类胚体中残留未分化胚胎干细胞的初步研究

目的 探讨类胚体中残留未分化胚胎干细胞(ESC)的特性.方法 小鼠R1和Oct-4-GFP转基因ESC细胞株,体外类胚体分化20 d后消化打散,重新给予ESC常规培养液培养.观察类胚体中残留未分化细胞形态;流式细胞仪和免疫荧光染色检测和观察残留细胞表面标志物及体外再次分化能力.将残留细胞扩增后注射入裸鼠背部皮下和大腿肌肉内,6周后注射部位取材进行大体和组织学检查.结果 分化20 d的类胚体中存在残留未分化ESC,生长形态呈克隆样,表达SSEA1、CD31、CD9和Oct-4等未分化ESC标志;细胞能反复传代,并可在体外再次分化和残留.残留细胞注射部位形成畸胎瘤,瘤体组织中存在成熟的内胚层、中胚层和外胚层组织.结论 胚胎干细胞分化为类胚体后仍存在残留未分化全能ESC,残留细胞在体内、外可再次分化,并能在体外分化中再次残留.     

类胚体中残留细胞分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子的关系

目的 研究小鼠胚胎干细胞体外类胚体分化后残留未分化细胞的分化能力,探讨其分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子（LIF）的关系。方法 小鼠R1胚胎干细胞体外经20 d的类胚体诱导分化后,胰酶消化为单细胞悬液,在不含LIF的DMEM培养液中贴壁培养。扩增后的细胞用流式细胞仪分析未分化及分化表面标志（CD9、SSEA1和Flk-1）的表达情况。分别于再次类胚体诱导分化前后,RT-PCR检测Oct-4、Nanog、Rex1、FGF5、Nestin、Brachyury、Flk-1和GATA6表达。将扩增后的残留细胞注射至裸鼠皮下,检测畸胎瘤形成能力。Oct-4/GFP 转基因小鼠胚胎干细胞在半固体培养基上作单细胞分化,20 d后统计分化残留率。结果 在不含LIF的DMEM培养液中的残留细胞呈克隆样生长,表达未分化胚胎干细胞标志CD9、SSEA1、Oct-4、Nanog和Rex1。残留细胞体外可再次诱导分化,表达3个胚层的分化标志。残留细胞裸鼠皮下注射6周后形成畸胎瘤。单细胞分化实验表明,常规培养的小鼠胚胎干细胞中约14%的细胞具有分化残留能力。结论 残留胚胎干细胞全能性维持不依赖外源性白血病抑制分化因子;常规培养的胚胎干细胞仅部分具有残留能力。     

类胚体中残留细胞分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子的关系

目的 研究小鼠胚胎干细胞体外类胚体分化后残留未分化细胞的分化能力,探讨其分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子(LIF)的关系.方法 小鼠R1胚胎干细胞体外经20 d的类胚体诱导分化后,胰酶消化为单细胞悬液,在不含LIF的DMEM培养液中贴壁培养.扩增后的细胞用流式细胞仪分析未分化及分化表面标志(CD9、 SSEA1和Flk-1)的表达情况.分别于再次类胚体诱导分化前后,RT-PCR检测Oct-4、 Nanog、Rex1、FGF5、Nestin、Brachyury、Flk-1和GATA6表达.将扩增后的残留细胞注射至裸鼠皮下,检测畸胎瘤形成能力.Oct-4/GFP 转基因小鼠胚胎干细胞在半固体培养基上作单细胞分化,20 d后统计分化残留率.结果 在不含LIF的DMEM培养液中的残留细胞呈克隆样生长,表达未分化胚胎干细胞标志CD9、SSEA1、Oct-4、Nanog和Rex1.残留细胞体外可再次诱导分化,表达3个胚层的分化标志.残留细胞裸鼠皮下注射6周后形成畸胎瘤.单细胞分化实验表明,常规培养的小鼠胚胎干细胞中约14%的细胞具有分化残留能力.结论 残留胚胎干细胞全能性维持不依赖外源性白血病抑制分化因子;常规培养的胚胎干细胞仅部分具有残留能力.     

