一氧化氮和caspase-3在多巴胺诱导PC12细胞

目的：探讨一氧化氮（NO）和半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）在多巴胺诱导PC12细胞凋亡中的可能作用。方法：流式细胞仪定量检测PC12细胞的凋亡率,原位末端标记法（TUNEL）观察凋亡细胞的形态,Griess法测定NO₂^-的浓度,荧光分光光度计法检测caspase-3的活力,半定量RT-PCR法检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达水平。结果：多巴胺（0.15-0.60 mmol/L）可剂量依赖性地诱导PC12细胞凋亡,表现为凋亡细胞的TUNEL染色阳性;iNOS mRNA的表达、NO的合成及caspase-3的活力均有明显的增加（P<0.01）;特异性的iNOS抑制剂aminoguanidine和caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO通过减少NO的生成和抑制caspase-3的激活阻断PC12细胞凋亡。结论：NO的生成可能是多巴胺诱导PC12细胞凋亡的触发因子,caspase-3的激活是其中的效应因子。     

PACAP促PC12细胞突起生长的分子机制

垂体腺苷酸环化酶激活肽 (PACAP)具有广泛的生理功能。近年来的研究发现 ,PACAP具有重要的神经营养作用。 PACAP可通过激活多条细胞内信号转导通路 ,促使 PC12细胞突起生长 ,使其向神经元样细胞分化。本文综述了 PACAP引起 PC12细胞突起生长的信号转导通路 ,有助于深入了解 PACAP神经营养作用的分子机制     

泛素－蛋白酶体途径降解胰腺癌细胞系中凝溶胶蛋白

目的 探讨胰腺癌中泛素-蛋白酶体途径对凝溶胶蛋白(gelsolin)的降解作用.方法 用特异性蛋白酶体抑制剂lactacystin处理胰腺癌细胞系BxPC-3和PANC-1,经Westem blot检测凝溶胶蛋白的表达,免疫沉淀细胞内凝溶胶蛋白,分析沉淀蛋白的泛素化.结果 BxPC-3细胞系经lactacystin作用12 h后,细胞内凝溶胶蛋白含量较对照组和处理前明显升高(P＜0.05),而且细胞内的凝溶胶蛋白表现出与泛素分子的相互作用.结论 泛素-蛋白酶体途径对凝溶胶蛋白的降解作用,可能是胰腺癌中凝溶胶蛋白表达降低的原因之一.     

IGF-1激活20S蛋白酶体β5亚单位活性对N2a细胞活力的影响

目的:探索胰岛素样生长因子(IGF-1)对蛋白酶体的作用,并观察其对小鼠神经母细胞瘤来源的N2a细胞活力的影响,寻找维持细胞活力的有效手段。方法:体外培养N2a细胞加入不同浓度的IGF-1后,分析N2a细胞肽基谷氨酰肽水解酶样(PGPH-L)、胰蛋白酶样(T-L)和糜蛋白酶样(CT-L)三种蛋白酶体活性的变化,real time RT-PCR比较分别具有PGPH-L活性、T-L活性和CT-L活性的20S蛋白酶体β1亚单位(PSMBI)、20S蛋白酶体β2亚单位(PSMB2)、205蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)mRNA水平的变化。双荧光素酶实验检测IGF-1对PSMB5转录活性的影响。CCK8实验和Hoechst 3342/PI染色实验检测IGF-1和PSMB5对N2a细胞活性和凋亡的影响。结果:应用不同浓度的ICF-I干预N2a细胞后,PGPH-L活性和CT-L活性均显著增高,其中CT-L活性升高最显著,50 ng/ml和100 ng/ml ICF-1干预后,CT-L活性分别是对照组的1.32倍(P<0.05)和1.49倍(P<0.01),但是IGF-1干预后T-L活性无显著变化;real time RT-PCR结果显示应用100 ng/ml ICF-1作用后,PSMB5和PSMBI的mRNA表达水平显著上升(P<0.05);双荧光素酶结果显示IGF-1能够上调N2a细胞PSMB5转录活性;CCK8实验和Hoechst 3342/PI染色结果表明IGF-1干预使N2a细胞活力增强(P<0.01),调亡细胞减少;相反,敲低PSMBS后,N2a细胞活力减弱(P<0.05),调亡细胞增多;使用IGF-I干预PSMB5-siRNA组,发现PSMB5-iRNA组细胞活力较NC-siRNA组降低(P<0.05)、凋亡细胞增加。结论:ICF-1通过激活CT-L蛋白酶体活性,提高N2a细胞的活力。     

