仿生电刺激在离体心肌诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化中的作用

目的 探讨仿生电刺激在离体心肌微环境下诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化中的作用.方法 采用改良方法分离培养大鼠MSCs及心肌细胞,并将两者按固定比例共同培养(称为MSCs/心肌细胞共培养体系),按是否给予仿生电刺激分为非电刺激组和电刺激组,刺激组每日给予频率0.5Hz、脉宽5ms、电压10V(电流强度20μA)的仿生电刺激2h,非电刺激组常规培养.每组又以实验干预培养时间(3、5、7d)分为3个亚组.分别于实验的第3、5、7天观察各组细胞生长情况,细胞免疫荧光方法检测各组MSCs细胞cTnT的表达情况,以及各组的cTnT阳性细胞率.结果 MSCs与心肌细胞共培养之后,电刺激组细胞较非电刺激组生长更为良好,且心肌波动频率高.实验第5天非电刺激组MsCs细胞尚无cTnT表达,而电刺激组有少数MSCs细胞出现cTnT表达.实验第7天非电刺激组和电刺激组MSCs均有cTnT表达,电刺激组MSCs细胞cTnT的阳性细胞率(20.98%±5.55%)明显高于非电刺激组(13.20%±3.98%.P<0.05).结论 仿生电刺激可促进离体心肌微环境诱导大鼠MSCs向心肌样细胞分化,使其更早出现心肌样细胞改变,并提高分化效率.     

心肌梗死大鼠单个核细胞分泌TNF-α对间充质干细胞迁移的影响

目的 探讨心肌梗死(MI)大鼠循环血单个核细胞分泌的TNF-α对间充质干细胞(MSCs)迁移的影响.方法 14只SD大鼠中8只结扎左冠状动脉前降支建立MI模型,其余6只行假手术处理(只穿线不结扎),于第7天时分离大鼠循环血单个核细胞.自制体外三室共培养模型,将4,6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)-MSCs、心肌细胞和单个核细胞分别培养于三室模型的上、中、下室内.按下室所加成分的不同,设立MI组(只加入2×106个MI大鼠单个核细胞)、TNF-α中和抗体组(TNF-α-NA组,加入2×106个MI大鼠单个核细胞及终浓度为50ng/L的TNF-α中和抗体)、假手术组(只加入2×106个假手术大鼠单个核细胞)和空白对照组(只加入培养液).共培养48h后,对MSCs迁移细胞进行CD44及CD34免疫组化鉴定和荧光显微镜下计数,ELISA法检测上清液TNF-α含量,Western blotting检测MSCs表面血管细胞黏附分子1(VCAM-1)表达情况,并分析TNF-α含量与MSCs迁移数目的 相关性.结果 迁移细胞CD44呈阳性表达,而CD34呈阴性表达,符合MSCs的特点.与假手术组比较,MI组迁移细胞数量显著增多(P<0.05),TNF-α含量明显升高(P<0.05),而中和TNF-α后,TNF-α-NA组迁移细胞数明显减少(P<0.05).MSCs迁移数目与TNF-α含量呈明显正相关(r=0.969,P<0.05).与假手术组比较,MI组MSCs表面VCAM-1的表达量显著升高(P<0.05),而中和TNF-α后,TNF-α-NA组VCAM-1的表达量明显下降(P<0.05).结论 MI大鼠单个核细胞可促进MSCs迁移,其机制可能与单个核细胞分泌的TNF-α增强MSCs黏附性有关.     

双酚A通过氧化应激干扰小鼠卵母细胞体外成熟

目的 观察双酚A(BPA)对小鼠卵母细胞体外成熟的影响，探讨相关的氧化应激损伤机制。方法 将雌性性成熟ICR小鼠的卵母细胞随机分为对照组、二甲基亚砜(DMSO)组和BPA组，对照组体外正常培养，DMSO组培养液中加入0.1%DMSO,BPA组培养液中加入溶于0.1%DMSO的45?μmol/L BPA。获取处于第二次减数分裂中期(MII)和停滞在生发泡期(GV)的小鼠卵母细胞。采用试剂盒检测MII期和GV期小鼠卵母细胞中活性氧(ROS)的水平；采用免疫荧光法和Western blotting法检测MII期和GV期小鼠卵母细胞中抗氧化酶的表达水平。结果 与对照组比较，体外成熟过程中接触45?μmol/L BPA的BPA组小鼠卵母细胞成熟率明显降低(26.32%±1.12%vs. 98.22%±0.89%,P<0.05),GV期和MII期卵母细胞中ROS水平明显升高(P<0.05)，过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶2(SOD2)水平明显降低(P<0.05)。结论 小鼠卵母细胞体外接触45?μmol/L BPA可增高ROS水平，抑制抗氧化酶CAT和SOD2的表达，引起氧...     

