稳定表达α-Synuclein 4种选择性剪接异构体的PC12细胞对神经毒性剂MPP~+的敏感性研究

目的研究稳定表达α-synuclein 4种选择性剪接体的PC12细胞对神经毒性剂MPP+的敏感性。方法 PCR获得α-synuclein的4个选择性剪切体,克隆入pcDNA3.1载体,转染PC12细胞,经G418筛选获得稳定表达这4个剪切体的PC12细胞株,采用细胞毒的方法检测这4个稳定细胞株对神经毒性剂MPP+的敏感性。结果同全长相比,去除外显子5的选择性剪切体α-synuclein114和α-synuclein98对神经毒性剂MPP+的敏感性升高,表现为细胞活力的降低。结论去除外显子5的选择性剪切体α-synuclein114和α-synu-clein98对神经毒性剂MPP+的敏感性明显升高。抑制外显子5的选择性剪切,从而抑制选择性剪切异构体α-synucle-in114和α-synuclein98的产生可能是阻止神经元退行性丢失的一种策略。     

纤维状α-突触核蛋白聚集体激活NLRP3炎症小体的机制研究

目的 探索纤维状α-突触核蛋白（α-synuclein）聚集体激活NLRP3炎症小体诱导神经炎症的机制。方法 构建纤维状α-synuclein聚集体,采用纤维状α-synuclein聚集体刺激BV-2小胶质细胞,检测白介素（IL）-1β、IL-18、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等相关炎症因子和NLRP3、caspase-1、ASC等蛋白的表达和mRNA水平评价NLRP3炎症小体激活;采用乳酸脱氢酶释放（LDH）实验检测细胞焦亡的发生。机制研究部分,检测Toll样受体（TLR）2和TLR4的激活,并分别加入TLR2和TLR4抑制剂C29和TAK-242检测对纤维状α-synuclein聚集体诱导的NLRP3炎症小体激活的影响及核转录因子-κB(NF-κB)的入核情况。结果 Westernblot和硫黄素T染色实验结果显示,纤维状α-synuclein聚集体成功制备。纤维状α-synuclein聚集体刺激BV-2小胶质细胞24 h后可激活NLRP3炎症小体,表现为IL-1β释放增加,相关蛋白NLRP3、caspase-1表达升高,N LR P3、ASC和I L-1β的m R NA...     

α-synuclein促进凋亡的机制研究

目的：α-synuclein是一种功能未知的突触前膜蛋白，是多种神经退行性疾病胞浆中的纤维聚积体中的主要成份。虽然经过大量的研究，α-synuclein在这些疾病中发挥的作用仍未充分阐明，但是许多研究均报道过α-synuclein的过量表达对细胞具有一定的毒性，因此本研究的主要目的是研究α-synuclein对NF-xB信号途径所介导的细胞凋亡的调节作用。NF-xB是在细胞中广泛表达的转录因子，能够调节多种抗凋亡基因如BCl-2的表达，而GSK3β是与神经细胞凋亡紧密相关的多功能激酶，通过磷酸化包括NF-xB等各种转录因子的多种靶蛋白而调节细胞的凋亡。方法与结果：本研究通过分子克隆技术构建人源α-synuclein的载体并建立稳定过表达株，我们的研究发现：过表达α-synuclein的细胞稳定株细胞存活率与对照组相比显著性降低，而通过报告基因检测发现过表达的α-synuclein能够显著抑制NF-xB介导的基因的表达，并且这种抑制作用呈现剂量依赖性，随着α-synuclein转染量的增加而呈现更加明显的抑制作用；而通过Western Blot检测发现，过表达的α-synuclein能够促进GSK3β的表达，而抑制抗凋亡基因BCl-2的表达。结论：α-synuclein对细胞的毒性可能通过促进GSK3β的表达抑制NF-xB途径，由此通过抑制由NF-xB介导的抗凋亡基因BCl-2表达而发挥作用。     

α-synuclein过表达下调Nurr1转录活性的机制研究

目的研究α-synuclein过表达对多巴胺能神经元核受体相关因子-1(Nurr1)转录活性的影响及作用机制。方法 PC12细胞转染α-synuclein质粒后,采用双荧光素酶检测方法和Western blot方法分别检测Nurr1转录活性及蛋白水平变化情况。同时检测调控Nurr1转录活性的GSK3β/β-catenin通路中相关信号蛋白水平变化。结果与对照组相比,α-synuclein过表达可明显降低Nurr1转录活性,但对Nurr1蛋白水平无明显影响。通过检测GSK3β/β-catenin中相关信号蛋白发现,α-synuclein过表达可明显降低GSK3β(Ser9)磷酸化水平和β-catenin蛋白水平。结论α-synucle-in可能通过调控GSK3β/β-catenin通路下调Nurr1转录活性。     

