内源性IL-8诱导卵巢癌细胞对顺铂与紫杉醇产生耐药的机制研究

目的探讨内源性IL-8诱导卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇产生耐药的机制及相关信号转导通路。方法在原有工作基础上,以2种人卵巢癌细胞系A2780(不分泌IL-8,对顺铂、紫杉醇敏感)和SKOV-3(高分泌IL-8,对顺铂、紫杉醇耐药)为研究模型,分别将正义(sense,ss)IL-8基因或反义(antisense,as)IL-8基因稳定转染至A2780细胞或SKOV3细胞,应用MTT法、Caspase-3活性测定、RT-PCR及Western blot技术等观察内源性IL-8是否影响卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性,并对其作用的机制和可能的信号传导通路进行研究。结果 1)内源性过表达IL-8可诱导A2780细胞对顺铂和紫杉醇产生耐药,而抑制IL-8表达可恢复SKOV3细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性,IL-8诱导的卵巢癌细胞化疗耐药是通过降低Caspase-3活性来实现的;2)内源性过表达IL-8可上调A2780细胞的耐药相关基因MDR1和凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xL及XIAP的表达,而抑制IL-8表达可使上述基因的表达明显降低;3)Wortmannin(PI3K抑制剂)和PD98059(MEK1/2抑制剂)能分别阻断IL-8诱导下卵巢癌细胞的Akt和ERK活化及化疗耐药作用。结论 IL-8诱导的卵巢癌细胞化疗耐药可能与其上调耐药相关基因MDR1和凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xL及XIAP的表达以及活化Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路相关,提示调节IL-8表达或其相关信号通路可能是治疗耐药性卵巢癌的一种良好策略。     

卵巢癌细胞IL-6、IL-8分泌与其化疗敏感性及耐药相关基因和凋亡抑制基因表达关系的初步探讨

目的 分析比较4种常见的人E皮性卵巢癌细胞系IL-6、IL-8分泌与其化疗敏感性及部分耐药相关基因和凋亡抑制基因表达的关系,为今后研究IL-6、IL-8诱导卵巢癌细胞对化疗药物产生耐药的机制奠定基础.方法 IL-6、IL-8及其受体的表达采用RT-PCR、ELISA及免疫印迹技术进行检测,卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性采用M1Tr试验进行分析,耐药相关基因和凋亡抑制基因的表达则采用RT-PCR进行测定.结果 1)4种卵巢癌细胞除A2780细胞外均组成性分泌IL-6和IL-8,二者转录水平与其蛋白水平基本一致.2)4种卵巢癌细胞均表达IL-6受体和IL-8受体.3)4种卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性不同,其中A2780细胞最敏感,ES-2细胞次之,CAOV-3和SKOV-3细胞则有不同程度的耐药性.4)部分耐药相关基因和凋亡抑制基因在A2780和ES-2细胞中的表达水平均较低,而在CAOV-3和SKOV-3细胞中的表达水平均较高.结论 卵巢癌细胞IL-6、IL-8的自分泌水平(尤其是IL-6的水平)与其对顺铂和紫杉醇的敏感性基本呈负相关趋势,与其部分耐药相关基因和凋亡抑制基因的表达水平相一致.     

p53依赖的X-连锁凋亡抑制蛋白调节与卵巢癌顺铂耐药的关系

目的本研究旨在探讨X-连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）在卵巢癌顺铂耐药中的作用。方法应用RT—PCR、Western Blot、流式细胞仪等检测卵巢癌顺铂敏感细胞株0V2008、A2780s和耐药株C13＊、A2780cp中XIAP表达和卵巢癌细胞的凋亡率,并将反义XIAP寡核苷酸（XIAPAs—ODN）、正义XIAP寡核苷酸（XIAPs—ODN）和随机对照链导入顺铂耐药细胞C13＊（p53野生型）和A2780cp（p53突变型）中,比较转染前、后耐药细胞Caspase-3活性和顺铂耐药性的改变。结果卵巢癌顺铂敏感细胞和耐药细胞中XIAP在mRNA水平的表达无明显差异（P〉0．05）。顺铂可以引起OV2008和A2780s中XIAP蛋白表达明显下降（P〈0．05）,而对C13＊和A2780cp的XIAP蛋白含量无明显影响（P〉0．05）。转染XIAPAs—ODN可降调p53野生型耐药细胞C13＊中XIAP的表达,并显著增加Caspase-3活性和对顺铂敏感性（P〈0．05）,而XIAP As—ODN对p53突变型耐药细胞A2780cp无此作用。结论卵巢癌细胞对顺铂产生耐药可能与XIAP蛋白相对高表达有关,反义XIAP可在一定程度上逆转卵巢癌顺铂耐药,该作用与卵巢癌细胞的p53表型有关。     

