基因芯片快速检测结核分枝杆菌katG基因突变及其与异烟肼耐药相关性

目的了解结核分枝杆菌katG基因S315突变与异烟肼（isoniazid,INH）耐药相关性,建立快速简便的katG基因S315突变基因芯片检测方法。方法采用二倍稀释法检测123株结核分枝杆菌临床分离菌株对INH的耐药性。PCR及测序确定上述结核分枝杆菌katG基因S315位点突变率及突变类型。根据PCR及测序结果,设计Cy3荧光标记探针并制备katG基因S315位点突变检测基因芯片。基因芯片检测结果与PCR及测序结果进行对比分析。结果 123株结核分枝杆菌临床菌株中,39.0%（48/123）菌株对INH敏感,61.0%（75/123）菌株对INH耐药。结核分枝杆菌H37Rv株及所有临床菌株均能扩增出katG基因片段。75株INH耐药菌株中,69.3%（52/75）菌株katG基因出现S315位突变,其中25株突变类型为S315N（AGC→AAC）、12株为S315T（AGC→ACC）、7株为S315I（AGC→ATC）、各有3株分别为S315T（AGC→CGC）和S315R（AGC→AGA）、2株为S315G（AGC→GGC）。所制备的基因芯片对123株结核分枝杆菌katG基因S315野生型或突变型检测结果与PCR及测序结果完全一致。结论结核分枝杆菌katG基因S315突变与INH耐药密切相关。本研究中制备的基因芯片可快速、简便、准确、敏感和特异地检测结核分枝杆菌katG基因S315突变及其类型。     

耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株耐药基因突变及其分子流行病学调查研究

目的阐明结核分枝杆菌耐异烟肼临床分离株katG基因突变特点以及Spoligotyping分型和结核病流行关系。方法对123株结核分枝杆菌临床分离株，其中有药敏结果的98株，（耐异烟肼菌株45株；异烟肼敏感株53株）的katG基因进行DNA片断扩增然后进行SSCP分析；同时对其中的121株菌株进行Spoligotyping分型。结果45株耐INH结核杆菌株中，27株（60％）第315位点突变，低耐药菌株（1mg／L）第315位点突变率显著高于高耐药菌株（10mg／L；53株敏感株中无KatG基因315位密码子突变。对121株临床株的Spoligotyping DNA指纹分析，1型，（北京型）103株占84％（103／121），其它基因型18株，分散在13种基因型中。结论本项研究进一步证实了结核分枝杆菌耐异烟肼与katG基因突变之间的关系；北京型感染是北京地区结核病流行的重要原因。     

31株结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因检测及序列分析

目的了解贵阳地区分离的结核分枝杆菌katG基因、inhA启动子和oxyR-aphc间隔区基因突变特征。方法对31株结核分枝杆菌临床分离株（异烟肼耐药株17株,异烟肼敏感株14株）的katG基因、inhA启动子和oxyRaphc间隔区进行DNA片段的PCR扩增,并进行测序分析。结果 17株异烟肼耐药菌株中有16株检出katG基因突变,其中70.5%（12/17）为315位密码子变异,且变异类型均为AGC→ACC,敏感株未发现315位点突变。11株敏感菌和4株耐药菌在463位密码子发生变异,变异类型均为CGG→TGG,变异率分别为78.6%（11/14）和23.5%（4/17）,差异无统计学意义。有12株耐药株的变异类型为katG基因双重位点突变,其中10株为katG315（AGC→ACC）和463（CGG→TGG）位变异,463（CGG→TGG）和299（GGC→AGC）变异及463（CGG→TGG）和419（GAC→CAC）位变异各1株。2株异烟肼耐药菌检出oxyR-aphC启动区G32A突变,其中1株为联合katG463和299位突变。结论贵阳株结核杆菌菌株异烟肼耐药基因突变具有多态性,主要的变异类型为katG315位点突变。     