铁皮石斛多糖对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响

目的研究铁皮石斛多糖(polysaccharides from Den-drobium officinale,DOP)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响并探讨其作用机制。方法 MTT法检测细胞活性;ELISA法检测TNF-α的分泌水平;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TNF-αmRNA表达量;Western blot技术检测胞质I-κBα蛋白的表达量。结果 DOP在20～160mg·L-1范围内明显促进RAW264.7细胞增殖,无细胞毒性;与空白对照组比较,DOP剂量依赖性地促进TNF-α的分泌;上调TNF-αmRNA表达;Western blot结果显示DOP能明显降低胞质内I-κBα蛋白水平。结论 DOP能增强RAW264.7细胞分泌TNF-α,其作用机制可能与降低胞质内I-κBα蛋白水平,活化核转录因子NF-κB,诱导TNF-αmRNA的表达有关。     

CKLF1高表达激活NF-κB信号通路导致小鼠肺部炎症

目的 有报道表明趋化素样因子1(CKLF1)在哮喘病人肺部高表达,但具体情况和机制尚不明确.本研究拟在动物水平考察CKLF1的致炎作用及相关机制.方法 将pCDB-CKLF1质粒或空载体pCDB电转入Balb/C小鼠体内,HE染色观察其肺部病理改变;硝酸酶还原法和ELISA法分别检测小鼠血清中NO和TNF-α的含量;提取小鼠肺部组织的胞质和胞核蛋白,蛋白免疫印迹实验考察胞质和胞核内NF-κB和IκBα表达的改变.结果 病理切片结果显示,转染pCDB-CKLF1质粒后,小鼠肺部出现明显的病理改变;小鼠血清中NO和TNF-α含量明显升高;胞质内NF-κB和IκBα表达明显减少,胞核内NF-κB和IκBα表达明显增加.结论 趋化因子CKLF1高表达能够导致动物肺部炎症的发生,CKLF1可能通过激活NF-κB 信号通路导致炎症.     

内源性Phb2在HeLa细胞中表达和定位

目的 检测Phb2蛋白在HeLa细胞内的表达与分布情况.方法 将HeLa细胞裂解,提取总蛋白,进行Western-Blot检测;借助免疫细胞荧光,在荧光显微镜下观察其在HeLa细胞定位.结果 Western-Blot显示Phb2蛋白在HeLa细胞内有效表达,免疫细胞荧光显示phb2蛋白主要在胞质内分布,细胞核中未见...     

灵芝孢子多糖LPS3对Lactacystin诱导PC12细胞损伤的影响

目的探讨灵芝孢子多糖LPS3对蛋白酶体抑制剂Lactacystin诱导PC12细胞损伤的影响。方法体外培养PC12细胞,建立Lactacystin诱导PC12细胞损伤的模型,用CCK-8法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI流式细胞法检测细胞调亡,免疫荧光法检测胞浆中α-synuclein聚集物的生成。结果模型组经20μmol·L-1Lactacystin处理24 h后,PC12细胞活力比空白对照组降低,仅为64.7%;经不同浓度的灵芝孢子多糖LPS3预处理后,细胞活性明显提高,且其细胞活性随多糖浓度升高而升高;Lactacystin可以诱导PC12细胞凋亡,处理24 h后细胞凋亡率为45.40%,经灵芝孢子多糖LPS3预处理后,细胞凋亡率明显降低;PC12细胞经Lactacystin处理后,胞浆内可见明显的颗粒状、小团块状α-synuclein聚集体的生成;而经灵芝孢子多糖LPS3预处理后,胞浆中α-synuclein的聚集体明显减少。结论灵芝孢子多糖LPS3对Lactacystin诱导的PC12细胞损伤有一定的保护作用,其作用机制可能与抑制α-synuclein聚集体的生成有关。     

