实时荧光PCR技术检测登革病毒的研究

目的：建立登革病毒的荧光定量PCR检测技术。方法：针对1-4型登革病毒3′端非编码区的一段高度保守序列设计引物和探针,建立登革病毒实时荧光PCR检测方法及定量的检测方法。并对10例ELISA法检测为登革病毒阳性的病例,取其发热1-2天的临床血清标本进行荧光定量PCR检测。结果：实时荧光PCR检测1-4型登革病毒均为阳性,该探针和引物是登革病毒检测的通用探针和引物。实时荧光PCR检测10份临床血清,6份为阳性,阳性率为60%。结论：实时PCR方法是一个快速、特异性强、敏感性高的检测登革病毒的方法,适用于登革热的临床早期诊断,具有很好的社会效益和经济效益。     

DNA微列阵技术检测戊型肝炎病毒方法的建立及初步应用

目的建立DNA微列阵技术检测戊型肝炎病毒方法,进而探讨该方法用于检测临床标本的可行性。方法通过生物医学数据库戊型肝炎病毒基因进行检索和筛选,应用分子生物学软件,进行序列分析、引物及探针设计,并进行验证,建立了戊型肝炎病毒DNA微列阵技术检测方法。结果试验所设计的探针仅与HEV的PCR产物杂交呈阳性,与乙肝、丙肝等对照病毒的PCR产物杂交呈阴性。敏感性试验显示,该方法比同巢式PCR方法检测戊型肝炎病毒敏感度要高,用该方法检测了长春地区50份疑似HEV临床病料,38份阳性;而用巢式PCR法扩增HEV ORF1基因确诊为阳性的只有35份。结论利用DNA微列阵技术检测戊型肝炎病毒方法,特异性和敏感性强,可作为HEV临床标本检测方法。     

登革病毒TaqManMGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法及应用于临床。方法根据1～4型登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列,设计一套型通用的引物和TaqManMGB探针,以4个血清型登革病毒标准株为标准,以日本乙脑病毒和丙肝病毒作阴性对照,以包含登革病毒2型标准株（DENV-2NGC株）3’非编码区349bD片段的质粒DNA作标准品,对引物和TaqManMGB探针的特异性、灵敏度进行分析,从而建立登革病毒实时荧光定量PCR检测方法。用该法对登革病毒野毒株和10份登革病毒患者血清进行检测。结果TaqMan实时荧光定量PCR检测的1～4型登革病毒标准株及野毒株均为阳性,日本乙脑病毒和丙肝病毒均为阴性;检测灵敏度可达到每反应2个基因拷贝;检测的10份登革患者血清样本中,8份检测结果为阳性。结论TaqManMGB实时荧光定量PCR方法是一个快速、特异性强、敏感性高的检测登革病毒的方法,适用于登革病毒的临床早期诊断。     

基于MGB探针法荧光PCR检测手足口病病原的研究

目的建立一种能同时检测EV71型、CA16型及其它肠道病毒的荧光PCR检测方法,主要用于手足口病病原的快速检测。方法针对肠道病毒的保守基因设计特异性引物和探针序列,优化荧光RT-PCR反应体系,构建标准的阳性质控模板,建立标准曲线,研究产品的检测限、重复性、特异性;同时对2015年6月份收集的26份阳性样品和10份阴性样品进行检测。结果试验得到了阳性重组质粒,线性范围在8×10~2 copies/μl~8×10~8 copies/μl范围内检测结果良好;优化后肠道病毒EVUN上下游引物和MGB探针浓度分别为0.50,0.50,0.30μmol/L,RT-PCR反应条件为:42℃30min,95℃3min;95℃5s,60℃35s,45个循环。检测限达到800copies/μl,变异系数CV≤5%,重复性好,特异性良好,与其他传染病毒无交叉反应;用该检测方法检测26份临床阳性样本和10份阴性样本,阳性检出率为100%(26/26),阴性检出率为100%(10/10)。结论试验所建立的荧光PCR检测方法,可用于临床对手足口病病原的快速检测。     