耐多药结核分枝杆菌基因突变分析

目的对临床分离的耐多药结核分枝杆菌株进行基因突变分析。方法对耐多药结核分枝杆菌临床分离菌株进行耐药基因的PCR检测,利用基因序列测定方法分析耐药基因突变情况。结果从耐多药结核病（MDR-TB）患者临床分离菌株中快速检测到rpoB、katG、rpsL、embB基因及其突变。耐多药菌株、全耐及单耐利福平分离菌株均检测rpoB基因点突变,突变位点主要为第516、526和531常见密码子,1例MDR-TB出现第479位和第531位密码子同时突变。耐多药菌、全耐菌及单耐异烟肼的菌株均检测有katG基因点突变,突变位点均为第2066位碱基C突变为Go全耐菌和对乙胺丁醇（EMB）耐药的耐多药菌株均检测有embB基因点突变,突变位点均为第306位密码子ATG突变为ACG。全耐菌和对链霉素（SM）耐药的MDR-TB菌株均检测有rpsL基因点突变,突变密码子为CCT突变为CTT,其中从1株对SM敏感的MDR-TB中也检测到突变。全敏感株、标准株及利福平（RIF）、异烟肼（INH）或EMB敏感的耐药株均无rpoB、katG或embB基因突变。结论PCR及基因序列测定可快速检测耐多药结核基因,结核分枝杆菌耐多药性与多个基因突变相关。     

应用等位基因特异性多重聚合酶链反应同步检测结核分枝杆菌的耐药性

目的建立可同步检测结核分枝杆菌katG和ropoB基因突变的等位基因特异性多重聚合酶链反应（MAS-PCR）的方法，以快速检测结核分枝杆菌对利福平（RFP）和异烟肼（INH）的耐药性。方法根据结核分枝杆菌katG和rpoB基因序列，分别设计特异性寡聚核苷酸引物，采用MAS-PCR技术，分别检测katG基因315位点和rpoB基因中531、526和516三个最常见的突变位点。结果19株INH敏感株中均未发现katG基因315位点的突变，耐药株中发现有79．2％（61／77）的菌株存在突变；15株RFP敏感株中未发现rpoB基因突变。MAS-PCR方法可检测出81．5％（66／81）的利福平耐药株。结论MAS-PCR方法对katG和rpoB基因的同步检测有较高的敏感性和特异性，有望用于耐药结核分枝杆菌的快速检测。     

19952004年芬兰耐药结核分枝杆菌分离株分子基因学分析

背景：利用现代分子生物学来帮助我们理解结核分枝杆菌的传播和流行病学机理。目的：分析耐药结核分枝杆菌分子流行病学和1995--2004年芬兰耐异烟肼及利福平相关突变菌株。设计：对3959株新结核分枝杆菌菌株进行了药物敏感性试验，如有必要，所有的耐药性表型菌株都进行了IS6110限制性片段长度多态性和间隔寡核苷酸分型分析。对耐异烟肼及利福平菌株分别进行了katG315位密码子和rpoB耐性基因测序。结果：在测试的3959（92．4％为培养阳性）株分离株中，183个（4．6％）对至少一种一线抗结核药耐药；14（0．4％）株为耐多药。37株（20．4％）耐性菌株属于17个簇，其中最大的簇包括4个分离株。北京家族占所有耐药菌株的8．8％（16株）。在异烟肼耐药菌株中，katG的Ser315Thr突变占46．7％（56株）；在利福平耐药菌株中rpoB突变占85．7％（18株）。结论：耐药结核病在芬兰传染率很少，尤其在本地和外来人口间。如果存在产生耐多药的危险因素，筛查异烟肼和利福平耐药相关突变是可行的。     

结核分枝杆菌katG S315T突变频率及突变株特征的研究

近年来分子遗传学研究表明，异烟肼（INH）耐药机制复杂，涉及多个基因，至少包括katG、inhA、kasA以及ahpC等基因。研究表明，INH耐药与编码过氧化氢酶．过氧化物酶的katG基因突变的联系最强，其中katG基因的一种特定替换，315位密码子的AGC→ACC（Ser→Thr，或katG S315T）颠换报道最多。该突变可降低INH耐药菌株中过氧化氢酶活性，但可保持足够水平的该酶的过氧化物酶活性，后者为细菌解毒所必需。世界各地结核分枝杆菌菌株中，katG S315T突变的流行率一般为26．0％～93．6％，结核病高发区流行率高。在俄罗斯圣彼德堡地区，该突变还与耐多药性有关，在荷兰该突变亦与高水平耐药、耐其他药物有关。研究我国农村耐多药结核病（MDR-TB）高发地区INH耐药分离株中katG S315T突变的发生频率与突变株特征有利于耐药结核病的防治。     