A53T突变型人α-synuclein转基因细胞模型构建及鉴定

目的：构建A53T突变型人α-synuclein转基因细胞模型，为深入开展帕金森氏病机理研究及有效化合物筛选提供平台。方法RT—PCR扩增人α-synuclein基因，与T载体相连后，运用SOE法进行定点突变。经双酶切，将突变型α-synuclein基因插入pcDNA3．1＋载体中。运用脂质体法进行稳定转染，并通过有限稀释进行单克隆筛选，得到初筛细胞株。转染90天后，运用Western blot法进行目的蛋白检测，选择高表达株细胞作为实验株。     

以重组CD74胞外片段抑制巨噬细胞移动抑制因子（MIF）功能域活性

目的：巨噬细胞移动抑制因子（MIF）第50-65位氨基酸残基（MIF50-65）是其生物活性功能域。MIF需与Ⅱ型穿膜蛋白CD74的胞外片段结合后引发信号传导反应。本文拟筛选能特异结合MIF50-65的CD74胞外截短体片段，并研究重组该CD74截短体对MIF50-65活性的抑制作用。方法：利用酵母双杂交实验筛选MIF50-65与CD7473-149、CD74109-149、CD74109-232、CD7473-232中特异结合的CD74截短体。利用原核表达系统，在大肠杆菌中诱导表达重组CD74截短体多肽。用GSTrap亲合柱纯化重组蛋白，通过体外血管生成实验鉴定重组CD74截短体对MIF的阻断作用。结果：只有MIF50-65与CD7473-232共转化的酵母可以在SD／-Leu-His-Trp-Ade培养基上生长，且α-x-gal底物反应为蓝色。构建了重组质粒pGEX-4T-CD7473-232，经IPTG诱导后特异表达出可溶性的重组蛋白。重组CD7473-232能特异地阻断MIF的促血管生成作用。结论：CD7473-232能与MIF50-65特异结合，并对MIF生物活性有抑制作用。     

强直性脊柱炎外周血Th17细胞的检测及意义

目的 探讨Th17细胞在强直性脊柱炎(AS)患者外周血中的水平及意义.方法 取40例AS患者(分AS病情稳定组、活动组各20例)和健康人外周血单个核细胞(PBMC),免疫磁珠阴选CD4~+ T细胞,用或不用非特异性刺激剂(A-CD3、A-CD28),然后加PMA/Ion,经固定/透膜处理进行细胞内染色,流式细胞术(FCM)检测CD4~+T细胞内白细胞介素17(IL-17~+)/γ于扰素(IFN-γ~+)、IL-17~+/IL-6~+水平.结果 免疫磁珠阴选CD4~+T细胞纯度达90% 以上.AS病情活动组IL-17表达水平较病情稳定组和健康对照组显著增高(P<0.01).用A-CD3、A-CD28和IL-23刺激后,CD4~+ T细胞IL-17胞内表达水平较无刺激有一定的增加.AS患者CD4~+T细胞IFN-γ胞内表达水平呈现卜IL-17表达相似的特点.AS患者IL-17胞内表达水平与IFN-γ和IL-6无显著相关.结论 AS患者外周血CD4~+ T细胞胞内IL-17和IFN-γ高表达,提示分泌IL-17的Th17细胞和分泌IFN-γ的Th1细胞共同参与了AS发病过程.     

SARI基因真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立

目的构建人SARI基因真核表达载体,并建立稳定转染的HeLa细胞系。方法采用RT-PCR技术从正常人外周血单个核细胞cDNA文库中扩增SARI基因序列,连接插入至pCMV-N-Flag真核表达载体,并对重组质粒进行酶切及测序鉴定;阳离子聚合物介导重组质粒转染HeLa细胞后,用G418抗生素筛选稳定转染的细胞系。间接免疫荧光检测Flag-SARI融合蛋白在HeLa细胞系中的表达定位。RT-PCR及Western blot检测SARI mRNA及蛋白的表达变化。结果双酶切和DNA测序表明pCMV-Flag-SARI真核表达质粒构建成功。经G418筛选后,RT-PCR和Western blot表明,转染重组质粒的HeLa细胞系中SARI mRNA及蛋白的表达明显升高。间接免疫荧光结果显示,Flag-SARI融合蛋白在HeLa细胞系的胞质和胞核中均有表达,且胞质荧光信号强于胞核。结论成功构建pCMV-Flag-SARI真核表达载体,表达的FlagSARI蛋白主要定位于HeLa细胞系的胞质中。     