昆明小鼠胚胎干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 探讨体外分离培养、诱导胚胎干细胞(ESC)分化为神经干细胞(NSC)的方法.方法 自孕3.5d的昆明小鼠获得附植前的早期胚胎,在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养获得ESC克隆. 进行Oct-4免疫细胞化学鉴定、碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定及体外分化能力的鉴定.在无人重组白血病抑制因子(hLIF)存在的条件下将ESC悬浮培养4d,形成拟胚体(EB),再经全反式维甲酸(RA)诱导4d,在神经干细胞筛选培养基中扩增,采用免疫细胞化学方法检测NSC特异性标志物Nestin的表达.结果 所分离得到的ESC的AKP染色阳性,Oct-4表达阳性,符合ESC的一般特性.ESC经RA初步诱导,NSC选择性培养基筛选培养7d后,形成大量神经球样结构,所形成的神经球样结构呈Nestin抗原阳性.结论 体外分离得到的昆明小鼠ESC经RA诱导后,再经选择性培养基筛选培养可获得大量NSC,有望为神经系统损伤及神经变性疾病提供新的治疗途径.     

人类胚胎干细胞体外分化形成包含多种细胞的类胚体

目的:研究人类胚胎干细胞的体外多向分化能力.方法:胚胎干细胞在无饲养细胞、无碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、悬浮条件下培养形成类胚体.采用RT-PCR方法检测不同培养时间类胚体中某些功能细胞的特征分子标志.结果:在无饲养细胞、无bFGF、悬浮条件下培养,胚胎干细胞自动聚集形成细胞团,逐渐长大并分化为囊实性类胚体.RT-PCR显示,类胚体表达多种细胞前体及功能细胞的分子标志,如神经前体细胞、胰岛前体细胞以及成熟神经细胞、表达胰岛素的β细胞、表达胰高血糖素的α细胞和肝细胞等等.不同细胞标志在类胚体中出现的时间段有差异,先出现分化程度低的前体细胞分子标志,然后出现成熟细胞的分子标志.结论:人类胚胎干细胞体外可自然分化为表达多种细胞标志的类胚体,是进行深入体外诱导分化研究的基础.     

人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定

目的 建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性.方法 人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10 d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6 d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增.观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析.取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力.结果 诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变.免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin).流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志.特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强.结论 成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化.分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能.     

人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定

目的 建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性.方法 人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10 d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6 d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增.观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析.取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力.结果 诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变.免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin).流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志.特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强.结论 成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化.分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能.     

人脐带间充质干细胞作为维持人胚胎干细胞生长饲养层细胞的研究

目的寻找可以维持人胚胎干细胞未分化生长的人源性细胞作为饲养层细胞,从而解决使用鼠源性细胞作为饲养层带来的安全问题。方法尝试以人脐带间充质干细胞作为饲养层细胞来培养人胚胎干细胞,检验其是否可以维持人胚胎干细胞的未分化生长状态。用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,光镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测其表面标志;诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行分化。将人胚胎干细胞系H1接种于丝裂霉素C灭活后的人脐带间充质干细胞上,每隔5d进行一次传代。培养20代后,对人胚胎干细胞特性进行相关检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达、分化能力。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117,不表达CD14、CD38、CD133、CD34、CD45、HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能。人胚胎干细胞在人脐带间充质干细胞饲养层上培养20代后,继续保持人胚胎干细胞的典型形态,碱性磷酸酶染色为阳性,免疫荧光染色显示OCT4、Nanog、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60的...     

鼠尾胶原三维诱导E14小鼠胚胎干细胞分化为甲状腺类似细胞的初步研究

目的 在体外贴壁诱导E14小鼠胚胎干细胞分化为甲状腺细胞的基础上,不改变诱导因子,探索鼠尾胶原三维结构体外诱导胚胎干细胞分化为甲状腺细胞的可行性.方法 E14小鼠胚胎干细胞半固体培养基悬浮培养6 d生成拟胚体,随后在鼠尾胶原三维结构中继续诱导分化11d,全程添加诱导因子促甲状腺素及胰岛素,第14天时开始添加碘化钾.结果 拟胚体在鼠尾胶原上生长状态良好,分化细胞贴壁后逐渐陷入鼠尾胶原;电镜下诱导细胞高尔基体、内质网丰富,部分诱导细胞胞质内见不典型分泌颗粒,与人成体甲状腺细胞超微结构类似.结论 胚胎干细胞在鼠尾胶原三维结构中可以分化为甲状腺类似细胞,并具备合成、分泌的功能;三维结构为体外诱导胚胎干细胞分化为甲状腺细胞提供了新的方法.     

