肾综合征出血热病毒空斑法的研究

本文报道从选择细胞、摸索出斑条件开始,采用 H_(8205)株、118/76株及美国草原田鼠体内分离的 PH 病毒和流行性肾病(NE)等肾综合征出血热(HFRS)相关的病毒株,在 Vero E_6细胞上建立界限清楚呈圆形的空斑,空斑直径0.2～3mm,6～10d 出齐,空斑数与接种病毒剂量成正比,两者几乎呈直线相关。空斑可被高价特异性血清所中和,已建立的空斑法适于 HFRS 病毒的定量工作。     

新分离呼肠病毒的空斑试验及病毒纯化

目的：建立新分离呼肠病毒（reovirus）的空斑技术，进行病毒纯化，为呼肠病毒生物学和分子生物学的研究奠定基础。方法：4株新分离呼肠病毒的早代毒种经L929细胞连续传代，当产生细胞病变后进行空斑试验，加营养琼脂培养6d后加中性红，24h内挑取空斑，扩增一次后做PCR鉴定。取呼肠病毒PCR阳性病毒进行第2次克隆纯化。结果：4株新分离呼肠病毒经L929细胞连续传2～4代，均能观察到明显的细胞病变。用10^-3和10^-4接种L929单层细胞，第6～7天均能产生空斑，空斑呈圆形，直径为0．2～1．0mm，并分别测定其空斑滴度（PFU／ml）。两次纯化后进行PCR检测，呼肠病毒基因扩增阳性、脊髓灰质炎病毒基因扩增阴性。结论：4株呼肠病毒的空斑出斑规律，通过两次克隆，获得纯化的病毒。     

SARS病毒BJ01株空斑测定方法的建立

目的建立SARS病毒空斑测定方法，为SARS病毒生物学研究提供手段。方法将不同稀释度SARS病毒BJ01株分别接种Vero细胞单层，然后加营养琼盖。按Dullbecco R的方法计算空斑滴度。结果SARS病毒BJ01株加营养琼盖后，3天即可出现空斑，形态呈圆形，直径2．5-3mm，大小均匀。结论建立的SARS病毒的空斑方法稳定，出斑规律。     

5种虫媒病毒的细胞培养及空斑试验

目的 :选择一株对 5种虫媒病毒 :马雅罗病毒 (MAY)、西门利克病毒 (SFV)、墨累谷脑炎病毒 (MVE)、伊利乌斯病毒 (ILH)和布尼安姆韦拉病毒 (BUN)敏感的细胞用于这 5种病毒生物学性状的研究。方法 :将不同稀释度的乳鼠脑病毒悬液接种到BHK2 1 ,LLC_MK2 ,A549和C6 36传代细胞上 ,进行这 5种病毒的敏感性试验 ,选出一株对 5种病毒较敏感的细胞株 ;对敏感细胞株进行三因素三水平正交试验 ,探索细胞的最佳培养条件 ;进行 5种病毒的空斑试验。结果 :BHK2 1 细胞对 5种病毒细胞病变特征明显 ,出现时间较早 ,滴度较高 ,适用于 5种病毒的培养。在合适条件下 ,BHK2 1 细胞单层可以维持 7d以上 ,5种虫媒病毒在BHK2 1 细胞上出现了大小、形态都不相同的空斑。结论 :BHK2 1 细胞在 6 0 %DMEM培养液、30 %的 0 .5 %水解乳蛋白、10 %小牛血清、常量青、链霉素和 5 0 μg ml卡那霉素 ,保持pH 7.2条件下生长最好 ,能够满足 5种虫媒病毒生物学性状研究的需要。     

