得DNA不仅分子量大(约300kb),且纯度完全能满足内切酶消化,接连和转化。在提取链霉菌和大肠杆菌染色体DNA时,称1g湿菌体,加9ml溶菌缓冲液(50mMol/L Tris.Hcl PH8.0;25mmolL EDTA;0.3mol/l sucrose)。混匀菌体后加入1ml溶菌酶溶液(20mg/ml和200ul RNase     

DDC 对婴儿双歧杆菌SOD 酶活性的影响

目的:探讨二乙基二硫代氨基甲酸酯(DDC)对婴儿双歧杆菌超氧化物歧化酶(SOD)活性的作用。方法:采用厌氧活化扩增法培养婴儿双歧杆菌,根据绘制出的最适生长曲线,在平台生长期内加入不同浓度(200、1 000 mol/ L)的DDC 作用一段时间(0、0.5、1、2、4、24 h),然后离心收集细菌、进行超声破碎,测定细菌裂解液中SOD 的活性。作为阳性对照,我们也检测了DDC 对小鼠肠道裂解液中SOD 活性的影响。结果:我们发现上述不同浓度的DDC 作用于婴儿双歧杆菌一定时间后,对其SOD 活性无显著影响。动物实验表明DDC 作用于小鼠一定时间后,与对照组相比,其SOD 活性显著降低(P<0.01)。结论:DDC 影响小鼠体内SOD 活性,但不影响婴儿双歧杆菌SOD 的活性。推断婴儿双歧杆菌SOD 抑制剂不是DDC,SOD 抑制剂尚需进一步研究。     

克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内、外刺激肺上皮细胞分泌IL-8的研究

目的:通过比较肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae,Kp)分泌因子及菌体成分对经过digitonin处理和未处理的肺上皮细胞株IL8分泌的影响,进一步了解克雷伯杆菌诱导肺上皮细胞炎症反应的信号转导机制。方法:实验分为两组,一组使用能使细胞膜通透性增加的温和去污剂digitonin处理,而另一组不处理。分别用Kp03183的细菌培养上清和超声处理的菌体成分刺激肺上皮细胞株A549,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞IL8表达水平。并用RT-PCR的方法检测肺上皮细胞胞内模式识别受体NOD1的表达。结果:Kp培养上清对未经digitonin处理的细胞IL8分泌无明显增强作用,与对照相比差异无显著意义(p>0.05),菌体成分能刺激IL8分泌增加(P<0.01),但增高不超过一倍。经digitonin处理使细胞膜通透性增加后,Kp培养上清及菌体成分刺激细胞IL8的作用都增强,菌体成分刺激IL8效果更为显著,为对照的3倍,而培养上清作用相对较弱。RT-PCR检测结果表明,肺上皮细胞表达胞内模式识别受体NOD1。结论:菌体成分是诱导炎症反应更有效的刺激物,肺炎克雷柏杆菌侵入肺上皮细胞可能是引发细胞炎症反应的始动环节。肺上皮细胞表达胞内模式识别受体NOD1,它是否参与肺上皮细胞识别肺炎克雷伯杆菌菌体成分,值得进一步的研究。     

