骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:采用地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C3种物质作为诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化的基本辅剂,定向诱导犬第2代BMSCs,探讨BMSCs向成骨细胞分化的潜能和成骨细胞的特征性鉴定方法.方法:无菌条件下行犬髂骨穿刺,采集骨髓15～ 20 mL,全骨髓10％ FBS DMEM培养液进行原代培养.将第2代纯化的BMSCs细胞悬液(调整细胞密度为1×105/mL)接种于含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的DMEM/FI2培养液的培养瓶(皿)中,体外扩增培养、传代.对细胞形态特征进行观察;行碱性磷酸酶(ALP)染色,骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白免疫荧光化学检测鉴定细胞性质.结果:原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长.诱导分化后的细胞形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长,传代后细胞体积略变大;BMSCs成骨诱导增殖后电镜下细胞呈多边形,可见ALP染色阳性;经成骨细胞诱导培养14 d后,细胞骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白表达阳性.结论:BMSCs易于体外分离培养及扩增,地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C体外定向诱导能够在短时间内获得大量成骨细胞,且所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能.     

人骨髓基质细胞在骨组织工程临床应用中的探讨

目的研究人骨髓基质干细胞经体外诱导表达成骨细胞表型,作为骨组织工程临床应用种子细胞的可行性。方法人骨髓中密度梯度法分离骨髓基质干细胞,诱导组予条件培养液,对照组予单纯DMEM培养液,分别培养至第3代细胞,计算各代倍增时间和3代总的扩增倍数,经相差显微镜观察,钙结节茜素红染色,四环素荧光,免疫荧光检测骨钙蛋白,成骨细胞转录因子RT-PCR检测Ⅰ型胶原,骨钙蛋白mRNA表达。结果诱导组骨髓基质干细胞(MSC)经体外诱导,三代平均扩增163.4倍后,形成钙结节,骨钙蛋白(OCN),成骨细胞转录因子(cbfa1)免疫荧光结果阳性,RT-PCR证实Ⅰ型胶原,骨钙蛋白mRNA的表达;对照组未能形成钙结节,无成骨细胞特征性蛋白OCN,cbfa1的表达。结论人MSC体外经条件培养液诱导培养三代后仍可表达成骨细胞表型,可以满足骨组织工程临床应用对种子细胞质和量的需要。     

大鼠骨髓基质干细胞的成骨诱导及鉴定

目的：研究大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）在体外培养、诱导后的形态学改变及生物活性．探讨BMSCs作为骨组织工程种子细胞的可能性和可行性。方法：通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠BMSCs，经条件培养液诱导培养后，进行形态学观察和碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）的测定。结果：经过体外成骨诱导的BMSCs表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征，同时在诱导2周后表达ALP活性，在结节期和矿化期OCN表达呈阳性。结论：体外成骨定向诱导的BMSCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

人骨髓基质细胞在骨细胞工程临床应用中的探讨

目的：研究人骨髓基质干细胞经体外诱导表达成骨细胞表型，作为骨组织工程临床应用种子细胞的可行性。方法：人骨髓中密度梯度法分离骨髓基质干细胞，诱导组予条件培养液，对照组予单纯DMEM培养液，分别培养至第3代细胞，计算各代倍增时间和3代总的扩增倍数，经相差显微镜观察，钙结节茜素红染色，四环素荧光，免疫荧光检测骨钙蛋白，成骨细胞转录因子，RT－PCR检测I型胶原，骨钙蛋白mRNA表达。结果：诱导组骨髓基质干细胞（MSC）经体外诱导，三代平均扩增163．4倍后，形成钙结节，骨钙蛋白（OCN），成骨细胞转录因子（cbfal)免疫荧光结果阳性，RT－PCR证实I型胶原，骨钙蛋白mRNA的表达；对照组未能形成钙结节，无成骨细胞特征性蛋白OCN，cbfal的表达。结论：人MSC体外经条件培养液诱导培养三代后仍可表达成骨细胞表型，可以满足骨组织工程临床应用对种子细胞质和量的需要。     

间充质细胞与骨组织共培养条件下的成骨特性

目的:在与骨组织间接共培养的条件下,观察体外培养的兔骨髓间充质干细胞的成骨特性。方法:通过间接共培养模型的建立,将新鲜兔骨碎粒及骨块与BMSCs间接共培养,观察细胞的形态学变化、碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化能力,免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素。结果:共培养的BMSCs同期ALP活性及细胞的矿化能力均显著高于普通培养组(P<0.01);经过共培养的BMSCs,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性;对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性。结论:体外建立的共培养模型部分模拟了体内成骨环境,经过共培养的BMSCs呈现向成骨细胞转化的特点。     