戊型肝炎病毒的空斑和空斑减少中和试验

目的：利用空斑和空斑减少中和试验,了解戊型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅｖｉｒｕｓ,ＨＥＶ）不同毒株之间的血清学关系。方法：应用２４ 孔聚苯乙烯细胞培养板培养Ａ５４９ 单层细胞,接种ＨＥＶ,琼脂糖凝胶覆盖,观察空斑形成特征,然后用其相应的兔免疫血清进行交叉空斑中和试验,并计算中和抗体滴度。结果：接种病毒后２４ ｈ 开始出斑,１４４ ｈ 达到高峰,３ 株病毒的空斑形成单位（ＰＦＵ／ｍ ｌ）分别为２×１０６、７×１０５ 和２×１０７。空斑直径在０．２～２ ｍ ｍ ,边界清晰。相应病毒的兔免疫血清均显示中和反应,能够抑制空斑形成。结论：ＨＥＶ ８７Ａ 株、Ｇ９３－２ 株和Ｆ８６ 株的空斑形成特征不同,交叉空斑中和试验表明,我国新疆地区暴发流行ＨＥＶ（８７Ａ 株）和广州地区散发流行的ＨＥＶ（Ｇ９３－２株）为同一个血清型,而来源于北非摩洛哥的毒株（Ｆ８６ 株）可能属于另一个血清型。     

人源H5N1亚型禽流感病毒株空斑特性和致病性研究

目的观察不同H5N1亚型禽流感病毒株空斑特性,对比研究不同空斑类型H5N1病毒致病性和复制能力差异。方法将不同稀释度的H5N1亚型禽流感病毒株分别接种于MDCK单层细胞,加盖营养琼脂,合适时间染色,观察不同H5N1亚型禽流感病毒株空斑形成特点,按照DullbeccoR的方法计算病毒PFU数;根据空斑大小进行挑选、纯化、筛选不同类型空斑病毒,测定这些病毒对Balb/c小鼠致病性差异和在MDCK细胞上复制差异。结果野生的人源H5N1禽流感病毒株在空斑形成上都存在不同程度的不均一性,空斑大小、形状差异明显:A/Vietnam/1194/2004(H5N1)以大圆形斑为主,夹杂少量小点状斑。A/Beijing/01/03(H5N1)大多数为中等大小空斑,并有少数针尖状斑。野生A/Vietnam/1194/2004经过分离纯化后,得到的两种空斑类型病毒在致病性和复制能力存在明显差异。结论野生的人源H5N1禽流感病毒株在空斑形成上都存在不同程度的不均一性,从野生病毒株中分离、纯化的大小斑病毒在致病性和复制能力上存在明显差异。     

基孔肯雅病毒基因组的制备及生物学活性检测

用PEG_(6000)沉淀法和蔗糖密度速率区带离心法对感染基孔肯雅病毒Ross株的鸡胚细胞培养液进行了浓缩提纯.随后经超速离心,冷冻真空干燥,获得了较纯的病毒干粉制剂.用酚-氯仿-异戊醇法提取出病毒核酸,具有典型的RNA紫外吸收特征,最大吸收峰在260nm处,最小吸收峰在230nm处,260nm/280nm≥2.0.最后用感染性空斑技术和麦胚体外翻译系统对所提的病毒RNA生物学活性进行了检测.     

肾综合征出血热病毒的空斑法研究(简报)

肾综合征出血热(HFRS)病毒的定量,长期来都是依靠免疫荧光法检测细胞的感染剂量来确度.空斑法在许多其他病毒的研究中证明不仅可以精确地定量病毒,而且还可以进行毒株优选、病毒特征等方面的研究.可是HPRS病毒生长周期长,细胞需维持较长时间,因此本病毒出斑困难,在国内虽有不少单位研究,但尚未见成功的报道.我们于1987年接受解放军总后勤部卫生部关于"HFRS病毒定量方法的研究"招标课题,进行了本病毒的空斑法研究.在对细胞进行挑选的基础上对出斑条件作了摸索,现已在VeroE_6细胞上成功地用国际标准毒株118/76株及自病人血中分离的H_8205株病毒制出了空斑.空斑呈圆形,界限清楚,直径0.2～3mm,6～10天空斑基本出齐,空斑粒与接种病毒的稀释度成比例.此2株病毒滴度相近皆在10~5左右,经多次试验重复,证实出斑条件稳定.特异性试验证实空斑可被HFRS病人血清中和.HFRS病毒空斑法的建立为我国不同地区流行性出血热的病毒分型、毒株的纯化研究等工作提供了一个良好     

辛德比斯病毒的电镜观察

辛德比斯(Sindbis简写SIN)病毒为披盖病毒科A属的主要成员与代表种。由于它能在鸡胚纤维母细胞上大量培养,出现空斑早,又不易致人疾病,故病毒实验室常用来进行各种项目的研究。本文就其在不同宿主细胞中的增殖及简易法免疫电镜观察结果作一简述。材料与方法病毒:SIN和WEE(西方马脑炎病毒用作对照)均为本实验室保存之毒种。     