胸腺肽类药物对体外诱导ES细胞分化为T细胞的作用

 【目的】研究目前临床常用的增强细胞免疫功能的胸腺肽，胸腺5肽和胸腺素α-1在小鼠胚胎干细胞向T淋巴细胞分化过程中的作用。【方法】借助小鼠胚胎干细胞（ESC）体外自然分化形成的类胚体（EB）中含有三胚层细胞的独特细胞环境，加入多种细胞因子和胸腺多肽，体外诱导小鼠ESC向T淋巴细胞分化。利用流式细胞仪检测在三种不同胸腺多肽的诱导下．不同时间点的小鼠ESC来源的细胞表面CD3分子的表达水平。并在相应时间点通过RT—PCR检测与T淋巴细胞发育密切相关的Notch信号分子的转录水平。【结果】在加入胸腺肽和胸腺素α1诱导的实验组，均有细胞表达CD3分子，CD3^＋细胞的百分比随诱导时间的增加而增多；而加入胸腺五肽的实验组无CD3^＋细胞出现。加入胸腺素α1和胸腺肽的实验组．有Notchl及其配体delta-like-1和delta—like-4的转录；而加入胸腺五肽的实验组的细胞无Notch1及其配体转录。【结论】胸腺素α1或胸腺肽可能通过影响Notchl信号途径支持ES细胞向T细胞分化，而胸腺五肽无此作用。     

小鼠胚胎干细胞诱导为甲状腺细胞的实验研究

目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞（ESCs）分化为甲状腺细胞的可行性。方法E14小鼠ESCs诱导发育为拟胚体，再逐步添加促甲状腺素（TsH）、胰岛素（insulin）、KI等共培养。观察细胞分化过程的形态学变化，并以体外培养的成年小鼠甲状腺细胞为阳性对照；RT—PCR法检测甲状腺细胞分化相关基因TSHR、PAX8、NIS、TPO、Tg等表达情况：激光共聚焦显微镜双色荧光检测甲状腺细胞分化标记物PAX8和TTF-1的共表达；在荧光检测得甲状腺细胞分化率的基础上。送检电镜观察分化细胞的超微结构。结果诱导培养第6d分化细胞中有甲状腺细胞特有基因PAX8、NIS、TPO、Tg、TSHR的表达；第8d检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TSHR、TTF-1、PAX8、TTF-2的表达；细胞形态类似对照甲状腺细胞。结论ESCs经胚胎体发育阶段，在特定条件下可定向分化为甲状腺细胞。     

形成拟胚体细胞数量对小鼠胚胎干细胞心肌细胞及内皮细胞分化的影响

目的:探讨形成拟胚体(EBs)起始小鼠胚胎干细胞(ESCs)数量对心肌细胞及内皮细胞分化的影响。方法:将形成EBs起始ESCs数量为400,1 000,4 000的3个组(HD400,HD1000,HD4000)通过悬滴法促进其分化。免疫荧光检测TnT及CD31的表达;在不同时间点计算三个组搏动EBs百分比;RT-PCR检测Nkx2.5,GA-TA4,β-MHC,flk-1,CD31,tie-2基因表达水平。结果:通过悬滴法形成的EBs能够出现自发性搏动并且有TnT及CD31表达;HD1000组和HD4000组相比HD400组有更高的搏动EBs百分比及Nkx2.5,GATA4,β-MHC基因表达水平;HD400组相比HD1000组和HD4000组有更高的flk-1,CD31,tie-2基因表达水平(P<0.05)。结论:形成EBs起始ESCs数量是影响心肌细胞和内皮细胞分化的一个重要因素,起始细胞数量多则心肌细胞分化程度高,数量少则内皮细胞分化程度高。     

An Improved Method for Directional Differentiation and Efficient Production of Neurons from Embryonic Stem Cells in vitro

To establish a method of directional differentiation and efficient production of neurons from embryonic stem cells (ES cells) in vitro, based on the 4-/4 protocol described by Bain, a new method was established to induce ES cells differentiating into neurons by means of three-step differentiation using all-trans retinoic acid (ATRA) combined with astrocyte-conditioned medium(ACM) in Vitro. The totipotency of ES cells was identified by observation of cells‘ morphology and formations of teratoma in immunocompromised mice. The cells‘ differentiation was evaluated continuously by the detection of the specific cellular markers of neural stem cells, neurons and astrocytes,including nestin, NSE and GFAP using immunohistochemistry assay. The NSE positive cells‘ ratio of the differentiated cells was determined by flow cytometry. It was found that the transparent circular clusters surrounding embryoid bodies induced with combining induction protocol formed just after 24 h and gradually enlarged later. This phenomenon could not be observed in EBs induced only by ATRA. The NSE positive cells‘ ratio in the ceils induced with ATRA and ACM was higher than that of the cells induced by ATRA at different time points of differentiation, and finally reached up to 73.5 % among the total differentiated population. It was concluded that ES cells could be induced into neurons with high purity and yield by means of inducing method combining with ATRAand ACM.     