抗阿尔茨海默病Aβ人源单链抗体基因的筛选和表达

目的 从人源噬菌体单链抗体库中筛选与阿尔茨海默病发病中起关键作用的β淀粉样多肽(Aβ)1-42特异性结合的单链可变区抗体(scFv)基因,利用原核生物大肠杆菌进行可溶性表达,以获得抗AB1-42人源抗体.方法 利用噬菌体展示技术对人源噬菌体单链抗体库进行多轮富集,以Aβ1-42为抗原经酶联免疫吸附(ELISA)检测,筛选与Aβ1-42特异性结合的阳性噬菌体克隆,再用阳性噬菌体感染E.coli HB2151进行可溶性表达,经SDS-PAGE、Western blot及ELISA法检测scFv单抗的可溶性表达水平及抗原结合活性.并对阳性scFv抗体基因进行基因测序鉴定.结果 获得了7个特异性的抗Aβ1-42 scFv阳性噬菌体克隆,其中4个克隆ELISA检测吸光度值(A值)高于阴性对照5倍以上;其中1株(A 10)获得可溶性单链抗体的成功表达,表达产物主要位于菌体中,ELISA效价显示在全菌蛋白中A值高于对照5倍以上.其相对分子质量约为33 000.DNA测序表明所获抗体的可变区基因属于scFv抗体基因,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构.结论 用人源噬菌体单链抗体库筛选出抗Aβ1-42的人源抗体单链可变区基因,并成功表达了具有抗原结合活性的可溶性单链抗体,为进一步研究阿尔茨海默病的发病机制和治疗奠定了基础.     

CPT-Ⅱ基因4号外显子质粒构建与变异分析

背景：肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅱ(Carnitine palmitoyltransferase-Ⅱ, CPT-Ⅱ)位于细胞线粒体内膜上,是脂肪酸氧化过程中起关键作用的酶之一。目前关于流感病毒感染与CPT-Ⅱ基因变异尚未见报道。 目的：构建CPT-Ⅱ第4号外显子(E4)表达质粒及其核苷酸变异分析。 方法：从流感病毒感染2例患者外周血中提取DNA,以PCR法扩增CPT-Ⅱ基因的第4号外显子,将其片段插入pGEM-T载体,以T4 DNA连接酶,构建T-CPT-Ⅱ E4,转化大肠杆菌DH5α细胞,增菌,制备质粒,EcoR I酶切、测序和变异分析。 结果与结论：成功构建重组表达质粒pGEM-T-CPT-ⅡE4,经DNA测序,证实质粒中插入CPT-Ⅱ第4号外显子完整序列,全长1 305个核苷酸,编码435个氨基酸;与Genebank源序列对照比较,发现含有两个变异位点：1 618(GTC→ATC)和1 858 (TTT→TCT),对应氨基酸为V368I和F448L。     

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素2(hBD-2)mRNA的表达

目的 :检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞 β 防御素 2基因的激活作用及其活性组分。方法 :应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法和Northern杂交检测HT 2 9细胞hBD 2mRNA的表达 ;采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞壁蛋白质成份。结果 :RT PCR和Northern杂交分析显示 ,在正常培养条件下HT 2 9细胞无可见的hBD 2mRNA表达信号 ,但在双歧杆菌菌体、细胞壁和胞壁蛋白刺激下均检测出显著的hBD 2mRNA表达。结论双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD 2基因的表达 ,双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用的活性组分。双…     

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛与外膜基因融合DNA疫苗载体的构建

目的为增强问号赖型钩端螺旋体(017株钩体)内鞭毛抗原(flaB)与外膜抗原(ompL1)的免疫保护作用,克服保护性免疫持续时间短的难题,应用DNA重组技术以pcDNA3.1为载体构建-表达flaB与ompL1基因的融合DNA疫苗载体,以期注入肌体后能延长保护期,激发机体长期免疫.在pcDNA3.1载体上,ompL1与flaB前后相连,前者较后者先获得递呈,与钩体天然递呈过程相似,并且双嵌合基因可诱导机体产生针对2个不同抗原表位的抗体,从而增加免疫应答能力.pcDNA3.1载体能表达融合蛋白,并且具有CpGmotifs,因而可发挥佐剂作用.方法提取017株钩体基因组DNA,参照钩体特有的高度保守的flaB与ompL1序列,设计二对四条引物P1、P2、P3、P4.flaB与ompL1已被证实是两个良好的钩体疫苗候选抗原.通过聚合酶链反应(PCR),P1、P2引物扩增017株钩体的ompL1抗原基因;P3、P4引物扩增钩体的flaB抗原基因,分别经双酶切,以pcDNA3.1载体,将ompL1与flaB顺次同时定向嵌入同一pcDNA3.1中,获得重组质粒(ompL1与flaB),并将其转入JM109宿主菌中.在设计引物时,分别在P2、P3引物中,采用多个结构简单又不易形成折叠的甘氨酸作为接头,以维持其空间构象,不影响自然折叠,保持天然活性.结果经酶切鉴定证实有一1.8kb片段插入载体,进一步经酶切证实这一1.8kb可被酶切为9.6kb及8.5kb的片段,与预期的片段大小一致.以嵌合重组质粒DNA为模板,经PCR证实P1、P2引物扩增出9.6kb片段;P3,P4引物扩增出一8.5kb片段.重组质粒经DNA序列检测,其中ompL1与flaB序列与文献报道的完全一致.结论表达017钩体flaB与ompL1抗原的融合蛋白的DNA疫苗载体构建成功,从而为下一步表达复合功能蛋白,进行钩体免疫保护性研究打下了基础.     