自分泌IL-6经Ras/MEK/ERK、PI3K/Akt通路促进卵巢癌细胞黏附和侵袭功能的研究

目的探讨内源性IL-6表达改变对卵巢癌细胞黏附和侵袭功能的影响及相关信号转导通路。方法利用以往构建的内源性过表达IL-6的人卵巢癌A2780细胞系和内源性抑制IL-6表达的人卵巢癌SKOV-3细胞,分别采用细胞体外黏附实验、Transwell小室体外侵袭实验、免疫印迹技术等观察IL-6对卵巢癌细胞黏附、侵袭能力的影响,并对其可能的信号通路进行研究。结果与对照组相比,内源性过表达IL-6可促进卵巢癌细胞的体外黏附和侵袭功能;抑制IL-6表达则可抑制卵巢癌细胞的上述功能。过表达或抑制表达IL-6可增加或减少卵巢癌细胞磷酸化ERK、Akt的表达水平,应用ERK或Akt特异性信号阻断剂可显著抑制高表达IL-6的卵巢癌细胞黏附和侵袭作用,提示可能与其活化Ras/MEK/ERK、PI3K/Akt通路有关。结论卵巢癌细胞产生的IL-6可经Ras/MEK/ERK和PI3K/Akt通路增强自身的黏附和侵袭能力,调节IL-6表达及相关信号转导通路可能是未来临床控制卵巢癌进展的一种良好策略。     

卵巢癌细胞IL-6、IL-8分泌与其他莫西芬敏感性及ER亚型及p160共激活因子表达关系的初步探讨

目的分析比较4种常见的人上皮性卵巢癌细胞系(A2780、CAOV-3、SKOV-3和ES-2)IL-6、IL-8分泌与其他莫西芬(Tamoxifen,TAM)敏感性及雌激素受体(estrogen receptor,ER)亚型及p160共激活因子表达的关系,为今后研究IL-6、IL-8诱导卵巢癌细胞对内分泌治疗产生耐药的机制奠定基础。方法 IL-6、IL-8的表达采用RT-PCR及ELISA法进行检测,卵巢癌细胞对TAM的敏感性采用MTT试验进行分析,ERα、ERβ及p160共激活因子的表达采用免疫印迹和RT-PCR技术进行检测。结果 4种卵巢癌细胞除A2780细胞外均组成性分泌IL-6和IL-8;4种细胞对TAM的敏感性不同,其中A2780细胞最敏感,CAOV-3、SKOV-3和ES-2细胞则有不同程度的耐药性(耐药倍数分别为4.98、3.75和2.66);这些细胞均不同程度地表达ERα,其中A2780细胞较低,CAOV-3和SKOV-3细胞较高,ES-2细胞居中;ERβ的表达情况则与ERα恰好相反;3种p160共激活因子mRNA的表达水平均以A2780细胞为最低,而ES-2、SKOV-3和CAOV-3细胞则依次升高。结论卵巢癌细胞IL-6、IL-8的自分泌水平与其对TAM的敏感性呈负相关,与其ERβ(而非ERα)及3种p160共激活因子的表达水平相一致。     

IL-6经MEK/ERK途径促进ERα-Ser118磷酸化影响卵巢癌细胞他莫昔芬耐药

目的研究IL-6信号通路对ERα的Ser118位点磷酸化影响、对ERα转录活性的影响及IL-6诱导卵巢癌TAM耐药的机制。方法脂质体转染法获得内源性过表达IL-6的人卵巢癌A2780细胞株和内源性抑制IL-6表达的人卵巢癌CAOV3细胞株,Western blot法检测内源性和外源性IL-6对ERK和ERα的Ser118位点磷酸化影响,MTT法检测IL-6的MEK/ERK信号通路对A2780细胞TAM耐药性的影响,荧光素酶活性检测IL-6的MEK/ERK信号通路对ERα转录活性的影响。结果过表达IL-6能上调A2780细胞中ERα-Ser118的磷酸化水平,而抑制IL-6表达下调CAOV3细胞中ERα-Ser118的磷酸化水平;外源性IL-6上调A2780细胞中ERK的磷酸化水平,而MEK1/2特异性抑制剂PD98059则可以逆转IL-6介导的ERK及ERα-Ser118的磷酸化;PD98059可明显降低IL-6导致的A2890细胞对TAM的耐药性;IL-6明显促进ERα转录活性,而PD98059可逆转这一作用。结论 IL-6经MEK/ERK通路磷酸化ERα的Ser118位点促进ERα转录活性而激活ER途径,诱导OVCA细胞对TAM的耐药性。     