昆明小鼠胚胎干细胞大鼠侧脑室内移植诱导分化的在体研究

目的：探讨脑内微环境诱导胚胎干细胞向神经细胞分化的状况，确定胚胎干细胞脑内移植的最佳分化阶段。方法：将未分化的昆明小鼠胚胎干细胞和经维甲酸初步诱导分化的胚胎干细胞分别进行侧脑室内移植，通过苏木素伊红（HE）染色、尼氏染色和神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫组织化学染色，检测胚胎干细胞移植后的存活和分化情况。结果：未分化的昆明小鼠胚胎干细胞侧脑室内移植后．不能很好地向神经细胞方向分化，有形成畸胎瘤的倾向。而经维甲酸初步诱导分化的胚胎干细胞进行侧脑室移植后4周，移植物中有相当一部分细胞为NSE免疫阳性细胞．部分细胞的胞浆中可见尼氏小体。具有神经细胞的典型特征。结论：经过维甲酸诱导后，胚胎干细胞发生了向神经细胞的分化．在侧脑室微环境中可以存活．并朝着神经细胞方向分化。     

An improved method for directional differentiation and efficient production of neurons from embryonic stem cells in vitro

Summary To establish a method of directional differentiation and efficient production of neurons from embryonic stem cells (ES cells)in vitro, based on the 4-/4+ protocol described by Bain, a new method was established to induce ES cells differentiating into neurons by means of three-step differentiation using all-trans retinoic acid (ATRA) combined with astrocyte-conditioned medium (ACM)in Vitro. The totipotency of ES cells was identified by observation of cells morphology and formations of teratoma in immunocompromised mice. The cells differentiation was evaluated continuously by the detection of the specific cellular markers of neural stem cells, neurons and astrocytes, including nestin, NSE and GFAP using immunohistochemistry assay. The NSE positive cells' ratio of the differentiated cells was determined by flow cytometry. It was found that the transparent circular clusters surrounding embryoid bodies induced with combining induction protocol formed just after 24 h and gradually enlarged later. This phenomenon could not be observed in EBs induced only by ATRA. The NSE positive cells' ratio in the cells induced with ATRA and ACM was higher than that of the cells induced by ATRA at different time points of differentiation, and finally reached up to 73.5% among the total differentiated population. It was concluded that ES cells could be induced into neurons with high purity and yield by means of inducing method combining with ATRA and ACM. ZHOU Yufeng, male, born in 1974, Doctor in Charge     

诱导性多能干细胞相关基因Oct4、Sox2、Nanog的研究进展

诱导性多能干细胞(iPSCs)是将转录因子转入已分化的体细胞中,使其重编程而得到的类似胚胎干细胞(ESCs)的一种细胞类型。iPSCs细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与ESCs相似。iPSCs细胞假说一经提出,使得相关基因(如Oct4、Sox2、Nanog等)再次成为基础研究和基因治疗的重要选择。     

Establishment and characterization of two new human embryonic stem cell lines, SYSU-1 and SYSU-2

Background Human embryonic stem cells can propagate indefinitely in vitro and are able to differentiate into derivatives of all three embryonic germ layers. The excitement surrounding human embryonic stem cells lies largely in their potential to produce specialized cells that can be used for transplant therapies. However, further investigation requires additional cell lines with varying genetic background. Therefore, efforts to derive and establish more human embryonic stern cell lines are highly warranted. Methods Surplus embryos （blastocysts） from donors were used to isolate the inner cell mass by immunosurgery. All cells were cultured continuously on irradiated murine embryonic fibroblasts feed layer and likely human embryonic stem cell colonies were subsequently characterized by cell surface marker staining, karyotyping and teratoma formation. Results Two human embryonic stern cell lines （SYSU-1 and SYSU-2） were established from surplus embryos. The two lines express several pluripotency markers including alkaline phosphatase, SSEA- 4, Tra-1-60, Oct-4, Nanog and Rex-1. They remain in undifferentiated state with normal karyotype after prolonged passages and can form embryoid bodies in vitro and teratoma in vivo. Conclusion Two new human embryonic stem cell lines have been established from surplus embryos. They can be used to understand selfrenewal and differentiating mechanisms and provide more choices for regenerative medicine.