痘苗病毒检测方法的建立

目的：建立痘苗病毒的检测方法。方法：采用细胞病变法观察痘苗病毒感染的HeLa细胞，通过电镜直接观察病毒颗粒的形态特征，观察鸡胚绒毛尿囊膜上形成的痘斑并用分子生物学方法分析痘苗病毒HA基因片段。结果与结论：痘苗病毒感染HeLa细胞34h后出现典型细胞病变。在病毒感染细胞47h后的培养上清和胞浆中均可通过电镜观察到病毒颗粒。感染的鸡胚绒毛尿囊膜上出现痘宽。进一步采用PCR法扩增病毒的HA基因，RFLP限制性内切酶片段多态性分析和序列测定证明该序列与已知序列一致。所建立的痘苗病毒系列检测方法。为天花相关病毒的实验室诊断奠定了基础。     

人尿激酶原工程细胞株CL—11G细胞外源因子的检测

目的：对工程细胞株的要求之一是不应被外源因子污染。因此有必要对表达人尿激酶原的工程细胞株ＣＬ－１１Ｇ进行外源因子的检测。方法：用普通肉汤,改良马丁和硫乙醇酸盐三种培养基对ＣＬ－１１Ｇ细胞进行培养,检查细菌和霉菌;用培养法;ＤＮＡ荧光染色法,单克隆抗体免疫荧光法及电镜检查支原体。用ＣＬ－１１Ｇ细胞悬液分别接种乳小鼠,成年小鼠,豚鼠,家兔,鸡胚及５种细胞,检查有无内外源性病毒污染。结果：ＣＬ－１１Ｇ细     

微量空斑减数试验测定干扰素活性的实验研究

作者建立了一种简便、快速的微量 VSV病毒空斑实验方法,并用该方法测定干扰素活性,结果表明,该方法敏感、快速,重复性好,可测定到0.5活性单位的干扰素,在36～48h可以完成。     

动物反录病毒与HIV关系的研究

采用F81及驴胚细胞可以大量生产猫白血病病毒及马传染性贫血病毒悬液。用PEG和(NH_4)_2SO_4等电点沉淀等简单程序制备出适于ELISA及Western印迹试验用浓缩抗原,并用此二抗原与AIDS病人血清进行交叉试验,证明它们之间存在共同抗原,此抗原可用于艾滋病病人血清抗体的测定,但滴度较低。     

人胚肺细胞对人冠状病毒的敏感性

人冠状病毒72-62和73-50干燥毒种,用人胚器官和原代人胚肾细胞合管培养未能引起细胞病变,而将病毒液接种到人胚器官细胞或人胚肺传代细胞第一代就能引起明显的细胞病变。新传代病毒经电镜及中和试验鉴定确属人冠状病毒。实验结果证明人胚肺传代细胞比原代人胚肾细胞敏感,为进一步研究人冠状病毒提供了一株敏感的细胞。     

用CMV和EBV抗原免疫家兔制备抗血清的研究

抗血清的纯度和效价的高低是抗原检测能否成功的首要条件,目前国外已用巨细胞病毒(Cytomegalo-virus,简称CMV)抗原免疫家兔、豚鼠、山羊等制备抗血清。国内已有人用爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus,简称EBV)制备单克隆抗体(未见商品),为了检测抗原的效价,故用来免疫家兔制备抗血清。本文用CMV AD-169株感染单层人胚肺纤维母细胞,取沉渣和上清抗原及EBV B95-8株培养的细胞沉渣抗     

小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建小鼠RelB基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默骨髓树突细胞(DC)的RelB基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于自身免疫病的防治提供研究基础.方法 利用Invitrogen公司在线软件设计小鼠RelB基因(NM_009046)shRNA序列,合成、退火形成dsoligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序,得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,转化stbl3感受态细胞,测序鉴定,在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和RelB基因重组慢病毒载体导入293FT细胞,包装成病毒后,收集病毒上清,采用系列稀释法测定病毒滴度.结果 测序结果显示pENTRTM/U6-RelB-shRNA为阳性克隆,将该阳性重组载体与慢病毒载体重组,转化,氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,U6前引物测序鉴定,测序结果 显示该重组慢病毒载体也为阳性克隆,在293FT细胞中进行病毒包装,收集上清并在-80℃贮存.系列稀释法检测病毒悬液的滴度为6×105TU/ml.结论 成功构建出小鼠RelB基因shRNA慢病毒RNAi表达载体,为制备致耐受DC和研究DC在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体.     