卵巢癌细胞IL-6、IL-8分泌与他莫西芬敏感性及MAPK、Akt活性和ER特异性位点磷酸化水平的关系

目的:分析比较4种常见的人上皮性卵巢癌细胞系(A2780、CAOV-3、SKOV-3和ES-2)IL-6、IL-8分泌与他莫西芬(TAM)敏感性及MAPK、Akt活性和雌激素受体(ER)特异性位点磷酸化水平的关系,探讨IL-6、IL-8诱导卵巢癌细胞对内分泌治疗产生耐药的机制。方法:RT-PCR及ELISA法检测IL-6、IL-8的表达,MTT法分析卵巢癌细胞对TAM的敏感性,免疫印迹法测定MAPK、Akt活性及ER特异性位点的磷酸化水平。结果:(1)4种卵巢癌细胞除A2780细胞外均组成性分泌IL-6和IL-8,二者转录水平与其蛋白水平基本一致;(2)4种卵巢癌细胞对TAM的敏感性不同,其中A2780细胞最敏感,CAOV-3、SKOV-3和ES-2细胞则有不同程度的耐药性,其耐药倍数分别为4.99、3.76和2.66;(3)4种卵巢癌细胞的MAPK、Akt活性存在差异,CAOV-3细胞的二者活性最强,SKOV-3细胞的MAPK活性弱于ES-2细胞,而其Akt活性则强于ES-2细胞,A2780细胞未检测到二者有活性;(4)ER的第167位丝氨酸(Ser167)在四种卵巢癌细胞中均存在不同程度的磷酸化,ER的第118位丝氨酸(Ser118)除A2780细胞外亦存在不同程度的磷酸化。结论:卵巢癌细胞IL-6、IL-8的自分泌水平与其对TAM的敏感性呈负相关,与其MAPK、Akt活性和ER特异性位点(Ser167、Ser118)的磷酸化水平相一致。     

不同方式诱导卵巢癌顺铂耐药细胞系的比较

目的用不同诱导方式建立卵巢癌顺铂耐药细胞系,探讨耐药机制。方法分别采用顺铂大剂量诱导法和小剂量间歇诱导法诱导卵巢癌细胞系SKOV3,建立卵巢癌顺铂耐药细胞系SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80。倒置显微镜进行形态学观察;细胞计数观测生长增殖规律;MTT法检测IC50和RI;流式细胞仪检测细胞周期分布;RT-PCR法检测耐药相关基因,包括MDR1、MRP1、LRP1、GST-π等mRNA的表达。结果SKOV3/CDDP-P和SK-OV3/CDDP-80的耐药指数分别为4.12±2.01和11.50±3.15,均伴有细胞形态、生长增殖、细胞周期的改变;SK-OV3/CDDP-P的MDR1表达增强,MRP1、LRP1表达均下调;SKOV3/CDDP-80除MDR1表达上调外,其余三种基因表达无改变。结论不同方式诱导的细胞系存在着差异,顺铂耐药涉及多个耐药基因、因素的变化,间歇诱导方式更易产生耐药。     

应用XIAP siRNA逆转卵巢癌顺铂耐药性的研究

目的本研究旨在探讨应用siRNA下调XIAP在卵巢癌耐药细胞中的表达而逆转其对顺铂的耐药性。方法应用Western Blot、Hoechst 33258等检测卵巢癌顺铂敏感细胞株COC1和耐药株COC1／DDP中XIAP表达和卵巢癌细胞的凋亡率,并将XIAPsiRNA导入耐药细胞,比较转染前、后耐药细胞对顺铂耐药性的改变。结果卵巢癌耐药细胞COC1／DDP中XIAP蛋白表达明显比敏感细胞COC1中高（P〈0．05）。XIAP siRNA可下调耐药细胞COC1／DDP中XIAP的表达,并显著增加对顺铂敏感性（P〈0．05）。结论XIAP siRNA可在一定程度上逆转卵巢癌顺铂耐药。     