内质网应激在Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡中的作用

 目的：探讨内质网应激在Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡中的作用。方法：在体外原代培养出生1~3 d大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。设计并化学合成3对靶向bim的siRNA,用脂质体法将siRNA转染心肌细胞,筛选沉默效率最高的siRNA。实验分组：（1）空白对照组;（2）缺氧组;（3）缺氧+脂质体组;(4)缺氧+阴性对照siRNA组;(5)缺氧+Bim-siRNA组。MTT法观察细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞内钙离子浓度变化情况;Western blotting检测内质网应激标志分子caspase-12和三磷酸肌醇（IP3）的表达情况。结果：免疫组化鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。在荧光显微镜下,转染了阴性对照siRNA组的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;Western blotting 结果显示,Bim-siRNA转染均能有效降低Bim蛋白的表达,其中第2对沉默效率最高,达到86.73%。缺氧损伤导致心肌细胞活性明显下降（P<005）,转染Bim-siRNA后细胞活性较阴性对照组升高。缺氧细胞凋亡率较对照组明显增加（P<0.01）,细胞内钙离子浓度明显增高,而沉默bim的表达能降低细胞凋亡率和细胞内钙离子浓度。缺氧导致内质网应激标志分子caspase-12和IP3表达较空白对照组明显上调（均P<005）,而抑制Bim表达后caspase-12和IP3表达明显降低。结论：沉默bim的表达能有效抑制缺氧导致心肌细胞凋亡的作用,内质网应激标志分子caspase-12和IP3可能参与了Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡的过程。这有望为临床心肌缺血缺氧损伤的治疗提供新思路。     

β-Catenin在雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞凋亡中的作用

目的:研究β-连环蛋白(β-catenin)在雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞凋亡中的作用及机制。方法:用雨蛙肽处理大鼠胰腺腺泡AR42J细胞,real-time PCR和Western blot检测细胞中β-catenin的mRNA和蛋白表达变化。在AR42J细胞中转染β-catenin过表达载体,用雨蛙肽处理后,用real-time PCR和Western blot测定过表达效果,MTT法测定细胞活力的变化,二硝基苯肼法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,碘-淀粉比色法检测淀粉酶(AMY)漏出率,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot检测细胞中内质网应激相关蛋白CHOP和cleaved caspase-12的蛋白水平。结果:AR42J细胞经雨蛙肽处理后细胞中β-catenin的mRNA和蛋白水平均降低(P0.05)。β-Catenin过表达载体转染可明显提高雨蛙肽作用下胰腺腺泡细胞中β-catenin的表达水平。雨蛙肽处理后的AR42J细胞活力降低,LDH和AMY漏出率升高,细胞凋亡率及细胞中CHOP和cleaved caspase-12的蛋白水平升高(P0.05)。过表达β-catenin可以提高雨蛙肽处理后的AR42J细胞活力,降低LDH和AMY漏出率,减少细胞凋亡,降低细胞中CHOP和cleaved caspase-12的蛋白水平(P0.05)。结论:β-Catenin可明显抑制雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞凋亡,作用机制与减少内质网应激有关。     