lncRNA HNF4α-AS1参与调控转录因子和细胞色素CYP450表达

目的细胞色素P450酶系(CYP450s)是体内主要的氧化代谢酶系。临床上70%以上的处方药物经由CYP450s催化代谢。研究表明,转录因子参与CYP450s的表达调控,其中转录因子HNF4α在CYP450s的转录调控中发挥重要的作用。近期发现转录因子附近的一些非编码RNA(lnc RNA)参与其邻近基因的调节。lnc-HNF4α(HNF4α-AS1)与HNF4α相邻,是HNF4α基因的互补反义RNA。本文目的是探讨在肝癌细胞Huh7中lnc RNAHNF4α-AS1对转录因子与CYP450s表达的调控作用。方法在肝癌细胞huh7上进行功能缺失实验敲除HNF4α以及功能缺失实验敲除HNF4α-AS1与功能获得实验过表达HNF4α-AS1,q-PCR法检测lnc RNA和代谢酶以及转录因子mRNA的表达。结果在肝癌细胞Huh7中,si RNA有效干扰HNF4α后,HNF4α-AS1表达降低,CYP(1A2,2E1,2B6,2C8,2C9,2C19,3A4)的mRNA的表达以及转录因子(PXR,CAR,AhR)mRNA表达降低。在Huh7细胞中,si RNA有效干扰HNF4α-AS1后,CYP(1A2,2C8,2C9,2C19,3A4)的表达以及核受体PXR的mRNA表达升高,有效过表达HNF4α-AS1后,CYP450s以及核受体PXR的mRNA表达下降。结论 lnc RNAHNF4α-AS1参与调控转录因子与细胞色素CYP450s的表达。     

甲基苯丙胺对SH-SY5Y细胞的毒性作用及对α-核突触蛋白表达的影响

目的:探讨甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)对SH-SY5Y细胞的毒性作用和对α-核突触蛋白(α-synuclein,α-SN)表达的影响,为研究α-SN在METH神经毒性机制中的作用奠定基础。方法:分别用浓度0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 mmol.L-1的METH处理SH-SY5Y细胞24 h,倒置显微镜下观察细胞形态变化;透射电镜观察细胞超微结构;CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞术分析细胞凋亡率;实时荧光定量PCR和Western Blot分别检测α-SN基因和蛋白水平的表达变化。结果:以0 mmol.L-1为对照组,0.5-4.5 mmol.L-1METH处理的SH-SY5Y细胞镜下可见胞体皱缩变圆,突起变短、断裂、消失。电镜显示,METH处理的细胞内可见包涵体和自噬小体。0.5 mmol.L-1处理组与对照组比较,细胞存活率无显著性差异(P=0.274),其他浓度处理组与对照组相比均有显著性差异(P<0.001)。细胞凋亡率随METH浓度增加而递增,与对照组相比均有显著性差异(P<0.001)。与对照组比较,0.5 mmol.L-1处理组α-SN-mRNA的表达量没有显著差异(P=0.936),其他浓度处理组α-SN-mRNA均显著性上升(P<0.001),且α-SN-mRNA表达量随METH浓度增加而逐步上升。α-SN蛋白的表达也随METH浓度增加而递增。结论:METH对SH-SY5Y细胞有毒性作用并可刺激细胞中α-SN基因和蛋白水平的高表达。细胞毒性作用和α-SN的表达均随METH浓度的增加而递增。     

α-突触核蛋白与Cu~(2+)相互作用的研究进展

帕金森病是一种慢性中枢神经系统退行性疾病,其主要的病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元丢失,残存神经元胞质中出现路易小体,其主要成分是异常聚集的α-synuclein蛋白(α-突触核蛋白)。α-synuclein的聚集与多种因素有关,其中金属离子与α-synuclein结合可导致蛋白构象发生变化引起蛋白发生聚集。近年的研究发现,Cu2+能够特异地结合α-synuclein蛋白,并诱导α-synuclein的聚集。该文就Cu2+与α-synuclein相互作用的的结合位点、结合模式以及Cu2+在α-synuclein毒性形式中可能发挥的作用作一综述。     