骨髓间充质干细胞对磷酰胺氮芥诱导卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)对磷酰胺氮芥诱导卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用及可能机制.方法 分离培养雌性Wistar大鼠卵巢颗粒细胞,加入磷酰胺氮芥(30/μmol/L)至培养的颗粒细胞中,再与MSCs以不同比例共培养72h.实验分为4组:①颗粒细胞单独培养组(对照组);②共培养组1,MSCs:颗粒细胞=1:1;③共培养组2,MSCs:颗粒细胞=1:5;④共培养组3,MScs:颗粒细胞=1:10.采用Annexin V检测凋亡率;采用蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的变化,ELISA法检测MSCs培养基中血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的浓度.结果 对照组化疗药物引起的卵巢颗粒细胞凋亡率为35.04%±5.75%,而共培养组1、2、3的凋亡率分别为12.80%±2.42%.13.94%±3.86%,22.31%±5.67%,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05).蛋白质免疫印迹显示与MSCs共培养后,颗粒细胞Bcl-2表达水平明显增高(P<0.05),Bax表达水平无明显变化(P>0.05).MSC$能分泌VEGF、HGF和IGF-1.结论 MSCs对体外化疗药物诱导的卵巢颗粒细胞的凋亡有保护作用,其作用机制可能是其分泌的细胞因子通过旁分泌途径发挥作用,以及Bel-2在颗粒细胞中表达上调有关.     

肝细胞生长因子与表皮细胞生长因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞

目的探讨肝细胞生长因子（HGF）与表皮细胞生长因子（EGF）联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为类肝细胞的可行性。方法取大鼠股骨骨髓，用直接贴壁法分离纯化Mats并体外传代，实验组用HGF（20mg／m1）＋EGF（10mg／m1）对体外培养的Mscs进行诱导分化。细胞免疫化学法及流式细胞仪对培养的MSCS进行鉴定。RT-PCR检测诱导后慨的AFP、AIb、CK-18的mRNA表达。电镜观察诱导细胞的超微结构。结果贴壁的MSCs单个存在或形成克隆，细胞形态比较均一，为长梭形，7～10天达汇合。免疫细胞化学及流式细胞仪均证明培养的细胞为MSCs。实验组MSCS在培养21天时表现为类肝细胞的形态特点。RT-PCR：AFP mRNA在第7天呈阳性表达，AIb mRNA及CK-18 mRNA开始即有表达，21天增强。电镜观察见诱导21天的Mats形态结构与肝细胞相吻合。结论Mats在体外容易分离培养和扩增，HGF＋EGF可诱导MSCs向类肝细胞分化，为细胞移植治疗肝衰竭提供新的探索思路。     

5-氮胞苷不同时点对骨髓间质干细胞的诱导分化作用

 目的 对比研究5-氮胞苷(5-aza)在不同时点对大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)的诱导分化作用.方法 体外分离培养雌性Wistar大鼠MSCs,分为6组,每组n=12,每次诱导均加入10μmol/L 5-aza作用24h.分组及各组诱导开始时间点为:A组,原代培养第72 h;B组,传5代后72 h;C组,传10代后72h;D组,传15代后72 h;E组,原代培养第72小时诱导1次,传5代后72h再重复诱导1次,共诱导2次;F组,空白对照组.诱导后,观察细胞形态学变化,免疫细胞化学鉴定心肌特异性结构蛋白,统计分析比较各组阳性表达率.结果 MSCs经诱导后,表达肌球蛋白重链和心肌特异性肌钙蛋白-T.A、B、E组间阳性表达率无明显差异(P＞0.05),与C、D组比较阳性率较高(P＜0.05),C、D组间无差异.结论 MSCs在体外诱导后可表达心肌特异性结构蛋白,随着传代次数增加,定向分化能力明显降低.作为移植种子细胞,以3～5代MSCs较好.     

瘀胆血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导其分化为肝细胞的可行性。方法分离、纯化并鉴定大鼠骨髓MSCs,制备正常及瘀胆大鼠血清,取第3代MSCs分组培养：A组：DMEM＋10％FBS;B组：肝细胞生长培养基（HGM）＋5％FBS0、组：HGM＋5％正常大鼠血清;D组：HGM＋5％瘀胆大鼠血清;E纽：HGM＋5％瘀胆大鼠血清＋25ug／LHGF。观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,采用RT～PCR检测甲胎蛋白（AFP）和细胞角蛋白18（CK18）的表达,溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白（ALB）的含量。结果培养过程中,D、E组出现多角形及双核细胞,A、B、C组细胞形态无明显变化。生长曲线显示细胞生长速度C组最快,D、E组均较B组快（P〈0．05）。D、E组于诱导第7,14天出现AFPmRNA阳性表达,第14,21天出现CK18mRNA阳性表达,D、E组上清波中白蛋白浓度随诱导时间延长逐渐升高,且E组高于D组（P〈0．05）。A、B、C组未见AFP、CK18表达及白蛋白浓度变化。结论正常大鼠血清能明显促进MSCs的增殖;瘀胆血清对MSCs有一定促增殖作用,且能有效诱导其向肝细胞分化,联合使用HGF能提高分化率。     