应用MGB探针检测人乙型肝炎病毒的基因型

目的检测血浆或血清样本中人乙型肝炎病毒HBV的基因型,建立了基于MGB探针的实时荧光定量PCR检测体系。方法在HBV基因组型特异性碱基的聚集区域设计荧光定量PcR引物及探针。为保证特征特异性及高分辨率,选择设计MGB探针,然后将PCR扩增的产物纯化后进行基因克隆．克隆成功后提取的质粒制备为阳性质控品,从而建立完整的MGB探针法的荧光定量PCR检测体系,最后对该检测体系进行方法学评价。结果成功建立了基于MGB探针的HBV荧光定量PCR的基因分型检测体系。方法学评价显示,该检测体系的灵敏度达50IU／mL;重复性好;特异性良好,以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性。结论本研究建立基于MGB探针的HBV荧光定量PCR的基因分型检测方法,可以很好地定性的检测血浆或血清样本及血液制品中的人乙型肝炎病毒HBV的基因型及含量,对于该疾病的临床治疗具有重要的意义。     

基于TaqMan探针的幽门螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的探讨基于TaqMan探针的幽门螺杆菌23SrDNA基因片段的实时荧光定量PCR检测的有效方法。方法根据幽门螺杆菌23SrDNA序列设计引物和探针,构建质粒标准品,建立实时荧光定量PCR体系并进行方法学评价,并对2012年5月至10月收集的100份临床样本进行检测同时应用免疫组化及银染方法进行比较分析。结果建立了检测23SrDNA的实时荧光定量PCR方法：107-102copies/ul范围内均有＂S＂型扩增曲线,最低检测浓度为102copies/ul,标准曲线相关系数为1。对临床其它消化道病原体不出现特异性的扩增曲线。对100份样本进行检测,实时荧光定量PCR能检出31份阳性,而免疫组化方法能检出25份阳性,银染方法能检出28份阳性。结论实时荧光定量PCR方法可成功检测幽门螺杆菌,且该方法具有灵敏度和特异性高及重复性好等优点。     

肾移植后BK病毒感染者实时荧光定量PCR检测

背景：对于BK病毒感染、BK病毒相关性肾病的认识缺乏规范的实验室诊断程序和标准化的无创性检验方法。目的：建立肾移植后患者尿液和外周血BK病毒感染负荷实时荧光定量PCR检测方法。方法：针对BK病毒基因组,自主设计特异性引物BKV-F和BKV-R,Taqman荧光探针BKV-P,Taqman荧光探针BKV-P的5’端标记有荧光基团,在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团;然后处理待测样本,进行PCR反应。结果与结论：将检测阳性的扩增产物进行基因测序,测序结果经BLAST比对后证实为BK病毒基因序列;利用上述方法对56份样本进行检测,其中,20份BK病毒血清样本及20份BK病毒尿液样本检测均为阳性,有S型扩增曲线。动态范围测定显示在103～1010copies/mL之间标准曲线具有良好的相关性。5份健康人尿液样本,5份血液样本及6份临床常见的其他病原体血液样本检测均为阴性,无S型扩增曲线。结果表明该方法可进行定性、定量检测,特异性好,反应快速,一般30min即可得到反应结果,并且成本低、假阳性少。     

肾移植后BK病毒感染者实时荧光定量PCR检测

背景:对于BK病毒感染、BK病毒相关性肾病的认识缺乏规范的实验室诊断程序和标准化的无创性检验方法.目的:建立肾移植后患者尿液和外周血BK病毒感染负荷实时荧光定量PCR检测方法.方法:针对BK病毒基因组,自主设计特异性引物BKV-F和BKV-R,Taqman荧光探针BKV-P,Taqman荧光探针BKV-P的5'端标记有荧光基团,在除5'端外的任意一个位置上标记有淬灭基团;然后处理待测样本,进行PCR反应.结果与结论:将检测阳性的扩增产物进行基因测序,测序结果经BLAST比对后证实为BK病毒基因序列;利用上述方法对56份样本进行检测,其中,20份BK病毒血清样本及20份BK病毒尿液样本检测均为阳性,有S型扩增曲线.动态范围测定显示在103~1010 copies/mL之间标准曲线具有良好的相关性.5份健康人尿液样本,5份血液样本及6份临床常见的其他病原体血液样本检测均为阴性,无S型扩增曲线.结果表明该方法可进行定性、定量检测,特异性好,反应快速,一般30 min即可得到反应结果,并且成本低、假阳性少.     