骨髓间充质干细胞通过上调EPO表达减轻缺氧损伤引起的PC12细胞凋亡

 目的：观察骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）对氯化钴（CoCl2）诱导的PC12细胞缺氧损伤及凋亡的影响并探讨其作用机制。方法：将PC12细胞分为以下几组：空白对照组、CoCl2处理组、BM-MSCs-siCTL+CoCl2处理组和BM-MSCs-siEPO +CoCl2处理组。应用MTT、流式细胞术（FCM）及Hoechst  33258染色法检测BM-MSCs对CoCl2诱导的细胞活性下降及凋亡的影响。采用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blotting检测BM-MSCs的促红细胞生成素（EPO）表达情况。同时通过RT-PCR法检测PC12细胞的Bcl-2与Bax表达情况。此外应用分光光度法检测caspase-9和-3活性。结果：MTT结果显示BM-MSCs共培养能够提高PC12细胞活力, 0.6 mmol/L CoCl2单独处理组24 h和48 h细胞存活率仅为（43.0±6.4）%和（33.8±5.7）%,1∶15细胞比BM-MSCs共培养24 h和48 h后细胞存活率明显上升,分别为（77.9±3.8）%和（75.2±9.7）%（P＜0.01）。RT-PCR 和Western blotting显示0.6 mmol/L CoCl2处理24 h和48 h明显诱导BM-MSCs的EPO表达上调,而EPO siRNA可完全抑制BM-MSCs的EPO表达（P＜0.01）。FCM及Hoechst 33258结果表明CoCl2处理能诱导PC12细胞损伤及凋亡,BM-MSCs-siCTL与PC12细胞共培养可有效抑制CoCl2的细胞毒性作用,减少细胞缺氧性损伤及凋亡,而EPO siRNA可明显阻断BM-MSCs的抗细胞凋亡作用（P＜0.01）。 RT-PCR结果显示BM-MSCs共培养组PC12细胞的Bcl-2表达较CoCl2处理组明显升高,而Bax表达较CoCl2处理组明显降低;EPO siRNA明显抑制BM-MSCs介导的Bcl-2表达升高和Bax表达降低（P＜0.01）。分光光度法结果显示BM-MSCs-siCTL共培养组的caspase-9和-3活性较CoCl2处理组明显降低,而BM-MSCs-siEPO共培养组的caspase-9和-3活性较BM-MSCs-siCTL共培养组明显增加（P＜0.01）。结论：BM-MSCs共培养能抑制CoCl2诱导的PC12细胞凋亡,其细胞保护作用的机制可能与其上调EPO的表达有关。     

Expression of caspase-3 in hippocampal formation and PC12 cells after amyloid β treatment

目的:体内外探讨caspase-3在海马结构神经元及嗜铬瘤细胞(PC12细胞)的表达及其分布规律.方法:选用24只3月龄雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组侧脑室注射10μg β-淀粉样蛋白(Aβ25-35),用免疫组织化学观察caspase-3在海马CA1、CA3区及齿状回的表达.将PC12细胞分为对照组、实验组(20 μmol/L Aβ25-35组),流式细胞术观察两组PC12细胞凋亡率；免疫细胞化学法观察PC12细胞凋亡基因caspase-3的表达.结果:模型组海马结构3个亚区神经元的caspase-3的平均光密度值均较对照组增高.PC12细胞实验组的凋亡率较对照组增加；实验组PC12细胞caspase3的表达较对照组上调.结论:海马CA1、CA3区及齿状回神经元发生了明显的凋亡,Aβ可通过激活促凋亡基因caspase-3诱导PC12细胞凋亡.     

β_1-肾上腺素受体自身抗体通过激活内质网应激诱导心肌细胞凋亡

目的:探讨内质网应激在β_1-肾上腺素受体自身抗体(β_1-AA)引起心肌细胞凋亡中的作用。方法:采用β_1-肾上腺素受体细胞外第二环抗原肽段主动免疫大鼠,应用SA-ELISA法检测大鼠血清中β_1-AA的水平,TUNEL染色检测心肌组织的凋亡水平,Western blot法和免疫组化法检测心肌组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)及caspase-12的蛋白表达。利用亲和层析法纯化的β_1-AA处理H9c2心肌细胞,CCK-8法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡;采用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)预处理H9c2心肌细胞,再给予β_1-AA干预,CCK-8法和流式细胞术分别检测细胞活力及凋亡的变化情况。结果:与对照组相比,主动免疫大鼠血清中β_1-AA水平在免疫2周时显著增加,进一步增加至8周,并且主动免疫2周大鼠心肌组织凋亡率明显升高,持续升高至8周。与对照组相比,主动免疫大鼠心肌组织中GRP78、CHOP及caspase-12的蛋白表达在免疫4周和8周时均明显增加。β_1-AA引起H9c2心肌细胞活力持续降低,凋亡明显增加。与β_1-AA单独处理组相比,内质网应激抑制剂4-PBA预处理H9c2心肌细胞可以有效逆转β_1-AA诱导的细胞凋亡增加和活力下降。结论:β_1-AA可以通过激活内质网应激诱导心肌细胞凋亡。     