体外诱导人脐带华通胶间充质干细胞向内皮细胞分化过程中APJ表达变化

目的研究人脐带华通胶间充质干细胞（human umbilical cord Wharton′s Jelly mesenchymal stem cells,HUW MSCs）体外诱导向内皮细胞分化过程中表面APJ受体表达的变化,探讨APJ是否可作为鉴定内皮细胞的早期细胞表面标志物。方法剖宫产取脐带后分别用酶消化和组织贴壁法培养获得脐带华通胶间充质干细胞,用酶消化法获得人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）。取2×107第2代HUW MSCs用单克隆APJ APC荧光抗体标志后行流式分选,测定HUW MSCs实验前细胞表面表达APJ的水平。实验分3组：诱导组MSCs用含血管内皮细胞生长因子5 μg/L、碱性成纤维细胞生长因子10 μg/L、表皮生长因子10 μg/L和10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）M199培养基培养;共同培养组MSCs先与HUVECs在Transwell 6孔培养板中,用含10%FBS的M199培养5~7 d后转入25 cm2培养瓶中继续培养,培养液为含10%FBS的M199和培养1 d内皮细胞的M199（2∶1）混合培养基;单纯培养组细胞培养基为含10% FBS的M199。培养周期为14 d。分别于第7、10、14天流式检测各组细胞APJ表达水平,同时检测内皮细胞表面APJ水平作为阳性对照。另外于第7、14天检测3个实验组、内皮细胞组、HUW MSCs组内皮细胞早期标志物CD309表达变化情况,比较各实验组之间APJ与CD309变化趋势。结果HUW MSCs流式分选出5×103APJ+ HUW MSCs,表面表达APJ基本呈阴性。诱导组、共同培养组和单纯培养组细胞形态均较HUW MSCs有显著改变,诱导组呈圆形、线性、网状,共同培养、单纯培养组细胞呈卵圆形、长梭形。另外,诱导组生长最快,增殖能力最强;单纯培养组次之;共同培养组细胞生长缓慢,增殖能力最弱。第7、10、14天,3组细胞CD309表达分别为诱导组18%、26%和88%,共培养组05%、25%和47%,单纯培养组03%、21%和27%。第7、10、14天各组APJ阳性表达率分别为诱导组05% 、09%和52%,共培养组04%、08%和30%,单纯培养组02%、06%和21%。结论HUW MSCs表面APJ表达基本呈阴性,HUW MSCs向内皮细胞诱导分化过程中APJ表达逐渐上调,与内皮细胞早期标志物CD309变化趋势基本一致,可作为早期内皮细胞鉴定的标志物。     

NGF对牛腔前卵泡体外培养的影响

用改良的McCoy's5a培养液(含3mML-谷氨酰胺、0.1%BSA、29ng/mL睾酮、2.5μg/mL转铁蛋白、100ng/mL胰岛素和4ng/mL硒),在96孔培养板中,每孔250μl培养液的条件下,研究了神经生长因子(NGF)对牛腔前卵泡体外发育的影响。结果表明:在培养液中添加三种不同浓度NGF(4、6、8IU/ml)对体外培养的Φ<60μm腔前卵泡有促进生长的作用。在体外培养10d时,三种不同浓度NGF组的Φ<60μm腔前卵泡及其卵母细胞直径平均增长值分别为27.84±4.51μm和6.11±1.81μm,显著高于对照组(分别为8.09±2.66μm和0.26±0.06μm)(p<0.01)。但对60μm>Φ>130μm和Φ>130μm的腔前卵泡作用不显著(p>0.05)。同时,不同浓度的NFG显著提高了Φ<60μm腔前卵泡的发育率,对照组为11.76%(2/17),而三个实验组平均为17.65%(7/40)(p<0.05)。     

与人汗腺细胞共培养的人骨髓间充质干细胞表型转化及相关机制

目的 研究人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)与经热休克处理的人汗腺细胞(sweat gland cells,SGCs)体外间接共培养状态下的细胞表型转化及相关机制.方法 体外分别分离扩增人MSCs及SGCs,原代SGCs生长融合后于47℃热休克,收集即刻和24 h后的上清加入第3代MSCs,7 d后分别以二步免疫细胞化学法和流式细胞术检测MSCs表达细胞角蛋白7(CK7)、CK18和癌胚抗原(CEA)的情况并与对照组比较.结果 加入SGCs上清后MSCs生长减慢,7 d内无明显形态改变;二步免疫细胞化学法显示部分细胞CK7和CEA染色刚性;流式细胞术显示,诱导组细胞CK7和CEA阳性率分别为5.76%和2.01%,对照组为1.12%和0.51%,两者差异有统计学意义(P＜0.01).结论 SGCs热损伤释放后某些信号物质,可诱导MSCs横向分化.