禽流感病毒H7N9型 实时荧光定量RT-PCR检测方法的研究

目的 建立一种快速准确诊断禽流感病毒H7N9型的实时荧光定量RT-PCR检测方法。方法 参照国家生物技术信息中心(NCBI)公布的H7N9基因HA序列,设计特异性引物及TaqMan探针; 构建阳性重组质粒,验证其最低检测拷贝数、重复性及特异度。结果 试验构建的阳性重组质粒,线性关系在6×10² copies/μl～6×10⁸ copies/μl范围内检测结果良好; 用该方法测得最低拷贝数为600 copies/μl,特异度和重复性(CV<1%)良好,无交叉反应; 用该荧光定量RT-PCR检测方法检测8份阳性样品和8份阴性样品,准确率为100%(16/16)。结论 实验建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于禽流感病毒H7N9型的快速检测。     

2017-2020年上海市戊型肝炎病毒基因型特征研究

目的 研究2017-2020年上海市急性戊型肝炎(戊肝)患者及猪胆汁样本中获得的人源与猪源戊肝病毒(HEV)序列基因型特征.方法 对样本进行HEV抗体检测、HEV RNA荧光定量PCR检测、巢式PCR特异性扩增,对获得的HEV核苷酸序列进行深入研究,包括进化分析、基因型及亚型分析、同源性分析等.结果 从525份急性戊肝...     

EV71-CA16肠道病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒的研制

目的研制一种能同时检测EV71,CA16肠道病毒的二联实时荧光定量PCR检测试剂盒,主要用于EV71,CA16肠道病毒的快速检测和流行病学监测。方法设计特异度的EV71型、CA16型基因的引物和探针,优化实时荧光定量PCR检测体系,并研究产品的灵敏度、精密度、稳定性和检测线性范围;同时对2014年5月份收集的26份样品进行检测。结果试验得到了阳性重组质粒,线性范围在5*102 copies/μl～105 copies/μl,该范围内检测结果良好;优化后肠道病毒CA16上下游引物和探针浓度分别为0.48,0.24μmol/L,EV71上下游引物和探针浓度分别为0．40,0.20 μmol/L。敏感度达到500 copies/μl,重复性变异系数CV≤5％;该荧光定量PCR检测试剂盒稳定性强,在-20℃下可以保存一年,对EV71,CA16肠道病毒具有良好的特异度。用该方法检测20份临床阳性样品和6份阴性样品,阳性检出率为100％(20/20),阴性检出率为100％(6/6)。结论试验建立的EV71,CA16肠道病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于EV71,CA16肠道病毒的临床诊断。     

荧光定量分型PCR法在HBV-DNA检测中的应用

目的：探讨荧光定量分型PCR法在乙型肝炎病毒（HBV）-DNA检测中的作用,为HBV基因的分型提供参考。方法对120份 HBV-DNA阳性样本分别采用荧光定量分型PCR法和直接测序法检测,比较两种方法的检测效果。结果120份样本均被荧光定量分型PCR 法和直接测序法成功分型,荧光定量分型PCR 检出29（24．17％）例混合感染样本,直接测序法检出7（5．83％）例,前者检出率高于后者（χ^2＝15．817,P＝0．000）;两种方法的一致性较好（Kappa 值为81．67％）;检测结果不一致的样本经TA 克隆后,证实与荧光定量分型PCR 法的检测结果一致。结论荧光定量分型PCR 法是一种简便、快速高效的HBV 基因分型法,对基因型混合感染样本的检出率高于直接测序法,且正确率高。     

新型二聚体突变荧光引物定量PCR方法的建立及其在检测HCV中的应用

目的 开发新型二聚体突变荧光引物技术,建立一种能广泛应用于临床检测HCv的实时PCR方法.方法 构建重组质粒pMD18-T-HCV 5′NCR作为标准品,设计二聚体突变荧光引物,优化定量PCR体系,并进行方法学评价.将本法应用于临床确诊的30份HCV阳性患者、30份其他病毒性肝炎患者和30份健康志愿者血清标本的检测,定量结果与商品化TaqMan HCv定量试剂盒的定量结果进行比较.结果 建立了利用二聚体突变荧光引物的实时PCR方法,检测的线性范围为20～109IU/ml;批内CV在1.37%～4.59%之间,批间CV在1.58%～4.81%之间;对所有其他病毒性肝炎患者和健康志愿者血清HCV的检测结果均阴性,检测特异性为100%(60/60);对临床确诊的HCV感染患者血清标本全部检出HCV阳性,定量结果与商品化TaqMan HCV定量试剂盒的定量结果具有很好的相关性,相关系数R2=0.9501.结论 建立的以二聚体突变荧光引物为平台的HCV实时PCR检测方法,具有快速、价廉、准确、结果可靠等特点,可为HCV感染的诊断、治疗监测和流行病学调查提供较好的技术支持.     