DMT1在多巴胺能神经元变性中的作用研究

目的: 研究二价金属离子转运蛋白1(DMT1)在乳胞素(lactacystin)诱导的SH-SY5Y细胞中的表达改变,从而进一步了解DMT1在帕金森病(PD)神经元损伤中的可能作用机制。方法: 建立 lactacystin 损伤的SH-SY5Y细胞模型,用免疫荧光、Western blotting等方法检测细胞DMT1表达水平的变化;在高亚铁环境下,荧光探针DCFH-DA检测胞内氧化应激水平的变化,免疫组织化学法、Western blotting检测胞内α-突触核蛋白(α-SYN)聚合体的改变。结果: Lactacystin处理后,细胞活力呈浓度依赖性降低。与正常对照组相比,lactacystin处理组DMT1表达增加(P<0.01)。正常对照组、lactacystin处理组及Fe²⁺处理组3组比较,其细胞活力逐渐降低,胞内氧化应激反应逐渐增强,胞浆α-SYN低聚体(43-55 kD)表达量逐渐增多(P<0.05)。结论: Lactacystin诱导SH-SY5Y细胞高表达DMT1,增强细胞摄铁能力,这可能是铁直接或者通过氧化应激反应促进胞内α-SYN的错误折叠和聚集、最终导致PD神经元损伤的关键因素。     

Reassessment of the 12q15 deletion syndrome critical region

Interstitial deletions of the long arm of chromosome 12 are rare and only few cases have been reported in literature so far, with different phenotypic features related to size and gene content of deleted regions. Five patients reported a 12q15-q21 deletion, sharing a 1.3 Mb small region of overlap (SRO) and presenting with developmental delay, nasal speech and mild dysmorphic features.We identified by microarray analysis a new case of 12q15 deletion. Our patient clinical features allow the refinement of the SRO to CNOT2, KCNMB4, and PTPRB genes, improving genotype-phenotype correlations.     

Differential expression of mRNA encoding interleukin-12 p35 and p40 subunits in situ

Interleukin-12 (IL-12) is a heterodimeric cytokine that plays an important role in the regulation of the immune response. For biological activity the expression of both subunits of IL-12, p35 and p40, is required. Moreover, in the mouse the p40 chain of IL-12 specifically inhibits the effects of the IL-12 heterodimer. In the present study we have analyzed by in situ hybridization the expression of the p35 and p40 mRNA in the spleens of BALB/c and mutant (SCID, nude, beige) mice, unstimulated and after in vivo stimulation with lipopolysaccharide (LPS) and with staphylococcal enterotoxin B (SEB). In unstimulated spleens of BALB/c mice, p35 and p40 mRNA were only detectable in a few strongly stained single cells, p35 mRNA was expressed in addition weakly in the B cell areas. After injection of LPS or SEB, p40 mRNA was strongly induced in the T cell areas all over the spleen, whereas expression of p35 mRNA and its distribution pattern did not change. Surprisingly, most of the mRNA for p35 and p40 was localized in different areas of the spleen and was apparently produced by different cells. In macrophage-depleted spleens the increased expression of p40 mRNA in response to LPS was reduced but still detectable, demonstrating that other cells besides macrophages can up-regulate IL-12 p40 mRNA. Nude mice showed a stronger expression of p35 mRNA, SCID mice lacked the weak p35 staining of the B cell areas but showed a strong basal expression of both p35 and p40 mRNA and a focal response to LPS. The pattern of IL-12 mRNA expression in beige mice was the same as in normal mice. These data demonstrate a spatial dissociation of expression of the two chains of IL-12 and are compatible with a regulatory role of the isolated IL-12 p40 chain in vivo. In addition, they indicate that the demonstration of mRNA for both chains of IL-12 in whole tissues or cell mixtures is not necessarily indicative of functional IL-12.     

IL-12对BALB/c小鼠Th17细胞的分化的影响

目的: 观察细胞因子IL-12对Th17细胞分化的影响.方法: 小鼠脾淋巴细胞经抗CD3单克隆抗体(mAb)和不同浓度的重组小鼠IL-12刺激, 3 d后使用ELISA方法观察培养物上清液中IL-17的产生情况.并使用细胞内细胞因子染色的方法, 通过流式细胞术观察CD3 mAb和重组小鼠IL-12刺激对Th1和Th17细胞分化的影响.结果: Th17细胞不分泌IFN-γ、 IL-5、 IL-10等细胞因子, 不表达Foxp3, 是一个独立的细胞亚群.不同浓度的重组小鼠IL-12可以诱导抗CD3 mAb 的T细胞分泌IFN-γ, 并向Th1细胞方向分化.同时, IL-12可以抑制活化的T细胞分泌IL-17, 抑制T细胞向Th17细胞分化.结论: IL-12可以抑制Th17细胞的分化.     