共培养条件下电磁场干预对大鼠成骨细胞及骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的观察共培养条件下电磁场干预对大鼠成骨细胞及骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨定向分化的影响,并探讨电磁场促进成骨分化的相关机制。 方法体外分离培养SD大鼠BMSCs及成骨细胞,将第三代成骨细胞与BMSCs通过transwell培养小室建立共培养系统。采用随机数字表法将共培养细胞分为共培养组及共培养暴磁组,另随机选择单细胞培养的BMSCs及成骨细胞纳入单细胞培养组。共培养暴磁组细胞每日给予电磁场刺激4 h。于实验进行14 d后随机提取各组细胞总RNA,采用荧光定量PCR技术检测各组细胞Runx2、Sp7、碱性磷酸酶、I型胶原、骨形态形成蛋白-2及骨钙素基因表达情况,并选用茜素红染色法检测各组细胞矿化钙结节形成情况。 结果单细胞培养模式下BMSCs及成骨细胞其各项成骨相关基因表达水平均较低,而共培养模式下BMSCs及成骨细胞其各项成骨相关基因表达均呈现不同程度增强,并且以共培养暴磁组成骨细胞上述指标增强幅度较显著。通过茜素红染色发现,与单纯共培养组比较,共培养暴磁组细胞矿化钙结节数量明显增多。 结论低频电磁场干预可显著促进共培养条件下BMSCs及成骨细胞成骨定向分化,其可能机制为电磁场刺激能促进骨形态形成蛋白-2表达,使其通过自分泌或旁分泌方式介导细胞间信号转导,从而诱导BMSCs向成骨细胞分化及成骨细胞进一步成熟分化。     

兔骨髓基质细胞的体外分离培养及诱导成骨的实验研究

目的 探讨兔骨髓基质细胞（BMSCs）的体外分离培养及定向诱导成骨的方法。方法 选择10周龄新西兰兔，抽取其股骨大转子部骨髓，体外分离纯化得到BMSCs，再利用条件培养液将其向成骨方向定向诱导培养。采用碱性磷酸酶（ALP）和冯库萨（Von Kossa）染色方法，鉴定其成骨性能。结果 BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖，经ALP和Yon Kossa染色证实其有成骨潜能。结论 兔BMSCs的体外培养增殖能力强，能诱导分化为成骨细胞，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

间充质细胞与骨组织共培养条件下的成骨特性

目的：在与骨组织间接共培养的条件下，观察体外培养的兔骨髓间充质干细胞的成骨特性。方法：通过间接共培养模型的建立，将新鲜兔骨碎粒及骨块与BMSCs间接共培养，观察细胞的形态学变化，碱性磷酸酶（ALP）的活性及矿化能力，免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素。结果：共培养的BMSCs同期ALP活性及细胞的矿化能力均显著高于普通培养组(P&;lt;0．01)；经过共培养的BMSCs，其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性；对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性。结论：体外建立的共培养模型部分模拟了体内成骨环境，经过共培养的BMSCs呈现向成骨细胞转化的特点。     

犬骨髓间充质干细胞分离纯化和成骨诱导分化:Ficoll液密度梯度离心法体外分离的可行性

背景:目前骨髓间充质干细胞较经典的分离方法是Percoll密度梯度离心法,以去除血细胞成分,但该法操作较为复杂,分离犬骨髓时需要配制密度,且离心次数较多,对细胞损伤大.目的:拟建立可靠、高纯度的犬骨髓间充质干细胞体外分离纯化方法,并观察其在体外扩增、成骨诱导分化的能力.方法:于犬髂后上棘抽取骨髓液10 mL,肝素抗凝,Hanks液稀释后,加入1.077 g/mL Ficoll液3 mL,2 000 r/min离心20 min,吸取有核细胞形成白色云雾状的分层界面,用含胎牛血清的DMEM离心2遍,按12×10~4/cm~2密度接种,于37 ℃、体积分数为5%的CO_2培养箱内培养.细胞传代后,加入含地塞米松、β-磷酸甘油钠、L-2-磷酸抗坏血酸的DMEM成骨条件培养液进行诱导.免疫细胞化学染色和免疫荧光染色检测成骨细胞特征性分泌蛋白骨钙素、骨桥蛋白的表达,以及Ⅰ型胶原的表达,并进行碱性磷酸酶染色与茜素红染色.结果与结论:1.077 g/mL Ficoll液密度梯度离心法分离所得的有核细胞层相对于Percoll液分层明显,可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,接种细胞生长良好,平均倍增时间为24 h.犬骨髓间充质干细胞体外成骨诱导培养后,骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原均呈阳性表达,碱性磷酸酶染色后细胞胞浆呈蓝绿色,茜素红染色后细胞外基质中出现散在的红色结节,可在体外定向分化为成骨细胞.     

大鼠成牙骨质细胞的体外培养及其生物学特性

目的:探讨体外培养和鉴定源于大鼠磨牙牙骨质的成牙骨质细胞(Cementoblast,CMB)的可行性,观察培养状态下CMB的形态与功能,就其是否能分泌碱性磷酸酶(Alkalinephoshatseactive-ity,ALP)、骨钙素的生物学特性进行初步研究,以期建立能排除牙周其他细胞干扰的CMB体外实验模型。方法:使用组织块结合酶消化的二步法,分别培养来自牙骨质的CMB,来自牙槽骨的成骨细胞和来自牙周韧带的成纤维细胞。然后对所培养的细胞分别进行骨钙素免疫组化染色和ALP活力测定,并利用茜素红S,检测在条件培养基下细胞形成矿化结节的情况。结果:3种牙周细胞都可从约12周大鼠第一磨牙根周获得进行原代培养。骨钙素在体外培养的CMB和成骨细胞中被强烈表达,在牙周韧带成纤维细胞中几乎不表达。成骨细胞ALP活性最强,在成纤维细胞中适中,在CMB中几乎无活性。CMB形成矿化结节茜素红S染色阳性。结论:CMB可以在体外成功培养,并可与牙槽骨成骨细胞、牙周韧带的成纤维细胞相区别。