新型TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测HCV-RNA方法学的建立

目的建立一种快速、准确定量HCV-RNA的实时荧光定量PCR检测方法。方法 Clustal X软件对HCV核酸序列进行比对分析,在HCV-RNA的保守区域5'UTR设计引物和探针,棋盘滴定法对实时荧光定量PCR体系进行性能优化,制作假病毒颗粒作为定量标准品对新建方法进行性能评价,并与临床常用HCV-RNA定量检测试剂盒进行比对分析,探讨其应用价值。结果建立HCV核酸定量高灵敏度方法,该方法可以检测1a,1b,2a,3a,3b,6a,6b等多个HCV基因型,检测HCV-RNA的灵敏度为50 IU/ml,精密度CV5%,检测结果可溯源至卫生部临床检验中心丙型肝炎病毒核酸(HCV-RNA)血清标准物质GBW09151a。新建方法与凯杰HCV-RNA荧光定量检测试剂盒同时检测40例临床样本,阳性一致率为100%,阴性一致率为56%;自建方法检测阳性的14个样本中,凯杰试剂0个阳性,表明自建方法的检测灵敏度要高于凯杰试剂。结论建立的HCV核酸定量新方法灵敏度高、特异性好、精密度高,可应用于临床。     

双重荧光定量RT-PCR法检测柯萨奇病毒A2和A5型

目的建立同时检测柯萨奇病毒A2和A5型(CVA2、CVA5)的双重实时荧光定量RT-PCR法。方法用Primer Express3.0软件设计高度特异性引物和荧光标记探针。通过优化反应体系,建立标准曲线,并评价双重荧光定量RT-PCR法的特异性、灵敏度和重复性。用建立的方法检测367例疑似手足口病患儿的粪便标本,并对阳性结果测序验证。结果荧光定量RT-PCR结果表明本实验所选的引物和探针可特异性检测并区分出CVA2、CVA5亚型,与其他肠道病毒的阳性核酸未发生交叉反应。该方法最低检测限达到102copies/m L,批内变异系数(CV)均1.49%。367份临床标本中CVA2型阳性23份,阳性率6.3%;CVA5阳性11份,阳性率3%,检测阳性结果与测序结果一致。结论成功建立了在单管中同时检测并鉴别CVA2、CVA5型的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法具有较好的灵敏度、特异性、重复性,可用于CVA2、CVA5型引起的暴发疫情的快速筛查和手足口病的流行病学的研究。     

肺炎链球菌TaqMan实时荧光定量PCR的建立及临床应用

目的：建立TaqMan实时荧光定量PCR检测肺炎链球菌的方法,应用于临床儿童社区获得性肺炎（CAP）标本的快速筛查。方法根据 GenBank公布的肺炎链球菌自溶酶基因（lytA）设计引物和探针,建立实时荧光定量 PCR,并对体系进行优化;同时以痰培养法做双盲对照,应用于1504份 CAP患儿标本检测。结果 TaqMan实时荧光定量 PCR菌液的最低检出限可达18.75 cfu/PCR,无交叉反应,特异度好;对1504份儿童CAP标本检测,141份肺炎链球菌实时荧光定量PCR阳性,其中140份肺炎链球菌痰培养阳性,该方法灵敏度为100％,特异度为99.93％。从样品处理到结果报告仅需2.5 h。结论 TaqMan实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于儿童CAP中肺炎链球菌的初筛和指导抗生素的的合理使用。     