五加皮抗肿瘤活性物质Age对单核细胞产生TNF-α和IL-12的影响

目的 :研究五加皮抗肿瘤成分Age对单核细胞功能的影响 ,揭示Age抗肿瘤机制。方法 :使用对TNF敏感的L92 9细胞采用生物法测定了TNF含量 ,用ELISA法测定了IL 12的含量。用RT PCR法分析了单核细胞的细胞因子mRNA表达。用同位素法分析了Age对单核细胞吞噬功能的作用。结果 :Age与单核细胞共同培养后 ,单核细胞TNF α、IL 12等细胞因子的产生明显增加 (P <0 0 1) ,而且有较好的量效关系。在单核细胞与LPS的培养液中加入不同浓度的Age ,经培养后与单独加入LPS相比TNF α分泌的量显著增加 ,显示了Age对LPS的单核细胞刺激有相加作用。经Age处理后 ,单核细胞的TNF α、IL 12等细胞因子的mRNA表达也明显增强。体内实验结果也显示 ,Age对单核细胞的细胞因子产生有一定的影响。荷瘤小鼠经口连续投入Age后 ,血清中和脾脏分离的单核细胞体外培养上清中TNF α和IL 12含量明显提高 ,单核细胞TNF α、IL 12mR NA表达也明显增强 (P <0 0 1) ,从蛋白水平和分子水平证明了Age对单核细胞的细胞因子产生有促进作用。结论 :中药五加皮抗肿瘤有效成分Age对单核细胞有较强的刺激作用。通过促进其细胞因子的分泌和吞噬功能的增强杀伤肿瘤或抵抗肿瘤发生 ,所分泌的细胞因子还可通过调节免疫功能达到治疗肿瘤作用。该结果对五加皮     

应用重组PCR技术克建人单链白细胞介素12融合基因

目的 构建人单链白细胞介素１２（ｈｓｃＩＬ－１２）融合基因并在真核细胞中进行表达,为进一步研究ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法 应用重组ＰＣＲ技术将ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位两段编码序列的ｃＤＮＡ通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３碱基序列进行前后拼拼（ＩＬ－１２ｐ４０－多肽接头－ｐ３５）,构建ｈｓｃＩＬ－１２融合基因,并进行核苷酸序列测定,进一步将ｈｓｃＩＬ－１２融合基因插入ｐｃＤＮＡ３．１真核表达载体中,转染ＣＯＳ－７细胞表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白,并行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 该融合基因经ＤＮＡ序列分析表明：ｐ４０、ｐ３５、ｌｉｎｋｅｒ的连接顺序、方向及序列完全正确,融合基因可在ＣＯＳ－７细胞中表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示该融合蛋白分子     

锌指蛋白KOX12单克隆抗体的制备及在肿瘤组织中的表达

目的：制备重组锌指蛋白KOX12（肿瘤相关蛋白）,并制备其特异性的单克隆抗体,用免疫组化观察它在肿瘤组织中的表达。方法：通过逆转录-酶链聚合反应（RT-PCR）得到KOX12 cDNA片段,构建真核表达质粒和原核表达质粒,在大肠杆菌M15和293T细胞中进行表达。以KOX12蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,用聚乙二醇（PEG）融合法进行细胞融合制备产生抗KOX12单克隆抗体的杂交瘤细胞株;该抗体用免疫组化法对结肠癌、肺癌组织进行染色。结果：构建了含KOX12的真核细胞和原核细胞的表达质粒,并表达及纯化了KOX12重组蛋白,建立了产生抗KOX12单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C8,酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质免疫印迹试验（Western blot）显示6C8对KOX12有高度的特异性,免疫组化染色结果提示在结肠癌组织和肺癌组织切片中有少数细胞呈阳性反应。结论：6C8单克隆抗体是锌指蛋白KOX12特异的单克隆抗体,该抗体为IgG1型、k链亚类免疫球蛋白。在肺癌组织及对肠癌组织中有阳性细胞可见。该文为KOX12蛋白的研究工作创造了一个平台,为肿瘤的防治提供了一条新的可能途径。     

