JC病毒t抗原的融合蛋白表达及抗体制备

目的 构建JC病毒t抗原的原核融合蛋白表达载体,表达并纯化该融合蛋白.方法 采用PCR方法 从患者脑脊液中扩增JC病毒t抗原,测序正确后再克隆入pET32a(+)质粒,构建pET32a(+)-t表达重组体,并诱导表达t抗原融合蛋白.大量制备该融合蛋白并以镍柱亲和层析纯化.然后以纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果pET32a(+)-t表达出相对分子质量为41 000左右的重组蛋白.十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示,异丙基-βD-硫代半乳糖苷诱导后3.5～20.0 h融合蛋白均高水平表达.Western印迹证实具有良好的抗原性,免疫BALB/c小鼠后,成功制备了鼠多克隆抗体.结论 成功构建原核表达载体pET32a(+)-t,表达纯化t抗原融合蛋白,成功制备了JC病毒小包膜蛋白t的抗体,为进一步流行病学调查及该基因的功能研究奠定了基础.     

GⅡ.2型诺如病毒VP1蛋白原核表达及蛋白纯化

目的利用原核表达系统,表达了GⅡ.2型诺如病毒VP1蛋白,优化诱导条件并进行蛋白的纯化。方法扩增诺如病毒的VP1基因,克隆至pET32a(+)载体,构建重组质粒pET32a-VP1。将pET32a-VP1转化至大肠埃希菌BL21(DE3),加入IPTG进行诱导表达并优化诱导条件。利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化表达蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度。结果成功扩增大小为1 659 bp的诺如病毒VP1基因。PCR检测重组质粒pET32a-VP1构建成功。将重组质粒转化至BL21(DE3),IPTG诱导表达70×10~3的VP1重组蛋白,优化的最佳诱导表达条件为37℃,0.6 mmol/L IPTG诱导5 h。重组蛋白以包涵体的形式表达,并SDS-PAGE鉴定镍柱纯化产物为单一电泳条带的目的蛋白。结论利用原核表达系统成功构建了重组质粒pET32a-VP1,并表达纯化了诺如病毒VP1重组蛋白,为单克隆及多克隆抗体的制备、检测试剂盒以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

A型口蹄疫病毒型特异性抗原的可溶性原核表达及多克隆抗体的制备

目的可溶性表达A型口蹄疫病毒型特异性结构蛋白VP1,制备型特异性的兔抗A型FMDV VP1多克隆抗体。方法以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-AVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有OmpT信号肽编码序列的VP1基因编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建可溶性原核表达载体pET-30a-OmpT-AVP1。将该重组质粒转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,以金属离子螯合层析法对可溶性表达的VP1融合蛋白进行纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA、Western blot和间接免疫荧光法分别对多克隆抗体进行鉴定。结果 SDS-PAGE电泳分析显示pET-30a-OmpT-AVP1重组菌经诱导后表达一Mr约为33 000的VP1融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带。Western blot分析结果显示,VP1蛋白可与豚鼠抗A型口蹄疫病毒阳性血清反应。用纯化VP1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12 800以上,具有较高的型特异性,并且可与同型FMDV细胞培养物中的病毒抗原发生反应。结论制备了具有高亲和性和特异性的兔抗A型FMDV结构蛋白VP1多克隆抗体,为A型FMDV易感动物的抗体筛查及病原鉴定奠定了基础。     

犬瘟热病毒M蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的对犬瘟热病毒(CDV)弱毒株M基因进行克隆及原核表达,并制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。方法针对犬瘟热病毒弱毒株(CDV-LP)的M基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-30a(+)并转化至宿主菌BL21(DE3),在0.4mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化的M蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。结果通过RT-PCR成功扩增出大小为1 014bp的CDV M基因,构建的重组质粒pET-30a(+)-M在大肠埃希菌中诱导表达出分子质量单位为43ku的重组M蛋白,与预期值相符;重组蛋白主要以包涵体形式表达,Western blot检测显示M重组蛋白能被抗CDV多克隆抗体识别;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应。结论本研究成功构建了pET-30a(+)-M并表达了CDV M蛋白,制备了鼠多克隆抗体,为建立CDV M蛋白的ELISA抗原检测方法,鉴定表达M蛋白的重组杆状病毒奠定了基础。     