实时荧光逆转录PCR检测戊型肝炎病毒RNA的临床应用

目的 探讨实时荧光逆转录(RT)-PCR方法检测急性戊型肝炎患者血清戊型肝炎病毒(HEV)RNA的意义.方法 采用实时荧光RT-PCR方法,对HEV ORF3基因保守区进行扩增和检测.收集北京佑安医院住院和门诊434例急性戊型肝炎患者血清;甲型肝炎患者40例、乙型肝炎患者100例、健康献血员110名作为对照组;提取HEV RNA进行荧光RT-PCR检测.结果 434例急性戊型肝炎患者血清中232例(53.5%)为HEV RNA阳性.对照组血清HEV RNA检测均为阴性.与血清抗-HEV IgM检测比较,434例急性戊型肝炎患者HEV RNA检测的总符合率为67.1%,两种检测方法差异有统计学意义(Kappa=0.308,P=0.000).5例患者的首份血清检测为HEV RNA阳性,但抗-HEV IgM为阴性,系列追踪检测,相继出现抗-HEV IgM阳性.急性戊型肝炎患者的血清HEVRNA的检出多在发病的2～10 d内.结论 荧光RT-PCR方法有较高的特异性,应用实时荧光RT-PCR方法能对Ⅰ和Ⅳ戊型肝炎病毒感染的患者血清中的RNA进行定性检测.在临床使用可以提高对HEV早期诊断的水平.     

甲型H1N1流感病毒RNA检测方法的建立及临床应用

目的建立检测甲型H1N1流感病毒RNA的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并探讨其临床应用价值。方法根据甲型H1N1流感病毒HA基因和NA基因的核苷酸序列和GenBank数据库中的核苷酸序列设计检测特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系和反应条件,建立检测甲型H1N1流感病毒RNA的实时荧光定量RT-PCR方法,并对方法的敏感性、特异性和重复性进行评价。采用该方法检测21份鼻咽拭子样本的甲型H1N1流感病毒RNA,并与鸡胚培养法进行比较。结果采用实时荧光定量RT-PCR检测甲型H1N1流感病毒RNA结果为阳性,H1~H16流感病毒、季节性流感病毒、猪流感病毒RNA检测结果均为阴性。实时荧光定量RT-PCR的检测敏感性为10~3拷贝/μL RNA分子,标准曲线r~2=0.998。阳性RNA标准品重复检测的循环阈值(Ct)批内、批间变异系数(CV)均10%,阴性标准品[焦碳酸二乙酯(DEPC)水]重复检测的Ct值均0,重复性良好。21份鼻咽拭子样本中有2份样本甲型H1N1流感病毒检测结果为阳性,其他样本均为阴性,与鸡胚培养法的符合率为100%。结论建立的检测甲型H1N1流感病毒RNA的实时荧光定量RT-PCR方法操作简单、耗时短、特异性较强、敏感性较高,可在临床广泛使用。     

荧光定量逆转录聚合酶链反应检测婴幼儿粪便A组轮状病毒

目的建立一种快速、准确、定量检测A组轮状病毒方法。方法选择轮状病毒内壳蛋白基因作为A组轮状病毒的靶序列,设计合成引物和探针;与世界卫生组织(WHO)推荐的轮状病毒胶体金法平行检测,评价荧光定量逆转录聚合酶链反应(PCR)的敏感性与重复性。收集腹泻患儿粪便样本246份,并对其进行检测分析。结果采用荧光定量逆转录PCR检测A组轮状病毒的敏感性为1.0×101拷贝/μL;246份粪便样本中检出A组轮状病毒68例(27.64%);胶体金法检出A组轮状病毒抗原阳性48例(19.51%)。结论应用荧光定量逆转录PCR能够快速、准确检测A组轮状病毒,适合于大样本检测。     

荧光定量逆转录聚合酶链反应检测婴幼儿粪便A组轮状病毒

目的建立一种快速、准确、定量检测A组轮状病毒方法。方法选择轮状病毒内壳蛋白基因作为A组轮状病毒的靶序列,设计合成引物和探针;与世界卫生组织（WHO）推荐的轮状病毒胶体金法平行检测,评价荧光定量逆转录聚合酶链反应（PCR）的敏感性与重复性。收集腹泻患儿粪便样本246份,并对其进行检测分析。结果采用荧光定量逆转录PCR检测A组轮状病毒的敏感性为1.0×10^1拷贝/μL;246份粪便样本中检出A组轮状病毒68例（27.64%）;胶体金法检出A组轮状病毒抗原阳性48例（19.51%）。结论应用荧光定量逆转录PCR能够快速、准确检测A组轮状病毒,适合于大样本检测。