人用禽流感疫苗H5N1株三级毒种库的建立

目的:建立人用禽流感疫苗H5N1株三级毒种库,为生产疫苗提供毒种.方法:用SPF鸡胚培养病毒.对型别、滴度和无菌等各项检测合格后,建立人用禽流感疫苗H5N1株三级毒种库.结果:在33℃培养52 h条件下,毒种滴度为1:640～1:1 280;厌氧茵、细菌、真菌、支原体、血吸附病毒、非血吸附病毒和外源性禽白血病病毒检测均为阴性.将毒种在鸡胚上传至12代,滴度在1:320～1:640之间,中和抗体滴度在1:160以上,EID50在6.7以上;毒种HA、NA基因序列检测与公布的HA、NA基因序列的同源性达99.O%,代次之间达99.9%.结论:本工作为研制人用禽流感疫苗贮备了标准毒种.     

应用免疫电镜检出简易浓集的病毒

1971年kelen用琼脂浓集法制备免疫电镜样品,检测澳大利亚抗原成功后,现已用于多种病毒。本文报告了对该方法的改进及检测七种病毒的电镜观察结果。病毒冠状病毒、腺病毒(3和7型)、辛德比斯病毒、西方马脑炎病毒、基孔肯亚病毒、登革病毒(1—4型及新分毒株2株)和水疱性口炎病毒均为本实验室保存的毒株,分别培养于人胚肾原代细胞、白纹伊蚊传代细胞C_6/36纯株及鸡胚纤维母细胞。按常规方法收取感染病毒的细胞培养液,保存-20℃备用。     

戊型肝炎病毒F86株的某些生物学性状及分子生物学特征的鉴定

目的：对法国赠送的戊型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＥｖｉｒｕｓ,ＨＥＶ）Ｆ８６株进行生物学性状与基因特征的鉴定,并与我国分离的８７Ａ株病毒进行比较。方法：用常量法测定病毒的血凝滴度;微量滴定法测定在２ＢＳ、Ａ５４９、ＬＬＣ－ＭＫ２细胞中的病毒滴度;腹腔注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,３周后取血清进行抗体检测;利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从接种病毒的细胞培养液中直接检测病毒ＲＮＡ,ＰＣＲ阳性产物纯化回收后克隆并测序。结果：Ｆ８６株病毒血凝试验阴性;在２ＢＳ、Ａ５４９细胞中连传３代,病毒滴度稳定,在ＬＬＣ－ＭＫ２细胞中病毒滴度稍低;在接种Ｆ８６株病毒的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠中可检出特异性抗体;在其细胞培养物中检出ＨＥＶ聚合酶区一段核苷酸序列,测序结果与我国８７Ａ株的同源性为９８．７％。结论：Ｆ８６株病毒不能凝集人Ｏ型红细胞,对２ＢＳ、Ａ５４９及ＬＬＣ－ＭＫ２细胞均敏感,对ＢＡＬＢ／ｃ小鼠不致病。部分序列的测定结果表明该株病毒确为ＨＥＶ,从而由国外实验室证实ＨＥＶ可用人源性细胞分离。     

我国肠道传播戊型肝炎的病原形态学研究

采用简易免疫电镜方法，从我国新疆非甲非乙型肝炎病人粪悬液中检出含有小圆形病毒颗粒的阳性标本５例。经细胞培养，从接种含病毒的２ＢＳ细胞中分离到一株能引起细胞病变，具有血凝活性的病毒。电镜下可见感染细胞浆中呈现局灶性空泡，液泡病变区，并含晶格样排列的圆形病毒颗粒，核变形。该株病毒能被新疆疫区以及来自缅甸，印度，前苏联ＨＥ病人血清及美国接种ＨＥ病毒的黑猩猩急性期血浆所聚集，显示其间有密切血清学关系，提示