鹦鹉热衣原体噬菌体Chp1衣壳蛋白VP1的原核表达及多克隆抗体制备

目的原核表达并纯化鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)噬菌体Chp1衣壳蛋白VP1的重组蛋白rVP11-190,并制备多克隆抗体。方法采用Clustal Omega在线软件对6株衣原体噬菌体VP1蛋白的氨基酸序列进行多重比对,确定Chp1VP1蛋白的保守区和特异区,并用DNAStar软件预测抗原表位。选择VP11-190与pET28a(+)载体连接构建原核表达载体pET28a-VP11-190,转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达,采用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫ICR小鼠,制备免疫血清,ELISA法检测其抗rVP11-190的效价。结果构建的原核表达载体pET28(a)-VP11-190经IPTG诱导高效表达了相对分子质量约为30×103的重组蛋白。用该蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体血清,ELISA法测定免疫小鼠血清抗体效价为1∶12 800。结论成功原核表达并纯化了噬菌体Chp1衣壳蛋白VP11-190的重组蛋白,制备的鼠抗VP11-190多克隆抗体血清效价及特异性良好,为进一步分离鉴定鹦鹉热衣原体的噬菌体奠定了基础。     

肠道病毒71型VP1包涵体蛋白的复性与纯化

目的 利用原核表达系统,经优化诱导条件及变、复性将包涵体形式肠道病毒71型结构蛋白VP1进行纯化。方法 通过RT-PCR扩增VP1基因,并应用基因克隆技术将VP1基因与pET-28a原核表达载体连接,之后将重组载体转化至大肠埃希菌Rosseta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后对包涵体进行变、复性,采用His镍柱亲和层析对VP1蛋白进行纯化,利用SDS-PAGE和Western blot对VP1蛋白进行分析鉴定。结果 PCR扩增出891 bp的EV71-VP1基因,双酶切鉴定原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1构建正确。重组载体转化DE3后经IPTG诱导表达VP1蛋白,且以包涵体形式存在。将包涵体变、复性,经SDS-PAGE分离后进行镍柱纯化,得到较纯的目的蛋白,Western blot分析该蛋白能被相应抗体识别。结论 构建的原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1转化DE3后经IPTG诱导表达以包涵体形式存在的VP1蛋白,复性后纯化的VP1蛋白具有免疫原性,为EV71 VP1蛋白的研究与开发奠定了基础。     

狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用

目的以狂犬病病毒P蛋白作为检测抗原,用间接ELISA方法检测狂犬病病毒抗体。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)LEP-Flury株的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出P基因的全长序列,克隆于pGM-T载体中,获得重组质粒pGM-T-P,将重组质粒用限制性内切酶NotI和EcoRI进行双酶切,酶切产物定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核重组表达质粒pET-32a-P,阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的蛋白作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步将间接ELISA方法应用于狂犬病病毒抗体的检测中。结果扩增RV P基因,构建了克隆质粒pGM-T-P、原核表达质粒pET-32a-P,高效表达了主要以可溶性形式存在的P蛋白,并能与RV阳性血清发生特异性反应。用表达的狂犬病病毒重组P蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法。结论成功表达了磷蛋白,用其作为固化抗原以间接ELISA方法检测RV抗体。     

口蹄疫病毒3D聚合酶多克隆抗体的制备与特性分析

目的表达口蹄疫病毒3D聚合酶,并制备兔抗3D多克隆抗体。方法采用PCR方法扩增口蹄疫病毒(FM-DV)3D聚合酶基因,经BamHⅠ和NdeⅠ双酶切后插入pET-30a(+)原核表达载体,构建的pET-3D重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达并提取包涵体,纯化目的蛋白。然后用纯化蛋白免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,以Western blot鉴定抗体特异性,并以间接ELISA方法测定其效价。结果SDS-PAGE电泳分析显示,表达的目的蛋白约为46ku,与预期结果相符,制备的多克隆抗体效价达1∶8000以上,且具有较高的特异性。结论制备了具有高亲和性和特异性的3D聚合酶多克隆抗体,为3D聚合酶的生物学功能和抗原表位研究奠定了基础。     

刚地弓形虫Peroxiredoxin多克隆抗体的制备及鉴定

目的 原核表达刚地弓形虫过氧化物氧化还原酶(peroxiredoxin,Prx)并制备多克隆抗体。方法 PCR技术扩增弓形虫cDNA中的prx基因,克隆至pET-28a(+)载体,构建prx/pET-28a(+)重组表达载体,转化至大肠埃希菌(E.coli)Rosetta中诱导表达。亲和层析纯化重组Prx蛋白,并制备兔多克隆抗体,蛋白印迹技术对多克隆抗体进行鉴定。结果 成功从弓形虫cDNA中扩增出prx目的基因,构建了prx/pET-28a(+)重组质粒,获得抗Prx重组蛋白的多克隆抗体。蛋白印迹技术检测出弓形虫Prx的特异性条带。结论 重组弓形虫Prx制备的多克隆抗体能检测Prx在弓形虫速殖子表达。     