卵巢癌顺铂敏感与耐药细胞ClC-3蛋白表达及通道功能的差异

目的:从分子和细胞水平研究卵巢癌顺铂敏感(a2780)及耐药(a2780cp)细胞中ClC-3氯通道蛋白表达及通道功能的差异。方法:MTT法检测人卵巢癌a2780和a2780cp细胞对顺铂敏感性的差异;real-time PCR法检测ClC氯通道家族在a2780和a2780cp细胞中的mRNA表达;Western blot检测ClC-3蛋白的表达;免疫荧光法观察ClC-3蛋白在a2780和a2780cp细胞的分布;全细胞膜片钳技术记录细胞氯电流。结果:(1) a2780和a2780cp细胞对顺铂的敏感性存在差异,其IC_(50)值分别为5μmol/L和20μmol/L(P0.01);(2)对ClC氯通道家族mRNA表达的检测结果显示,a2780和a2780cp细胞主要表达ClC-3,且在a2780cp细胞中ClC-3 mRNA表达显著减少(P0.01);(3)在蛋白水平上,与a2780细胞相比,a2780cp细胞的ClC-3蛋白表达量显著降低(P0.01);(4)免疫荧光显示ClC-3在a2780细胞中主要分布在胞膜上,而在a2780cp细胞中则主要表达在胞质内;(5)顺铂能激活a2780细胞的氯通道,产生ClC-3介导的氯电流,但在a2780cp细胞中则不能;(6)ClC-3 siRNA处理a2780细胞后,顺铂诱导的氯电流则不再出现。结论:ClC-3氯通道在顺铂敏感和耐药的卵巢癌细胞蛋白分布、表达和功能上存在差异,可能是引起顺铂耐药的潜在机制之一。     

Down-regulation of UTP23 promotes paclitaxel resistance and predicts poorer prognosis in ovarian cancer

ObjectiveFrequent resistance to paclitaxel and carboplatin based chemotherapy remains a therapeutic challenge in ovarian cancer. UTP23, a small sub-unit processome component, is down-regulated in a paclitaxel-resistant cell line SKOV3-TR30 compared with its parental SKOV3 cells based on our previous study. However, the specific mechanism of UTP23 in regulating ovarian cancer chemotherapy resistance remains largely unknown.MethodsImmunohistochemical (IHC) staining was used to measure UTP23 expression in 133 ovarian cancer tissues. Then we used short hairpin RNA (shRNA), over-expression plasmid and cell counting kit-8 (CCK-8) assay to evaluate the function of UTP23 on modulating paclitaxel resistance in ovarian cancer. RNA-sequencing (RNA-seq) was used to find targeted downstream molecular of UTP23. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and western blotting were utilized to detect related genes expression.ResultsWe confirmed that UTP23 was down-regulated in both SKOV3-TR30 and A2780-TR cells compared with their parental cells. Decreased UTP23 expression was observed in ovarian cancer tissues with paclitaxel resistance. Moreover, lower expression of UTP23 was tightly correlated with patients of worse prognosis. Further UTP23 silence by shRNA increased paclitaxel resistance in SKOV3 and A2780 cells. And UTP23 over-expression by plasmid decreased paclitaxel resistance in SKOV3-TR30 and A2780-TR cells. Additionally, RNA-seq and qRT-PCR validation revealed that growth differentiation factor 15 (GDF15) was probably a downstream target for UTP23. GDF15 was notably up-regulated upon the depletion of UTP23 in both SKOV3 and A2780 cells.ConclusionOur findings elucidated a previously unknown function for UTP23 in regulating paclitaxel sensitivity and UTP23 could serve as a potential prognostic predictor for ovarian cancer.     

Platinum-resistance in ovarian cancer cells is mediated by IL-6 secretion via the increased expression of its target cIAP-2