人颗粒酶A活性段的表达、纯化及其活性鉴定

目的:克隆和表达人颗粒酶A(Granzyme A,Gzm A)基因的活性片段(active Granzyme A,a Gzm A)并进行活性鉴定。方法:以全长人Gzm A基因为模板,PCR扩增a Gzm A基因片段,限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后插入原核表达载体p ET24a(+),将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组蛋白用镍层析柱亲和层析进行纯化后,利用BLT底物溶液进行活性鉴定。结果:PCR扩增得到长约700 bp的基因片段。重组质粒p ET24a-a Gzm A经酶切和测序证实a Gzm A基因序列正确插入载体质粒中。SDS-PAGE显示在26 k D处有一特异性蛋白条带。Western blot证实该蛋白可与小鼠抗His单克隆抗体发生特异性结合。利用镍柱亲和层析法可从包涵体中纯化得到纯度较高的重组蛋白,且具有较好的酶活性。结论:成功制备了具有生物学活性的人颗粒酶A重组蛋白。     

乙型肝炎病毒preS1与肿瘤坏死因子融合肽基因的克隆和表达

为提高hTNFα和HBVpreS1(1～65)肽融合蛋白在大肠杆菌中的表达率,以及研究hTNFα和preS1(1～65)肽之间的联接肽段对hTNFα的影响,并引进蛋白酶切位点以利于融合蛋白中酶切制备preS1(1～65)肽,本文构建了5种含有两类不同基因接头和preS15′端经改造的hTNFα和HBVpreS1(1～65)肽的融合基因。然后分别将其插入表达载体pSB92中,并获得表达。SDSPAGE显示,不同结构的融合基因的表达水平不同,表达水平最高的pTPS5表达量达菌体总蛋白的60%。该表达产物经Westernblot验证,能分别特异地与抗hTNFα抗体与抗preS1抗体结合。稀释复性后,该融合蛋白还具有hTNFα的生理功能(对L929细胞的细胞毒活性),为一具有双功能活性的新的融合蛋白。经DNA序列测定表明,preS1(165)肽基因正确地融合在hTNFα基因之后。     

抗幽门螺杆菌多价蛋黄液IgY抗体的制备

目的制备特异性的抗幽门螺杆菌(Hp)多价卵黄抗体(Ig Y)。方法将纯化重组的Hp血型抗原结合黏附素2(Bab A2)、尿素酶B亚单位(Ure B)和鞭毛蛋白A亚单位(Fla A)三种抗原等比例混合免疫产蛋鸡,取其所产鸡蛋的蛋黄,采用水溶盐析法纯化Ig Y。采用SDS-PAGE、Western blot法及间接ELISA分析Ig Y的生物学特性,体外将(1、5、10) mg/m L Ig Y与Hp菌液共培养后测定A600值,分析Ig Y的抑菌效果。结果经产蛋鸡免疫,蛋黄液中Ig Y滴度可达1∶150 000。体外抑菌表明5 mg/mL多价IgY可显著抑制幽门螺杆菌的生长,且与抗生素阿莫西林联合使用可显著性抑制菌体生长。结论成功制备了抗幽门螺杆菌多价卵黄抗体。     