微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

目的对微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA基因进行克隆、表达和反应原性分析。方法以微小隐孢子虫总RNA逆转录的cDNA为模板,克隆S-dsRNA基因,并转化至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET-28a(+)-S,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白的表达情况,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白与鼠抗微小隐孢子虫阳性血清的反应原性。结果 PCR和双酶切鉴定表明,重组质粒pET-28a(+)-S构建成功。SDS-PAGE结果显示,37℃下经1mmol/L IPTG诱导4h,重组蛋白表达量最大。重组蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为37000,与预期大小一致,重组蛋白约占蛋白总量的72.6%。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能识别抗微小隐孢子虫阳性鼠血清。结论微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA基因表达成功,重组蛋白具有反应原性。     

人类免疫缺陷病毒1型HXB2株Tat突变体的构建、原核表达及免疫原性分析

目的 构建HIV-1 HXB2株Tat基因半胱氨酸富集区3'末端移位突变体,经原核表达和纯化,分析该突变体蛋白(Tat-cct)的免疫原性.方法 用PCR方法将HIV-1 HXB2株Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸)移位至Tat基因的3'末端,获得其突变体DNA序列,并构建其原核表达质粒pET32a-Tat-cct,转入大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化.以Tat-cct融合表达蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法对该抗血清进行免疫原性检测分析.结果 pET32a-Tat-cct重组质粒可在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,纯化后其融合蛋白相对分子质量约为31 000.Tat-cct重组蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体滴度为1:1600,该抗体与Tat-cct蛋白和Tat蛋白(1～101位氨基酸)均呈特异性结合反应.结论 Tat突变体重组蛋白Tat-cct能在大肠埃希菌中有效表达.并较好保留其免疫原性,为HIV-1 Tat疫苗的基础研究提供了有价值的实验结论.     

细粒棘球蚴铁蛋白基因的克隆重组高效表达及免疫学初步研究

目的构建细粒棘球蚴（Echinococcus granulosusEg）铁蛋白（ferritin）基因的原核表达重组质粒并表达、纯化该重组蛋白，初步研究其免疫反应。方法将细粒棘球蚴铁蛋白基因亚克隆于表达载体pGEX-6p-1，转化重组体到大肠杆菌B121中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达；用SD争PAGE和Western—blot对表达产物进行初步鉴定，用切胶纯化的融合蛋白免疫BALB／c小鼠，通过Western-blot对该蛋白的免疫学特性进行初步研究。结果重组铁蛋白与GST以融合表达的形式在细菌中高效表达，表达产物为不可溶性的包涵体，蛋白分子量约为42kD。融合蛋白Egferritin／GST能被细粒棘球蚴免疫的家兔血清和特异性小鼠抗血清所识别，同时特异性小鼠抗血清可识别天然抗原囊液、原头蚴可溶性蛋白中约19kD的蛋白条带。结论成功地表达细粒棘球蚴重组铁蛋白，并且该蛋白有一定的免疫原性及抗原性。     

猪链球菌2型中国强毒株CovR重组蛋白及其抗体的制备

目的通过构建pET32a-covR原核表达质粒,表达并提纯CovR重组蛋白,制备其多克隆抗体。方法采用PCR法,从四川资阳病人分离株05ZYH33基因组扩增CovR的编码基因covR,构建重组表达质粒pET32a-covR,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE鉴定后,His亲和层析柱纯化CovR重组蛋白;免疫新西兰兔制备特异性抗体,Western blot检测兔多抗血清的特异性,间接ELISA检测其滴度。结果covR基因在原核细胞中得到高效表达,重组蛋白免疫新西兰兔后血清效价高达1∶204800,且重组蛋白能够与之发生特异性的反应。结论成功构建了表达载体pET32a-covR,可在E.coliBL21中高效表达,制备了特异性抗体,为进一步研究CovR的调控机理奠定了基础。     

我国登革2型病毒分离株E蛋白B抗原区的表达与鉴定

目的登革2型病毒(DEN2)E蛋白B抗原区的融合表达、纯化和抗原性初步分析。方法将DEN2GZ14株E蛋白B抗原区基因连接到克隆载体pGEM-T并转染E.coliDH5α,酶切后连接至表达载体pET-32a(+)并转染E.coliBL21,IPGT诱导表达,WesternBlot和间接ELISA分析表达产物的抗原性。结果含有DEN2E蛋白B抗原区基因质粒的表达菌表达了相对分子量为31kDa的融合蛋白,WesternBlot分析表明其能与小鼠多克隆抗体发生特异性反应,间接ELISA分析其与10例登革2型病毒感染者血清发生阳性反应。结论获得的DEN2GZ14株E蛋白B抗原区的基因表达蛋白有良好的抗原性。     