应用基因芯片分析结核分枝杆菌常见耐药基因型的研究

目的应用基因芯片快速检测结核分枝杆菌耐药基因型，建立一种新的分子药敏试验方法。方法以传统药敏试验和PCR－直接测序方法为对照，应用基因芯片快速检测157株结核分枝杆菌临床分离株异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（SM）和乙胺丁醇（EMB）耐药基因（katG、rpoB、rpaL、rrs和embB）的带荧光素标记的PCR产物。结果PCR-直接测序和基因芯片检测36株结核分枝杆菌药物敏感株的5种耐药基因均为野生型。121株结核分枝杆菌耐药分离株中，56株耐INH分离株，katG基因突变率为62．5％，其中katG缺失率为7．5％，315位密码子突变率为55．4％，279位密码子突变率为1．8％；104株耐RFP株，rpoB基因突变率为94．2％，最常见的突变位点为531位和526位密码子（突变率分别为60．6％、15．4％），双位点突变率为5．8％，还发现511、513、515、516、517、518和533位密码子突变；62株耐SM分离株，rpsL和ITS总突变率为88．7％（两者分别为82．3％、6．5％），rpsL突变位于43位和88位密码子（突变率分别为77．4％、4．8％），rrs突变位于513位和516位碱基（突变分别为4．8％、1．6％）；57株为耐EMB株，embB基因突变率为61．4％，均为306位密码子突变，最常见的突变为ATG→GTG或剐rA（突变率分别为35．1％、15．8％），还发现306位密码子ATG→ATC、ATT和CTG突变。通过基因芯片检出的突变与基因测序结果一致。结论应用基因芯片可分析大多数结核分枝杆菌耐药基因型，弥补传统药敏试验方法的不足，指导临床治疗。     

耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株耐药相关基因突变研究

目的阐明结核分枝杆菌耐异烟肼临床分离株katG、inhA、ahpC、kasA及oxyR基因突变特点。方法对144株结核分枝杆菌临床分离株(耐异烟肼菌株101株;异烟肼敏感株43株)的katG、inhA、kasA、ahpC及oxyR基因进行DNA片断扩增及DNA序列分析,与GeneBank中结核分枝杆菌标准序列进行比较。结果(1)耐异烟肼菌株中未发现katG完全缺失,81株耐药株(80.2%)katG存在点突变、缺失或插入,其中16个突变位点未见报道;39株(38.6%)耐药株第315位点突变,低耐药菌株(1μg/ml)第315位点突变率显著高于高耐药菌株(10μg/ml;χ2=9.31,P<0.05);58株(57.4%)耐药株第463位点突变。23株(53.3%)敏感株第463位点突变。(2)5株(4.9%)耐药株inhA发生突变。敏感株inhA无突变。(3)3株(2.9%)耐药株ahpC发生突变。敏感株ahpC无突变。(4)17株(16.8%)耐药株kasA发生突变。敏感株中3株菌株Gly312Ser突变。(5)在全部菌株中未发现oxyR基因突变。(6)综合本项研究中各基因的突变情况,共有91株耐异烟肼菌株发生与异烟肼耐药相关的突变。结论本项研究进一步证实了结核分枝杆菌耐异烟肼与katG、inhA、ahpC及kasA基因突变之间的关系,并且提示还有其他机制参与异烟肼耐药。     

耐多药结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因katG突变分析

异烟肼(isoniazid, INH)是一种重要的抗结核药物,其在细菌体内被过氧化氢酶-过氧化物酶KatG氧化为乙酰异烟肼自由基和活性氧自由基等活性物质,进而攻击结核分枝杆菌多个靶位点来发挥杀菌作用。Zhang等通过Southern印迹杂交（Southern blot）发现结核分枝杆菌katG基因缺失和异烟肼耐药相关。研究表明,异烟肼耐药与许多基因相关,发生频率最高的为katG编码区和inhA启动子区的突变,katG315位突变最常见,有30%～94%的耐药株发生该突变,但国内对于该基因其他位点的突变研究较少。本研究通过对河南省耐多药(multidrug resistant,MDR)结核分枝杆菌katG编码区全长突变进行分析,进一步分析异烟肼的耐药机制。