绿脓杆菌制剂与IL-12在诱导人NK细胞IFN-γ产生中的协同作用

探讨绿脓杆菌制剂(piliated Pseudomonas Aeruginosa,PPA)与IL-12协同诱导人PBMC和NK细胞IFN-γ的产生。分离健康人PBMC和纯化NK细胞分别与培养液、PPA、IL-12或PPA+IL-12共同培养,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测无细胞培养上清中IFN-γ的水平。同时采用流式细胞仪在单个细胞水平上分析PPA和IL-12诱导IFN-γ产生的淋巴细胞亚群。结果显示,单独应用亚适剂量的IL-12或PPA刺激人PBMC或纯化NK细胞,不能诱导或只能诱导低水平IFN-γ的产生。当PPA和IL-12共同与人PBMC或纯化NK细胞孵育后,PPA呈时间和剂量依赖性与IL-12协同诱导PBMC和纯化NK细胞产生大量IFN-γ。细胞亚群分析的结果表明,PPA和IL-12协同诱导CD56+NK细胞产生IFN-γ,但对CD4+T和CD8+T细胞无明显作用。PPA与IL-12协同促进NK细胞IFN-γ的产生,提示PPA和IL-12能直接刺激NK细胞发生免疫应答。     

ADAM12在产前诊断中的的研究进展

ADAM12是新发现的细胞膜结合糖蛋白家族的一员，它在妊娠期妇女血清中水平显著增高，在胎儿染色体缺陷时降低，它的发现为临床筛查治疗疾病提供了新的靶点。     

人IL-12表达质粒联合含信号肽Mtb8.4基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果

目的研究结核分枝杆菌含信号肽Mtb8.4(MS)基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)联合免疫小鼠后,诱导的细胞免疫应答及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法将40只C57BL/6N小鼠随机分为联合免疫组(MS基因疫苗 hIL-12组)、MS基因疫苗组、卡介苗(BCG)组、空载体组和PBS组。将基因疫苗、空载体和PBS,经肌内注射免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次;BCG组经尾部皮下注射1×106CFU BCG免疫1次。采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子的水平;用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠细胞毒性T细胞的杀伤活性。用结核杆菌强毒株H37Rv静脉攻击小鼠后,计数肺和脾组织中结核杆菌的菌落数。对小鼠的部分肺和脾组织作病理切片,经HE染色观察组织病变的程度,经ZN染色检查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-2的水平,与BCG组相当,显著高于MS基因疫苗组,IL-4分泌减少,特异性CTL的杀伤活性增强,对小鼠结核杆菌感染有较好的免疫保护效果。表现为小鼠肺和脾组织中结核杆菌的菌落数显著减少,组织病变明显减轻,其效果与卡介苗(BCG)组相当,但优于MS基因疫苗组。结论以hIL-12表达质粒与MS基因疫苗联合免疫后,能显著增强MS基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。     

共表达不同水平的IL-12对于HBV DNA疫苗质粒免疫原性的影响

目的 在HBsAg DNA疫苗质粒中共表达IL-12佐剂分子,研究IL-12的表达水平对于HBV DNA疫苗质粒免疫原性的影响.方法 构建携带来源于中国地区C型HBV参照序列CHN-HBV07-C经密码子优化的preS2-S基因的DNA疫苗质粒pHBV,并将3个不同IL-12表达水平的佐剂分子表达盒序列分别克隆入该疫苗质粒中,通过瞬时转染293T细胞以检测重组质粒IL-12分子及乙肝表面抗原的表达情况.将不同IL-12表达水平的疫苗质粒免疫BALB/c雌性小鼠,IFN-γ的ELISPOT方法检测HBsAg抗原特异性的细胞免疫应答,化学发光定量ELISA法检测HBsAg特异的抗体水平.结果 成功构建3个不同IL-12表达水平的HBV DNA疫苗质粒,293T细胞转染结果显示:不携带IL-12分子表达盒的对照疫苗质粒pHBV的HBsAg表达水平可达70 ng/ml;低表达IL-12的疫苗质粒pHBV-12l的HBsAg表达水平为18 ng/ml;而高表达IL-12的重组疫苗质粒pHBV-12h的HBsAg表达水平仅为6 ng/ml.BALB/c小鼠的免疫结果表明:高表达IL-12分子的疫苗质粒pHBV-12h所诱导的细胞免疫及体液免疫水平相对于对照疫苗质粒pHBV均显著降低了.低表达IL-12分子的疫苗质粒pHBV-12l所诱导的抗体水平也显著降低了,但其细胞免疫应答水平却显著提高了.结论 在同一疫苗质粒中,高表达IL-12分子的质粒可能会影响到抗原蛋白的表达,而低表达IL-12分子的疫苗质粒却能增强细胞免疫应答.因此,平衡好佐剂分子及抗原蛋白的表达水平对于诱导高水平的免疫应答是个重要的因素.