日本血吸虫21.7kDa膜蛋白的表达及特性分析

目的　对日本血吸虫中国大陆株 2 1 .7kDa膜蛋白分子 (SjC2 1 .7)进行体外重组表达 ,纯化并分析其免疫特性。　方法　将SjC2 1 .7分子基因亚克隆到表达载体 pGEX 4T 3中构建重组表达质粒。重组质粒转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导 ,表达GST SjC2 1 .7融合蛋白 ,用亲和层析及蛋白酶切制备纯化的重组SjC2 1 .7分子。将重组SjC2 1 .7免疫小鼠制备抗血清 ,用Westernblotting分析其免疫特性。　结果　SjC2 1 .7分子基因被成功地克隆到表达质粒 pGEX 4T 3中 ,并获得能表达GST SjC2 1 .7融合蛋白的转化子。纯化的重组SjC2 1 .7蛋白免疫昆明鼠能产生高效价的抗体。该重组蛋白能被免疫鼠血清和重感染兔血清所识别 ,免疫鼠血清能识别成虫抗原 (AWA)中相应分子量的蛋白质条带。　结论　本研究获得具有较好免疫原性的重组SjC2 1 .7蛋白质分子 ,为进一步研究其免疫保护性作用奠定了基础     

轮状病毒VP4蛋白与肠产毒性大肠杆菌热稳定肠毒素蛋白的融合表达

利用DNA重组技术将轮状病毒（Rotavirus RV)VP4蛋白主要抗原编码区基因与产肠毒素大肠杆菌(Enteotoxigenic Escherichia coli ETEC)热稳定肠毒素（Heat-stable enteotoxin Escherichia coli ST)基因融合，插入原核表达质粒pET-28a( )中，经PCR、酶切、测序分析表明已将vp4-st片段克隆入PET－28a( ),而且具有正确的读码框和方向性，正确构建了VP4－ST的融合表达载体pET28-VP4-ST。表达质粒转化受体菌BL21（DE3）plysS，取经IPTG诱导后表达的目的蛋白进行SDS－PAGE、凝胶薄层扫描分析。结果表明：表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，大小约40．2kDa，表达的蛋白量占菌体总蛋白的13．048％。     

弓形虫表面抗原SAG2基因的克隆表达纯化及鉴定

目的构建弓形虫表面抗原2(SAG2)基因重组质粒并在大肠埃希菌中表达。方法根据SAG2基因序列设计并合成引物,用PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因片段,再克隆到p GEX-4T载体中,构建重组质粒。重组质粒经酶切鉴定并测序后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blotting分析其反应原性。结果 SAG2基因PCR产物大小约为561 bp,与预期相符。重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的SAG2融合蛋白分子量约为47 ku,该蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫SAG2基因,表达蛋白具有反应原性。     

血管紧张素Ⅱ相关新基因BC097361融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建血管紧张素Ⅱ相关新基因BC097361的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗BC097361蛋白多克隆抗体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR技术,以LX02细胞总RNA为模板,扩增BC097361目的 基因片段,构建原核表达载体pET-32a(+)-BC097361.转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-半乳糖苷诱导并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,Western blot分析证实融合蛋白表达的特异性.大量表达后利用Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性.纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗BC097361蛋白的多克隆抗体.以纯化的BC097361蛋白为抗原,分别以免疫前后的新西兰兔血清作为第一抗体,利用Western blot和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测.结果 扩增获得BC097361基因片段,成功表达了BC097361相关蛋白,经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot分析得到证实.成功获得融合蛋白及兔抗BC097361多克隆抗体.酶联免疫吸附法检测证实多克隆抗体效价>1:320 000,Western blot、免疫组织化学检测证明多克隆抗体的特异性良好.结论 利用大肠埃希菌BL21(DE3)能够成功表达BC097361蛋白,获得高特异性、高效价兔抗BC097361蛋白的多克隆抗体,为今后研究BC097361蛋白的生物学特性奠定了基础.     

食物中毒菌多联融合毒素Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB的表达及免疫学特性研究

目的构建食物中毒菌多联融合毒素基因及重组表达载体,制备抗5种毒素的血清抗体。方法采用一定的linker序列(G-P-G-P-G)将克隆的3种食物中毒菌的5个毒素基因片段进行串联,并定向克隆到表达载体pET-22b(+)的NcoI和XhoI位点之间,构建五联融合毒素基因及重组表达载体,表达产物经切胶回收初步纯化后免疫獭兔,制备抗血清,利用ELISA和琼脂扩散试验检测抗体和5种毒素反应的特异性和敏感性。结果构建了重组融合毒素(命名为F5)Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB基因和重组表达载体F5-22b,且在表达宿主菌E.coliBL21中得到有效表达(9.90%),基因序列全长2937bp,编码成熟蛋白979个氨基酸,融合蛋白分子量112.369ku,测序结果与设计序列(GenBank)100%同源。表达产物经初步纯化后免疫獭兔获得抗五种毒素的血清抗体,且具有较高的特异性和敏感性。结论成功构建了融合毒素基因,获得了抗五种毒素的血清抗体,本实验结果为下一步建立食品广谱、快速免疫学检测新方法奠定了基础。