研制14型肺炎链球菌培养基和优化其荚膜多糖提纯的工艺

目的研制国产培养14型肺炎链球菌的培养基,然后制备和纯化该菌的荚膜多糖,并对其全过程的工艺进行优化。方法测试添加不同种血清、培养基成分对肺炎链球菌生长的影响,在此基础上对比进口培养基和本实验自制培养基培养细菌的效果。测试不同裂解细菌方案对获得荚膜多糖多少的影响,并比较DNA酶和RNA酶酶解方法和常规乙醇沉淀方法去除残留核酸的效果。结果实验室自配培养基与进口培养基均能使肺炎链球菌较好生长。用1%NP40加胰酶的裂解方法可使多糖从细菌菌体更好的释放,使用DNA酶和RNA酶去除残留核酸,在多糖产量和核酸去除效率方面都取得了较好的结果,再进一步纯化后可以得到较纯的多糖。结论本文在培养基国产化、菌体裂解后多糖释放和核酸去除三大方面为肺炎球菌荚膜多糖提取提供了有效可行的方案。     

利用DNA免疫法制备植物选择标记基因hpt表达蛋白抗体的研究

目的：制备转基因作物中选择标记基因——潮霉素B磷酸转移酶(hygromycin B phosphotransferase，hpt)基因表达产物的多克隆抗体，并探讨影响核酸免疫效果的因素及相应机制。方法：以hpt的cDNA全长插入真核表达载体pcDNA3中，并经限制性内切酶酶切及DNA测序鉴定。以纯化的重组质粒pCDNA3-HPT免疫BALB／c小鼠。用在E．coli中表达并纯化的(His)6—HPT进行ELISA，检测免疫过程中小鼠血清抗体效价的增长状况，并用Western blot检测抗血清的特异性。结果：经3次核酸免疫后，小鼠血清中未发现明显的抗HPT抗体一第4次加强免疫时，将小鼠分为3组，每组两只。第1组改用去内毒素的质粒提取试剂盒提纯的重组质粒免疫，第2组用(His)6-HPT融合蛋白免疫，第3组仍用原来提取的重组质粒免疫。结果发现，第1组小鼠抗血清的效价有所上升，经ELISA检测达1：200；第2组抗血清的滴度显著升高，达到1：2000；而第3组小鼠血清中仍未检测到明显的抗体：Western blot证实，前两组抗血清均可与亲和层析纯化的GST—HPT、(His)6-HPT融合蛋白及其诱导表达的相应菌体总蛋白发生特异性结合。结论：用DNA免疫法成功地制备了抗hpt基因表达产物的特异性抗体，但抗体效价不够理想。推测与hpt基因本身的性质及其在体内表达呈现的水平有关，可望通过州整影响核酸免疫的其他多种因素提高抗体的水平。     

双歧杆菌对裸鼠腹腔巨噬细胞产生细胞因子以及细胞毒活性的影响

目的探讨青春型双歧杆菌对巨噬细胞Μ功能的调节作用。方法将双歧杆菌注射于裸鼠腹腔 ,用小鼠胸腺细胞增殖法、L929细胞体外杀伤法及Griess试剂 ,分别测定裸鼠腹腔Μ产生的IL 1 ,TNF α及NO的水平 ;同时观察了Μ体外杀瘤活性的变化。结果双歧杆菌注射组裸鼠腹腔Μ产生的IL 1 ,TNF α及NO的水平分别为 :0.55±0.024(A值) ,(165±41)103U/L及(53±6)μmol/L ;对照组分别为 :0.34±0.021(A值) ,(12±6)103 U/L及(31±13)μmol/L。三组数据各自比较均有显著性差异(P<0.01)。同时 ,体外杀瘤活性也明显增强(P<0.01)。结论青春型双歧杆菌能激活Μ ,增强其杀瘤活性 ,并使之分泌大量的细胞毒性效应分子。