Ovarian carcinoma patients are initially responsive to platinum-based therapy, but eventually become refractory to treatment due to the development of platinum chemoresistance. Elevated levels of interleukin-6 (IL-6) in the sera and ascites of these patients predict poor clinical outcome. Our goal was to analyze the interaction between cisplatin and cisplatin-resistant ovarian cancer cells, and to identify means of circumventing platinum resistance. We studied ovarian carcinoma cell lines and cells drawn from ovarian carcinoma patients. Gene array analyses were performed on ovarian carcinoma cells upon treatment with cisplatin, and the results were validated by ELISA and Western blotting (WB). Cytotoxicity assays were performed on anti-IL-6 Ab-, IL-6-, and cellular inhibitor of apoptosis 2 (cIAP-2) siRNA-treated cells, following cisplatin addition. Our results revealed a highly significant increase in IL-6 and cIAP-2 mRNA and protein levels upon treatment with cisplatin. WB analysis of cisplatin-treated cells exhibited decreased cIAP-2 expression level following anti-IL-6 Ab addition. Furthermore, IL-6 by itself, significantly increased cIAP-2 levels in ovarian carcinoma cells. Finally, cytotoxicity assays showed sensitization to cisplatin following the addition of IL-6 and cIAP-2 inhibitors. In conclusion, cisplatin treatment of ovarian carcinoma cells upregulates IL-6 and cIAP-2 levels while their inhibition significantly sensitizes them to cisplatin. Here, we present cIAP-2 as a novel inducer of platinum resistance in ovarian carcinoma cells, and suggest an axis beginning with an encounter between cisplatin and these cells, mediated sequentially by IL-6 and cIAP-2, resulting in cisplatin resistance. Consequently, we propose that combining IL-6/cIAP-2 inhibitors with cisplatin will provide new hope for ovarian carcinoma patients by improving the current treatment.     

紫草素对卵巢癌细胞SKOV3/DDP顺铂耐药的逆转作用

目的:探讨紫草素是否逆转卵巢癌细胞SKOV3/DDP的顺铂耐药效应及其作用机制。方法:采用CCK-8法确定紫草素和顺铂的最佳作用条件,流式细胞术检测细胞的周期分布及凋亡率;Western blot检测周期及凋亡相关调控因子细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、P18、p-Rb、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平。结果:CCK-8实验结果显示,相较于单用顺铂,联合使用紫草素对顺铂耐药卵巢癌细胞SKOV3/DDP的生长抑制作用较为显著。此外,联用紫草素和顺铂可显著抑制细胞周期G_1/S转化,并增加细胞早期凋亡率。Western blot结果显示,相较于顺铂处理组,紫草素和顺铂联用组的cyclin D1、CDK2、p-Rb及Bcl-2的蛋白水平显著降低,而P18、Bax及cleaved caspase-3的蛋白表达显著增加。结论:紫草素可逆转卵巢癌SKOV3/DDP细胞的顺铂耐药效应,其作用机制可能与影响细胞周期及凋亡相关因子的表达,进而抑制细胞活力促进细胞凋亡相关。     

抗体蛋白质芯片检测卵巢癌耐药细胞株细胞因子改变的研究

目的： 抗体蛋白质芯片初步筛选常见细胞因子在卵巢癌耐药细胞株中的表达。 方法： 对6株卵巢癌细胞分别进行平行药敏试验及细胞因子抗体蛋白质芯片检测，同时筛选78种细胞因子的表达差异，并进行两两比较。 结果： 不同种类卵巢癌细胞系对于ADM的IC50值从高到低前3位依次为SKOV3，OVCAR5，OVCAR4；CBPDA为IGROV1，SKOV3，OVCAR3；TAXOL为OVCAR4，SKOV3，IGROV1；VP16为OVCAR4，OVCAR5，OVCAR8。在对一线化疗药ADM和 CBPDA耐药性较高的SKOV3细胞中GRO，IL-6，IL-8和TIMP-2均较其余5株相对敏感细胞增高，对二线化疗药TAXOL，VP16耐药性较高细胞株OVCAR4中IL-6，IL-8较之IGROV1，OVCAR3，OVCAR5升高。 结论： 在常见分泌型细胞因子中，GRO，IL-6，IL-8和TIMP-2升高与一线化疗药ADM和CBPDA耐药性相关，IL-6，IL-8与二线化疗药TAXOL，VP16耐药性相关，不同来源的卵巢癌细胞分泌型蛋白作用机制可能存在共同的上述几种蛋白参与的调节体系。     

卵巢癌干细胞信号转导通路的研究进展

卵巢癌是死亡率最高的女性生殖系统恶性肿瘤,转移、化疗耐受、复发等原因是晚期卵巢癌患者预后不良的重要原因。尽管肿瘤干细胞在肿瘤组织中所占比例极少,但它却被认为是肿瘤发生、发展和恶化的根源。卵巢癌由于其临床特点,传统治疗手段难以对卵巢癌干细胞进行靶向治疗,进而导致治疗失败。已有研究表明,卵巢癌干细胞与早期胚胎发育之间存在相同的信号通路,本文拟就Notch、Wnt/β-catenin、Hedgehog和TGF-β四条信号转导通路在卵巢癌干细胞中的研究进行概述。