人乳腺癌细胞及其耐药细胞转录因子表达的差异

目的研究阿霉素在不同药敏性肿瘤细胞中转录因子水平的差异,为肿瘤细胞多药耐药机制的研究提供参考。方法通过细胞活力检测野生型乳腺癌细胞(MCF7/W)和对阿霉素耐药的乳腺癌细胞(MCF7/ADM)的药敏性差异;荧光显微镜镜检阿霉素荧光分布;有机溶剂萃取法进行全细胞阿霉素吸收分析;细胞膜和核膜分离检测阿霉素的亚细胞定位;通过转录因子膜分析MCF7/W和MCF7/ADM细胞中转录因子表达差异。结果两株细胞的耐药IC50相差近10 000倍左右;利用镜检和定量分析,发现阿霉素在MCF7/W细胞中主要定位于胞核,而在MCF7/ADM细胞中则蓄积较少且主要定位于胞质;转录因子差异分析发现膜上总345个转录因子中,与野生型细胞相比,耐药细胞的106个转录因子表达上调,32个表达下调。结论阿霉素在耐药细胞与野生型细胞中转录因子表达的差异,可能是干扰阿霉素入核,阻止其功能发挥的基础。     

FABP3基因荧光载体构建及其蛋白的亚细胞定位

目的构建脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因的荧光表达载体FABP3-pEGFP-N2,并应用绿荧光融合蛋白技术检测FABP3蛋白的亚细胞定位。方法 RT-PCR法获得FABP3基因编码框,克隆到pEGFP-N2载体中,利用脂质体将构建的表达载体转染P19细胞后,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察细胞内FABP3蛋白定位。结果成功克隆FABP3基因片段,并将其重组到pEGFP-N2载体中。荧光显微镜和激光共聚焦显微镜显示,FABP3蛋白主要分布于P19细胞的胞浆和胞核中。结论成功构建了FABP3-pEGFP-N2真核表达载体,FABP3在P19细胞的胞浆和胞核中呈弥漫分布特点。     

蛋白激酶C激动剂在阿尔茨海默病治疗中的作用

目的：探讨蛋白激酶C（PKC）激动剂TPPB对淀粉样前体蛋白代谢的影响。方法：用TP—PB作用于SH-SY5YAPP695和PC12细胞，荧光强度检测其对α和β分泌酶活性的作用；免疫印迹法检测细胞培养上清液内可溶性前体蛋白（sAPPα）分泌的影响和细胞本身APP表达的影响，     

rhIL-18对核辐射诱导小鼠脾细胞凋亡的抑制机制研究

为了探讨重组人白细胞介素18（rhIL-18）对核辐射所致小鼠脾细胞凋亡的抑制作用机制,对32只C57小鼠分4组进行核辐射损伤,2周后取小鼠脾淋巴细胞体外培养,用细胞凋亡ELISA试剂盒测定胞质中核小体含量,用DNA琼脂糖电泳检测凋亡细胞DNA片段;用原位杂交方法测定脾细胞凋亡相关基因bax与bcl-2的表达,观察rhIL-18对其表达的调节作用。结果表明,与对照组比较,rhIL-18能够明显降低核辐射所致的小鼠脾细胞凋亡;促进bcl-2的表达,下调bax基因的表达。结论：rhIL-18可能通过促进bcl-2的表达、下调bax基因的表达方式抑制核辐射诱导的小鼠脾细胞凋亡。     

α-突触核蛋白的异源表达及其与Pectinolide G的相互作用研究

目的 体外获得人源α-突触核蛋白并研究其与海洋小分子Pectinolide G的实际结合情况 方法 采用基因重组的方法构建α-突触核蛋白的原核重组表达载体并在BL21(DE3)中诱导蛋白表达,从诱导温度、时间和诱导剂浓度三方面对蛋白表达进行优化,并确立硫酸铵纯化目的蛋白的具体条件,通过表面等离子共振技术和分子对接技术,探究人源α-synuclein与Pectinolide G的结合情况。结果 通过基因重组将α-synuclein目的基因与PET30a原核表达载体构建成融合载体,确立该蛋白的最佳诱导表达条件为：0.5mM IPTG,37 ℃, 5 h,最佳纯化条件为: 95℃加热破碎后菌液,50%饱和硫酸铵溶液沉淀目的蛋白,质谱法确认其分子量为14.6KD,符合人源α-synuclein理论分子量。最后,利用纯化得到的α-synuclein通过表面等离子共振(SPR)和计算机分子模拟技术,确认了其可与Pectinolide G较好的结合。结论 通过原核重组表达获到人源α-synuclein,并确认了其与海洋小分子Pectinolide G的结合力和结合模式